Inductie van darmontsteking door adoptieve overdracht van CBir1 TCR transgene CD4 ⁺ T-cellen naar immunodeficiënte muizen

Inflammatoire darmziekte, of IBD, legt een aanzienlijke gezondheids- en financiële last op individuen en de samenleving. Dit colitismodel is nuttig om de mechanismen van IBD te bestuderen en de behandelingen voor IBD te evalueren. Dit immunodominante Cbir flagellin T-cel-specifieke adoptieve transfer colitis model geeft inzicht in hoe darmbacteriën antigeen T-cel reacties induceert om colitis te induceren.

Maak na het euthanaseren van de muis een linker buikincisie van ongeveer een centimeter en trek de huid weg van het buikspierweefsel. Maak vervolgens een incisie van ongeveer drie centimeter in het buikspierweefsel. Verwijder vervolgens de milt met een steriele schaar en tang.

Leg de milt in een kweekschaal met vijf milliliter voorgekoelde wasbuffer. Maal de milt met het ruwe oppervlak van twee steriele glasglijbanen. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 50 milliliter door deze door een celzeef van 100 micrometer te laten gaan.

Spoel de glazen glaasjes en kweekschaal af met vijf milliliter voorgekoelde wasbuffer en breng de wasbuffer over in de buis. Centrifugeer de celsuspensie, gooi het supernatant weg en suspend de cellen opnieuw met vijf milliliter voorgewarmde Tris ammoniumchloride lysisbuffer per milt. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg 10 milliliter voorgekoelde wasbuffer toe aan de buis. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie, gooi het supernatant weg en resuspend de cellen met 10 milliliter voorgekoelde isolatiebuffer. Om de cellen te tellen, mengt u 10 microliter elk van de celsuspensie en Trypan blauw grondig en laadt u 10 microliter op een dia.

Plaats vervolgens de dia in de geautomatiseerde celteller om het levensvatbare celnummer te verkrijgen. Centrifugeer de resterende celsuspensie en gooi alle supernatant weg. Vortex de anti-muis CD4 magnetische deeltjes, voeg direct 50 microliter van de deeltjes per 10 miljoen cellen toe en meng grondig met celkorrels.

Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Breng de celdeeltjessuspensie over in een steriele opvangbuis. Voeg 3,5 milliliter voorgekoelde isolatiebuffer toe aan de buis.

Plaats de buis gedurende acht minuten op de celscheidingsmagneet bij kamertemperatuur. Adem vervolgens voorzichtig het supernatant af met een transferpipet van drie milliliter. Verwijder de buis uit de celscheidingsmagneet.

Breng de cellen vervolgens opnieuw op met 3,5 milliliter voorgekoelde isolatiebuffer en plaats de buis gedurende vier minuten op kamertemperatuur op de magneet. Aspirateer het supernatant voorzichtig met een pipet van drie milliliter. Ten slotte resuspendeert u de cellen in één milliliter voorgekoelde FACS-buffer.

Om de cellen over te brengen naar de ontvangende muizen, resuspend de Cbir1 TCR transgeen-naïeve CD4-positieve T-cellen tot 5 miljoen cellen per milliliter in 1x PBS. Verwarm de muizen onder een warmtelamp en houd de muizen in bedwang met behulp van een muisstabilisator. Injecteer intraveneus 200 microliter van de celsuspensie in de staartader van de muizen.

Maak na het euthanaseren van de muis een ventrale middellijnhuidincisie van ongeveer één centimeter. Trek de huid weg van het buikspierweefsel. Maak vervolgens een incisie van drie centimeter in het buikspierweefsel.

Identificeer vervolgens het coecum en verwijder de hele dikke darm met een steriele schaar en tang. Maak de dikke darm nat met voorgekoelde PBS in een kweekschaal. Snijd de dikke darm in de lengterichting in en spoel deze af met voorgekoeld PBS.

Snijd 1/3 van de dikke darm in de lengterichting. Leg de dubbele darmstrook in een papieren handdoek met de lumenale zijde naar boven gericht. Voer Swiss-rolling uit met behulp van een tandenstoker.

Plaats de dikke darm Swiss in een cassette en plaats de cassette gedurende 24 uur in 10% gebufferde formaline. Droog uit en paraffine-embed de dikke darm met een geautomatiseerde processor. Snijd vervolgens weefselsecties van vijf micrometer op een microtoom.

Monteer het weefsel op dia's en voer hematoxyline- en eosinekleuring uit. De Rag knockout muizen begonnen gewicht te verliezen ongeveer drie weken na de celoverdracht, en hun gewicht bereikte ongeveer 80 tot 85% van hun oorspronkelijke gewicht zes weken na de celoverdracht. Ontvangende muizen vertoonden een korte colonlengte zes weken na de celoverdracht.

De ontvangende muizen vertoonden vier weken na de celoverdracht meer celinfiltratie in de intestinale lamina propria. Ze toonden gobletcelverlies en intestinale epitheelcelhyperplasie vijf weken na celoverdracht, evenals mucosale erosie en ontstekingscelinfiltratie in de submucosa van de dikke darm zes weken na celoverdracht. De histopathologische scores namen aanzienlijk toe van vier tot zes weken.

Tegelijkertijd was er geen ontsteking bij Rag knock-out muizen die alleen PBS kregen. Met behulp van deze procedure konden coloncytokineniveaus worden bepaald door ELISA en qPCR.