High-speed videomicroscopie-analyse voor eerstelijnsdiagnose van primaire ciliaire dyskinesie
19 januari 2022
Snelle videomicroscopie-analyse is een relatief eenvoudig uit te voeren, snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, een aanzienlijk betrouwbaar hulpmiddel voor eerstelijnsdiagnostiek van primaire ciliaire dyskinesie, dat beschikbaar zou moeten zijn in elk centrum dat betrokken is bij diagnostiek en de behandeling van ernstige longziekten.
Hoge snelheid Video microscopie analyse is een betrouwbaar hulpmiddel voor de eerste lijn diagnose van primaire ciliaire dyskinesie. Deze techniek is relatief eenvoudig uit te voeren, snel, kosteneffectief en in ervaren handen anders een zeer betrouwbaar hulpmiddel. En het is van toepassing op patiënten van alle leeftijdsgroepen.
Videomicroscopie onthult ook de secundaire ciliaire functie. Zoals bijvoorbeeld door bacteriële of virale infecties. Maar het is voornamelijk gebruikt om primaire ciliaire dyskinesie te diagnosticeren.
Wetenschappers gebruiken deze methode ook om intracellulaire processen of biologische functies in levende cellen te visualiseren. Ik word bij deze procedure bijgestaan door mevrouw Tina Peromaa, onze laborant.
Voordat u de respiratoire epitheelcellen verzamelt, vraagt u de patiënt om zijn neus grondig te snuiten. Wanneer de patiënt klaar is, houdt u het hoofd van de patiënt met één hand gefixeerd en gebruikt u een interdentale borstel van 0,6 millimeter groot in de andere hand om het inferieure turbinaat van het neusgat te borstelen om voldoende epitheelcelstrips te verzamelen. Laat de geoogste celreepjes vallen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met daarin de door de cel gevoede DMEM.
Na het sluiten van het deksel van de microcentrifugebuis houdt u de buis tegen de lichtbron en schudt u de buis om geoogste celstroken en conglomeraten te ontdekken. Plaats later de microcentrifugebuizen met de deksels goed gesloten in een polystyreendoos. Voordat u de doos goed sluit, moet u ervoor zorgen dat de buizen in de doos zijn bevestigd.
Voeg vervolgens een cold pack toe aan de doos terwijl u voorkomt dat het monster invriest. Na het verwijderen van de microcentrifugebuizen met de monsters uit de polystyreendoos, plaatst u één buis onder een kap van de microscoopverwarmingseenheid om op te warmen tot 37 graden Celsius voor de hoge snelheid videomicroscopieanalyse of HSVMA. Start vervolgens de camera en de software van de video-eenheid op de computer.
Gebruik een pipet om een klein monster te nemen en plaats twee druppels van het monster in een cuvette. Bedek de cuvette met een deksel voordat je hem onder de microscoop legt. Gebruik een olie-onderdompelingslens met een vergroting van 100x en breng een druppel onderdompelingsolie op het oppervlak van de optiek.
Terwijl u de bodem van de schaal nadert met de microscooplens, zoekt u naar de celclusters zonder rode bloedcellen en met een laag slijmgehalte. Na het vinden van een representatieve interesseregio, of ROI, richt u zich op één groep van de kloppende trilharen met de grootste trilharenbewegingen en neemt u een videosequentie op. Noteer de cellen met kloppende trilharen zijsgewijs en van bovenaf.
De representatieve analyse toont normale trilharenbewegingen die zijwaarts en van bovenaf worden gezien. Het monster van een primaire ciliaire dyskinesie, of PCD-patiënt, met een mutatie in het DNAH11-gen toonde het klassieke stijve minimaal bewegende patroon van ciliaire beat. Van opzij en van boven bekeken.
Bij een andere PCD-patiënt met dezelfde mutatie werd een ander hyperkinetisch maar inefficiënt patroon van de kloppende trilharen waargenomen. Een pathologisch ciliair slagpatroon en ciliaire slagfrequentie werden ook gezien bij een patiënt met terugkerende infecties van de bovenste luchtwegen. Als de poetsprocedure rigoureus wordt uitgevoerd, kan de HSVMA-analyse niet worden uitgevoerd omdat trilhaarcellen bedekt waren met een coating van rode bloedcellen.
De belangrijkste stap in de procedure is om voldoende ademhalingscellen uit de borstels te halen en dit materiaal goed te bewaren voor de video-analyse. Resterend materiaal kan worden gebruikt om elektronenmicroscopie of immunoflourescense-microscopie uit te voeren om mogelijke structurele defecten in trilharen te detecteren of om defecten en de synthese van ciliaire eiwitten te onthullen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Analyse via hogesnelheidsvideomicroscopie is een betrouwbare en kosteneffectieve methode voor het diagnosticeren van primaire ciliaire dyskinesie. Het is eenvoudig uit te voeren en toepasbaar op alle leeftijdsgroepen, waardoor het essentieel is voor centra die ernstige longziekten behandelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Respiratoire Geneeskunde
- Diagnostische Technieken
Achtergrond
- Primaire ciliaire dyskinesie is een aandoening die de ciliaire functie beïnvloedt.
- Hogesnelheidsvideomicroscopie kan zowel de primaire als de secundaire ciliaire functie onthullen.
- Deze techniek is bijzonder nuttig voor het diagnosticeren van respiratoire problemen die verband houden met ciliaire dysfunctie.
- Het is belangrijk dat clinici toegang hebben tot betrouwbare diagnostische instrumenten.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van high-speed videomicroscopie bij het diagnosticeren van primaire ciliaire dyskinesie te evalueren.
- Om de toepasbaarheid van deze techniek binnen verschillende patiëntleeftijdsgroepen te beoordelen.
- Om het belang van dit diagnostische instrument in klinische settings te benadrukken.
Gebruikte methoden
- High-speed videomicroscopie-analyse.
- Evaluatie van de ciliaire beweging en functie.
- Vergelijking van resultaten over diverse patiëntdemografieën.
- Beoordeling van de secundaire ciliaire functie in relatie tot infecties.
Belangrijkste resultaten
- High-speed videomicroscopie is effectief voor het diagnosticeren van primaire ciliaire dyskinesie.
- De techniek is betrouwbaar wanneer deze wordt uitgevoerd door ervaren personeel.
- Het biedt inzicht in de secundaire ciliaire functie.
- Toepasbaar op patiënten van alle leeftijden, wat het nut in de klinische praktijk vergroot.
Conclusies
- Hogesnelheidsvideomicroscopie zou een standaard diagnostisch instrument moeten zijn in de respiratoire geneeskunde.
- Het gebruiksgemak en de betrouwbaarheid maken het geschikt voor eerstelijnsdiagnostiek.
- Een brede beschikbaarheid kan de uitkomsten verbeteren voor patiënten met ernstige longziekten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Analyse via hogesnelheidsvideomicroscopie (HSVMA) biedt een snelle en kosteneffectieve methode voor de eerstelijnsdiagnostiek van primaire ciliaire dyskinesie (PCD), een zeldzame genetische aandoening die de mucociliaire klaring beïnvloedt. Door directe visualisatie van ciliaire slagpatronen in levende respiratoire epitheelcellen mogelijk te maken, ondersteunt HSVMA vroege detectie en vermindert het de afhankelijkheid van meer arbeidsintensieve technieken zoals transmissie-elektronenmicroscopie. Deze mogelijkheid verhoogt de diagnostische doorvoer in pulmonologische centra en centra voor zeldzame ziekten, wat tijdige interventie faciliteert en langetermijncomplicaties aan de longen vermindert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele beoordeling van de ciliaire motiliteit in patiëntafgeleide cellen mogelijk, wat target-validatie in onderzoek naar ciliopathieën ondersteunt.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare uitlezing voor het evalueren van genetische of farmacologische interventies op de ciliaire functie.
- Voorspellende waarde: Maakt onderscheid tussen structurele en functionele defecten, waardoor het vertrouwen in mechanistische hypothesen wordt vergroot.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve gegevens over de ciliaire slagfrequentie en golfvorm voor standaardisatie van de assay.
- Operationele waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen voor live-cell imaging in modellen voor respiratoire aandoeningen.
- Schaalbaarheid: Maakt high-content analyse van ciliaire dynamiek mogelijk over meerdere patiëntenmonsters of genetische varianten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en klinische fenotypes door HSVMA-outputs te correleren met de ernst van de ziekte.
- Mechanistische risicoreductie: Identificeert functioneel herstel in preklinische modellen door het herstel van de normale ciliaire slag.
- Afstemming van biomarkers: Biedt functionele read-outs die complementair zijn aan structurele of moleculaire biomarkers bij PCD.
Integratie van Pipeline & Workflow
HSVMA past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische evaluatie en biedt een functionele assay voor de ontwikkeling van ciliaire therapeutica.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothese-testen op genen die betrokken zijn bij de assemblage en motiliteit van cilia, zoals DNAH11.
- Screening: Levert kwantitatieve real-time read-outs die geschikt zijn voor compound-screening in ciliopathie-modellen.
- Analyses: Maakt statistische vergelijking van ciliaire slagparameters tussen verschillende condities mogelijk, wat datagestuurde beslissingen ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt cellulaire fenotypes met klinische resultaten, wat helpt bij de transitie van preklinisch naar klinisch onderzoek.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van de ciliaire functie in diverse modellen van respiratoire ziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door directe visualisatie van ciliaire dynamiek in native cellulaire contexten te bieden.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde protocollen voor bemonstering, conservering en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie door de functionele relevantie van genetische hits te bevestigen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van ciliopathie-targets mogelijk op basis van bewijs voor functioneel herstel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celverzameling, microscopiebediening en videoanalyse voor een nauwkeurige interpretatie.
- Afhankelijk van high-speed videomicroscopiesystemen met olie-immersieoptiek en omgevingscontrole.
- Vereist gestandaardiseerde procedures voor monsterbehandeling om contaminatie of degradatie te voorkomen.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan optimalisatie van kweekcondities en beeldparameters vereisen.
- Beperkt door de noodzaak van levensvatbare, niet-gecontamineerde epitheelmonsters; de aanwezigheid van rode bloedcellen of slijm kan de analyse belemmeren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
