Het kweken van lymfocyten in gesimuleerde microzwaartekracht met behulp van een roterend celkweeksysteem

Deze techniek stelt ons in staat om de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht op immuuncellen te bestuderen om ons te helpen beter te begrijpen hoe aspecten van de ruimteomgeving de menselijke fysiologie op moleculair niveau beïnvloeden. Deze techniek is economisch haalbaar en is relatief eenvoudig op te zetten en te onderhouden in vergelijking met het sturen van celcultuur naar de ruimte of andere methoden om celcultuur te onderwerpen aan gesimuleerde microzwaartekracht op aarde. Het wordt aanbevolen om langzaam te gaan tijdens het vullen van de vaten om overloop en morsen te voorkomen.

Zorg er na het verwijderen van de eerste bubbel voor dat de vaten volledig vol zijn door de spuiten te gebruiken. Dit minimaliseert de kans op grote bubbelvorming tijdens de behandeling. Begin met het verwijderen van de kweekvaten uit de plastic verpakking.

Label elk vat op de rand op basis van het celtype of de lijn die wordt gebruikt, of het nu in de controle of behandeling is en andere relevante informatie. Stabiliseer het vat en open de vulpoort voorzichtig zonder de dop van de vulpoort of de O-ring aan te raken. Plaats de dop op een ethanolpad met de pen of O-ring naar boven gericht terwijl het vat is gevuld.

Verwijder de doppen niet van de spuitpoorten. Laad het vat met 10 ml van de juiste volledige media voor de celkweek met behulp van een steriel serologisch pipet en plaats de dop voorzichtig op de vulpoort. Zorg ervoor dat de doppen van de spuitpoort en de vulpoort goed gesloten zijn.

Plaats vervolgens de gevulde vaten in een incubator terwijl u de volgende stappen uitvoert om de vaten voor te bereiden op celkweek. Haal de media geprimeerde vaten uit de incubator. Voor een kolfregeling laadt u een T25-suspensiekweekkolf met 10 ml celkweek uit de hierboven bereide voorraad.

Voeg 10 ml stamcelcultuur toe aan een aparte conische buis van 15 ml, die zal worden gebruikt om de spuiten te laden. Schroef de doppen van de spuitpoort los om ze uit het vat te verwijderen en zorg ervoor dat de voorraadstopkranen in de open positie staan. Stabiliseer het vat en open de vulpoort voorzichtig zonder de dop van de vulpoort of de O-ring aan te raken.

Plaats de dop op een ethanolpad met de pen of O-ring naar boven gericht terwijl het vat wordt gevuld. Zorg ervoor dat de stopkranen in de open stand staan. Het vat kan worden geleegd door de media uit het vat in een afvalcontainer te gieten met behulp van een serologische pipet.

U kunt de media ook opzuigen met een steriel glas langs uw pipet die aan een vacuümsysteem is bevestigd. Zorg er tijdens het gebruik van een pipet of het vacuümsysteem voor dat u het oxygenatiemembraan niet aanraakt, omdat dit het kan beschadigen en het vat onbruikbaar kan maken. Sluit de conische buis van 50 ml met de bereide stamcelcultuur goed af en keer deze een paar keer voorzichtig om om de inhoud grondig te mengen.

Trek 10 ml celkweekbouillon uit de buis van 50 ml met een verse steriele serologisch pipet. Pak het vat op en kantel het, zodat de vulpoort naar boven is. Doseer vervolgens voorzichtig de celkweekvoorraad in het vat via de vulpoort.

Vul het vat tot aan de punt van de vulpoort, terwijl u het vat weer naar beneden kantelt om morsen te voorkomen. Zorg ervoor dat u het oxygenatiemembraan niet aanraakt met de pipet, omdat deze erg kwetsbaar is. Zodra het vat is geladen, plaatst u de dop van de vulpoort voorzichtig terug zonder de O-ring aan te raken.

Verwijder de eerste spuit van 3 ml uit de verpakking en pomp deze een paar keer om deze los te maken. Bevestig vervolgens de spuit aan een van de spuitpoorten en zorg ervoor dat de spuit volledig wordt ingedrukt. Sluit de conische buis van 15 ml met 10 ml aliquote celcultuur goed af en keer deze een paar keer voorzichtig om om de inhoud grondig te mengen.

Verwijder op dezelfde manier de tweede spuit van 3 ml uit de verpakking en pomp deze een paar keer af. Vervolgens deze spuit voorzichtig half ondergedompeld in de celkweek uit de 15 ml conische buis en wat cultuur opzuigen. Minimaliseer luchtbellen door de spuit volledig terug in de buis te doseren en 3 ml cultuur op te zuigen.

Bevestig de gevulde spuit aan de resterende spuitpoort en ontsmet de spuiten en rond de vulpoort zorgvuldig met een ethanolpad. Krijg geen ethanol op het oxygenatiemembraan. Herhaal het proces voor de resterende vaten.

Als er een iets onvoldoende celcultuur overblijft in de conische buis van 50 ml voor het laatste vat, haal dan de resterende hoeveelheid terug uit de conische buis van 15 ml die wordt gebruikt om de spuiten te laden. Zorg ervoor dat de stopkranen van de spuitpoort gesloten zijn om de migratie van cellen en bubbels van de spuiten naar de vaten te beperken. Draai het vat ondersteboven en sla het een paar keer opzij om de eerste bubbels te verzamelen.

Draai het vat snel terug naar boven en dan in een lichte hoek naar buiten, zodat de bellen allemaal naar de opwaartse kant van het vat drijven. Manoeuvreer de bubbels onder de poort met de lege spuit en kijk hoe ze de poort beginnen binnen te komen. Open beide stopkranen van de spuitpoort.

Sla zachtjes op het vat om de bubbels aan te moedigen om in de lege spuit te drijven. Zuig langzaam de grotere bubbels op met de lege spuit terwijl u de volle spuit voorzichtig indrukt om de druk in het vat te behouden, zodat het oxygenatiemembraan niet barst. Herhaal dit proces een paar keer om ervoor te zorgen dat alle bubbels worden verwijderd.

Wanneer de bubbels effectief zijn verwijderd, sluit u de stopkranen van de spuitpoort. Houd de spuiten tijdens de behandeling aan om de daaropvolgende bubbel te kunnen verwijderen en zorg ervoor dat het volume in beide spuiten ongeveer gelijk is. Veeg het oppervlak van de roterende basis en lintkabel voorzichtig af met 70% ethanol.

Zorg ervoor dat de lintkabel is aangesloten op de voeding. Plaats de roterende basis in de incubator en bevestig de lintkabel aan de basis. Plaats de voeding dichtbij, maar buiten de incubator.

Bevestig het SMG-behandelingsvat door de vaatdraden op de roterende pen te zetten en de roterende pen op de basis voorzichtig tegen de klok in te draaien. Zorg ervoor dat het vat stevig is bevestigd. Houd de incubator op ongeveer 100% luchtvochtigheid door de waterbak te vullen met autoclaaf RO-water.

Pas de rotatiesnelheid van de incubator aan de sedimentatiesnelheid van de cellen aan, zodat de cellen niet door de media vallen. Controleer op de eerste dag van het opzetten van de behandeling om de paar uur op bubbelvorming zoals beschreven in het tekstmanuscript. Verwijder de bubbels minstens één keer per dag tot het einde van de gewenste behandelingsduur.

Zodra de geplande behandelingslengte is verstreken, stopt u de rotatie en demonteert u het apparaat. Verwijder het behandelingsvat door het vat voorzichtig stil te houden terwijl u de roterende pen van het apparaat met de klok mee draait. Breng de regelkolf, de controle en het behandelde vat in een steriele biologische veiligheidskast.

Neem elk vat met uitzondering van de regelkolf en draai het om, zodat het naar beneden is gericht. Sla er vervolgens zachtjes op om alle cellen in suspensie te brengen. Draai vervolgens het vat op zijn kant met de vulpoort naar de bodem en sla het opnieuw om de cellen naar de vulpoort te leiden voor efficiënte aspiratie.

Behandel elk schip afzonderlijk. Schroef de spuiten los van de twee poorten en doseer ze in het biogevaarlijke afval. Open de stopkranen op de spuitpoorten.

Verwijder voorzichtig de dop van de vulpoort en zuig de inhoud op met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml, waarbij u het vat kantelt terwijl het wordt geleegd. Doseer de inhoud van alle controle- en behandelingsgroepen in individueel gelabelde conische buisjes van 15 ml. Sluit elke buis en keer ze een paar keer voorzichtig om om ervoor te zorgen dat ze goed gemengd zijn.

Gebruik de voorkeursmethode voor het bepalen van de concentratie en levensvatbaarheid van de resulterende celcultuur om u voor te bereiden op latere experimentele tests. De NK-92 cellijn start levensvatbaarheid en zitdichtheden werden vergeleken met de resulterende einde levensvatbaarheid en eindconcentraties. Na een SMG-behandeling van 72 uur werden twee gevallen van negatieve en positieve uitkomsten vergeleken.

Ter vergelijking: het optimale concentratiebereik van de gebruikte NK-92-cellijn lag tussen 0,3 en 1,2 miljoen cellen per milliliter met een verdubbelingstijd van ongeveer twee tot drie dagen. De proliferatie in de SMG-behandelingsgroep was ongeveer gelijk in de controle- en behandelingsgroepen. Deze parameters waren essentieel voor het downstream experimentele succes en de resulterende cellen uit de twee controlegroepen presteerden op dezelfde manier in downstream experimentele assays.

Het is van cruciaal belang om de vorming van bellen tijdens de behandeling te controleren en te verantwoorden, vooral in de celcultuur die wordt onderworpen aan gesimuleerde microzwaartekracht. Grote bubbelvorming kan verstoring van de vloeistofdynamica in het vat veroorzaken, en dit zal in wezen de gesimuleerde microzwaartekrachtconditie tenietdoen.