Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

Dit geoptimaliseerde protocol verbeterde de generatie van pancreas bètacelvoorlopers uit menselijke pluripotente stamcellen, die kunnen worden gebruikt voor celtherapie voor diabetes en het onderzoeken van moleculaire mechanismen die de biogenese van diabetes onderstrepen. Dit is een haalbare techniek omdat het wordt gebruikt voor 2D-monolaagculturen. Het is gemakkelijk aan te brengen en is consistent over meerdere controle- en patiënt-afgeleide pluripotente stamcellijnen.

Deze bètacelprecursoren kunnen bij een diabetespatiënt rijpen tot insuline afscheidende bètacellen en kunnen mogelijk hyperglykemie omkeren. Daarom kunnen de verhoogde percentages pancreasvoorlopers die met behulp van ons protocol worden gegenereerd, worden gebruikt voor celtherapie voor diabetes. Dit verbeterde protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van de vroege ontwikkeling van de menselijke alvleesklier bij gezonde personen en bij diabetespatiënten, wat een uitdaging is vanwege een tekort aan weefselmonsters.

Wanneer de menselijke pluripotente stamcel- of hPSC-kolonies 70 tot 80% samenvloeiing hebben bereikt, was ze dan twee keer met warme PBS in de weefselkweekkap. Aspirateer vervolgens de buffer met behulp van een draagbare vacuümaspirator. Voeg vervolgens fase één differentiatiemedium met CHIR-99021 toe aan de kolonies en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.

Vervang de volgende dag de gebruikte media door fase één differentiatiemedium zonder CHIR-99021. Nadat u het gebruikte medium hebt opgezogen en de definitieve endodermcellen twee keer met warme PBS hebt gewassen, wervelt u de plaat om eventuele celresten te verwijderen. Bevestig vervolgens de cellen door 4% paraformaldehyde toe te voegen en plaats de plaat op een tweedimensionale schudder.

Was na fixatie de cellen met TRIS-gebufferde zoutoplossing met 0,5% Tween en plaats de plaat op de shaker. Permeabiliseer vervolgens de vaste cellen door een royale hoeveelheid PBS toe te voegen die 0,5% Triton X-100 bevat en plaats de plaat terug op de shaker. Voeg vervolgens vers bereide blokkerende buffer toe aan de gepermeabiliseerde cellen en incubeer de plaat gedurende een uur op de shaker.

Voeg vervolgens verdunde primaire antilichamen toe aan de geblokkeerde cellen en plaats de plaat op de shaker op vier graden Celsius met zacht schudden. De volgende dag na het aanzuigen van de primaire antilichaamoplossing, wast u de putjes drie keer met TBST gedurende 10 minuten elk op de shaker. Voeg vervolgens de secundaire antilichamen toe.

Bedek de plaat met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht en plaats de plaat een uur lang op kamertemperatuur op de shaker. Zuig vervolgens de secundaire antilichaamoplossing op en was de gekleurde putjes met TBST op de shaker gedurende 10 minuten, waarbij de plaat bedekt blijft met folie. Voeg vervolgens, om de kernen te beitsen, Hoechst-oplossing toe aan de putten en plaats de plaat op de shaker.

Na twee tot drie minuten aspirateer de Hoechst-oplossing en spoel de putjes twee keer met PBS. Voeg ten slotte PBS toe aan de gekleurde cellen en beeld ze af met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop in het donker. Dissocieer op dag één van fase twee de hPSC-afgeleide endodermale cellen door ze eerst te wassen met warme PBS en vervolgens één milliliter warme enzymoplossing toe te voegen per put van een zes putplaat.

Plaats de plaat op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende drie tot vijf minuten of totdat de cellen van elkaar beginnen los te komen. Dissociëer de losgemaakte platen of monolaag van cellen in de putten en verzamel de losgemaakte cellen samen in een polypropyleenbuis van 15 milliliter met behulp van basale stadiumhalfmedia. Draai vervolgens de cellen naar beneden, gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet met één milliliter steriel PBS.

Nadat u de cellen hebt geteld met behulp van een geautomatiseerde teller, draait u de cellen opnieuw en gooit u het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de pellet in het juiste volume van fase twee differentiatiemedium dat een rockremmer bevat. Plaats de geresuspendeerde cellen op één tot 50 membraanmatrix gecoate platen en incubeer ze bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Vervang na 24 uur het medium door stadium twee differentiatiemedium zonder de Rock-remmer. Aan het einde van fase vier, maak cellen los zoals eerder aangetoond en verzamel ze in een buis van 15 milliliter. Draai vervolgens de cellen, gooi het supernatant weg, was de cellen met PBS en dissocieer ze in afzonderlijke cellen.

Nadat u de cellen hebt geteld met behulp van een geautomatiseerde celteller, draait u de cellen opnieuw en resuspendeert u de pellet in 200 microliter gekoelde PBS. Voeg vervolgens twee milliliter gekoelde 80% ethanol druppelsgewijs toe met de buis op een vortex die laag tot gemiddeld is ingesteld. Sluit de dop goed en plaats de buis een nacht licht gekanteld op de shaker bij vier graden Celsius.

De volgende dag draait u de cellen en wast u de pellet met PBS om eventuele klonten vaste cellen te dissociëren. Blokkeer vervolgens de vaste cellen gedurende ten minste een uur bij kamertemperatuur of vier graden Celsius 's nachts op de shaker. Vervolgens, om te kleuren voor de pancreasvoorlopermarkers, verdeel 200.000 cellen per aandoening, inclusief geschikte isotypecontroles, niet-gekleurde en secundaire antilichaamcontroles in een 96 well V-bodemplaat.

Draai vervolgens de plaat kort rond en draai de plaat met een snelle beweging om het supernatant weg te gooien zonder de pellets te verliezen. Incubeer vervolgens de cellen in primaire antilichamen gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur op een shaker met zacht schudden. Was vervolgens de gekleurde cellen drie keer met TBST door op en neer te pipetteren in de putten.

Centrifugeer de cellen opnieuw, gooi het supernatant weg en voeg secundaire antilichamen toe aan de cellen. Na een incubatietijd van 30 minuten bij kamertemperatuur, wast u de gekleurde cellen tweemaal met TBST. Draai vervolgens de plaat, verzamel de gekleurde cellen in 100 microliter PBS in lichtbeveiligde faxbuizen en voer de monsters uit op een flowcytometriemachine.

In vergelijking met de niet-geoptimaliseerde methode verbeterde het geoptimaliseerde protocol de efficiëntie van pancreasvoorloperdifferentiatie door PDX 1 en NKX 6.1 co-expressie te upreguleren. In het bijzonder verbeterde de disassociatie van endodermale cellen en hun replating op verse membraanmatrix, samen met een langere duur van stadium drie, NKX 6.1-expressie in hPSC-afgeleide pancreasvoorlopercellen in vergelijking met het niet-gedissocieerde protocol. Pancreasvoorlopercellen gegenereerd met behulp van het geoptimaliseerde protocol verhoogden ook het aantal SOX9-positieve cellen in vergelijking met de niet-gedissocieerde methode.

Verder genereerde de geoptimaliseerde methode ook een hoger percentage proliferatieve NKX 6.1 positieve cellen die de proliferatiemarker Ki67 co-expressie brachten. Om de efficiëntie te verbeteren, is het cruciaal om het hba1-afgeleide endoderm te dissociëren en vervolgens de duur van fase drie-behandeling te verlengen met FGF-amyloïde signalering en egelremming. Schaalbare generatie van pancreasvoorlopercellen met behulp van dit verbeterde protocol heeft studies vergemakkelijkt over het verbeteren van de efficiëntie en rijping van menselijke pluripotente stamcel afgeleide bètacellen van de pancreas en maakte modellering van verschillende soorten diabetes mogelijk.