Name: Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Leer miRNA-afgifte aan de nier met polyethylenimine nanodeeltjes in muismodellen voor nierziekten. Deze methode bereikt overexpressie van doel-miRNA zonder interferonrespons en remt ziekteprogressie effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Wij danken Edanz (https://jp.edanz.com/ac) voor het redigeren van kladversies van dit manuscript.

Alle dierexperimentele protocollen werden goedgekeurd door de dierethische commissie van de Jichi Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor gebruik en verzorging van proefdieren uit de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Hier toonden we miRNA-nabootsing van toediening aan de nier aan, wat resulteerde in overexpressie met behulp van UUO-muizen. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Jichi Medical University [Goedkeuring nrs. 19-12 voor nierfibrose, 17-024 voor acute nierinfectie (AKI) en 19-11 voor diabetische nefropathie].
1. Bereiding van PEI-NPs-miRNA-mimic complex
OPMERKING: Hier worden de bereiding van PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 en PEI-NPs-control-miRNA (als een negatieve controle) beschreven voor één muis.
<ol><li>Bereid de volgende items voor:<ol><li>Bereid 10 μL lineaire PEI-NP's voor.</li>
		<li>Bereid 50 μL kunstmatig gesynthetiseerde miRNA's opgelost in nucleasevrij water in een concentratie van 100 μM (5 nmol miRNA opgelost in 50 μL nucleasevrij water).</li>
		<li>Bereid 50 μL kunstmatig gesynthetiseerde controle (niet-doel) miRNA's opgelost in nucleasevrij water in een concentratie van 100 μM (5 nmol miRNA opgelost in 50 μL nucleasevrij water).</li>
		<li>Bereid 5% en 10% glucose-oplossingen. Zorg voor de beschikbaarheid van 1,5 ml microcentrifugebuizen en een vortexmixer.</li>
	</ol></li>
	<li>Los 10 μL PEI-NP's op in 90 μL 5% glucoseoplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.</li>
	<li>Meng 50 μL kunstmatig gesynthetiseerde miRNA's (5 nmol) opgelost in nucleasevrij water (100 μM-concentratie) met 50 μM 10% glucoseoplossing in microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden. Dit proces levert miRNA opgelost in 5% glucose-oplossing.</li>
	<li>Meng 100 μL PEI-NP's in 5% glucoseoplossing en 100 μL miRNA-mimiek (5 nmol) in 5% glucose-oplossing. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.</li>
	<li>Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) om een stabiel complex van PEI-NPs-miRNA-mimic te bereiden. Deze oplossing bevat PEI-NP's en miRNA-mimiek (5 nmol) in een verhouding van stikstof (N) in het polymeer tot fosfaat (P) in nucleïnezuren (N/P-verhouding) = 6 (figuur 1). OPMERKING: PEI-NPs-control-miRNA-complex kan worden bereid met behulp van hetzelfde proces dat wordt beschreven in stappen 1.1-1.5 voor alle nierziektemuizenmodellen die in dit manuscript worden beschreven (UUO, diabetische nefropathie en AKI). Eén injectievolume PEI-NP-miRNAs-mimic is hetzelfde als 5 nmol miRNA's-mimic geconjugeerd met PEI-NP's bij N/P-verhouding = 6. De injectieduur en frequentie van elke PEI-NP-miRNAs-mimic hangt af van het ziektemodel waarin het wordt toegepast.</li>
</ol>2. Bevestiging van significante afgifte van miRNA-nabootsing aan de nier bij UUO-muizen door PEI-NP via staartaderinjectie met behulp van fluorescerende microscopie
OPMERKING: Hier wordt de toedieningsmethode van kunstmatig gezuiverde miRNA-nabootsing aan de nier uitgewerkt, wat wijst op de vaststelling van therapeutische methoden voor verschillende nierziekten. Kortom, UUO-muizen kregen cyanine3-carbonzuur (Cy3) -gelabelde miRNA-mimiek toegediend, toegevoegd aan 100 μL PEI-NP's via de staartader. De levering aan de nieren werd bevestigd met fluorescentiemicroscopie. PEI-NPs-cyanine3 carbonzuur (Cy3)-gelabelde miRNA-mimiek (oligonucleotiden) voor één muis wordt beschreven. Deze methode kan miRNA-nabootsing aanzienlijk leveren aan de nier in verschillende muismodellen, zoals UUO-muizen, diabetische nierziektemuizen en AKI-muizen geproduceerd door IRI. Hier gebruikten we een UUO-muismodel voor de videodemonstratie. De inductiemethode van UUO is eerder elders beschreven13. Volg deze protocollen binnen zes dagen na de UUO-operatie.
<ol><li>Bereid de volgende items voor:<ol><li>Bereid 2 μL PEI-NP's en 100 μL Cy3-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotiden [Cy3-gelabelde miRNA-mimic (1 nmol; 10 μM)].</li>
		<li>Bereid 5% en 10% glucose-oplossingen. Zorg voor de beschikbaarheid van 1,5 ml microcentrifugebuizen en een vortexmixer.</li>
		<li>Gebruik een plastic centrifugebuis van 50 ml met een klein gaatje in de dop om de staartaders van UUO-muizen te isoleren.</li>
		<li>Bereid voor fluorescentiemicroscopie optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding, een cryostaat, vloeibare stikstof, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 1,0 ml spuiten met een naald van 27 G en silaangecoat glas. OPMERKING: Fluoresceïne-gelabelde Lotus tetragonolobus lectine (een proximale tubulus marker) en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kunnen worden bereid voor optionele kleuring van proximale tubuli en celkernen.</li>
	</ol></li>
	<li>Los 2 μL PEI-NP's op in 98 μL 10% glucoseoplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.</li>
	<li>Voeg 100 μL Cy3-gelabelde miRNA-mimiek toe aan 100 μL PEI-NP's in 10% glucoseoplossing (bereid in stap 2.2). Draai vervolgens de buis voorzichtig en draai naar beneden.</li>
	<li>Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij RT om een stabiel complex van PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimic te bereiden.</li>
	<li>Plaats de UUO-muis met het hoofd in een centrifugebuis van 50 ml zonder anesthesie en plaats vervolgens de staart door het voorbereide gat in de dop.</li>
	<li>Vul een spuit van 1,0 ml met een naald van 27 G met 200 μl PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic complex.</li>
	<li>Injecteer PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) via de staartader van de muis met behulp van de 1,0 ml spuit met 27 G naald. OPMERKING: Veeg de staartader af met watten verzadigd met ethanol (70% -80%) om de staartader te verwijden en het injectiegebied te desinfecteren.</li>
	<li>Een uur na 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic complexe injectie, verdooft u de muis met isofluraan (4% -5%) met behulp van een geschikt anestheticum voor kleine dieren. Bevestig de diepte van de anesthesie met een afwezigheid van teenknijpreflex. Handhaaf de anesthesie met isofluraan (3%) gedurende de hele operatie.</li>
	<li>Maak vervolgens een incisie in de huid, spieren en ribben met een chirurgische schaar en tang om het hart bloot te leggen. Na het maken van een incisie in het rechter atrium, injecteert u PBS in de linker ventrikel om bloed door het hele lichaam te trekken totdat de nierkleur verandert in lichtgeel (wat aangeeft dat het hele muizenlichaam is doordrenkt met PBS). OPMERKING: Hartperfusie wordt uitgevoerd om het bloed efficiënt door het hele lichaam te verwijderen.</li>
	<li>Stop isofluraan en verwijder de nieren van de muizen en was ze met PBS. Verwijder daarna niercapsules uit de nieren en was de nieren twee keer met PBS.</li>
	<li>Sluit de nierweefselmonsters in OCT-verbinding in en vries in vloeibare stikstof.</li>
	<li>Gebruik een cryostaat om secties (5 μm dik) te bereiden. Monteer de secties op silaan-gecoate glasplaten en bevestig ze met 4% paraformaldehyde. OPMERKING: Nierweefsels kunnen optioneel worden gekleurd met fluoresceïne-gelabelde Lotus tetragonolobus lectine (2 mg / ml) bij RT gedurende 2 uur voor proximale tubuli, gevolgd door DAPI (30 nM in PBS) bij RT gedurende 15 minuten voor celkernen.</li>
	<li>Was de dia's twee keer voorzichtig met PBS.</li>
	<li>Visualiseer de fluorescentiekleuring door fluorescentiemicroscopie bij 100x en 400x vergroting en geschikte beeldvormingssoftware.</li>
</ol>3. Bevestiging van doel-miRNA-veranderingen na toediening van miRNA-mimiek aan de nier door PEI-NP via staartaderinjectie
<ol><li>Voer kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) uit om de doelmiRNA-afwisselingen te bevestigen. OPMERKING: Raadpleeg het eerder gepubliceerde artikel voor de details van qRT-PCR18,19,20. Het qRT-PCR-systeem dat wordt gebruikt om de hieronder vermelde representatieve resultaten te genereren, is door de fabrikant gewijzigd. qRT-PCR moet worden uitgevoerd in overeenstemming met het nieuwste protocol van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Mohr, A. M., Mott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+microRNA+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Overview of microRNA biology.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).</li>
<li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li>
<li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+diabetic+nephropathy%3A+From+biomarkers+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35(2016).</li>
<li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li>
<li>Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+revolution%3A+RNA+interference+as+basic+biology%2C+research+tool%2C+and+therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic.</a> Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).</li>
<li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+treatment%3A+siRNAs+as+small+molecule+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li>
<li>Stewart, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li>
<li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressor+of+cytokine+signaling+%28SOCS%29+2+attenuates+renal+lesions+in+rats+with+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy.</a> Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).</li>
<li>Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+therapy%3A+Current+state+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry.+Biokhimiia%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives.</a> Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).</li>
<li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-146a+with+polyethylenimine+nanoparticles+inhibits+renal+fibrosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).</li>
<li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%3A+The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).</li>
<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%3A+The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in acute kidney injury.</a> Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).</li>
<li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+non-viral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li>
<li>Swami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+and+highly+efficient+nonviral+DNA%2FsiRNA+delivery+system+based+on+PEI-bisepoxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+microRNA+expression+in+the+kidneys+of+immunoglobulin+a+nephropathic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535(2020).</li>
<li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383(2020).</li>
<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378(2020).</li>
<li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5%2F6+nephrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li>
<li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenon+preconditioning+protects+against+renal+ischemic-reperfusion+injury+via+HIF-1alpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+knockdown+of+connective+tissue+growth+factor+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction+improves+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, kunnen PEI-NP's miRNA-nabootsingen aan de nier leveren om overexpressie van doel-miRNA's te induceren, wat resulteert in behandelingseffecten in in vivo muismodellen van verschillende nierziekten, waaronder nierfibrose, diabetische nierziekte en AKI.
De methode om het complex van PEI-NP's en miRNA-mimiek te bereiden is heel eenvoudig. Het positief geladen oppervlak van PEI-NP's vangt de miRNA-nabootsing in wanneer ...

miRNA's, kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door ze te destabiliseren en hun vertaling bij verschillende nierziekten te remmen 1,2. Daarom is gentherapie met exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers een potentiële nieuwe optie om de ontwikkeling van veel nierziekten te remmen 3,4,5.
Ondanks de belofte van miRNA-nabootsers of -remmers voor gentherapie, blijft levering aan doelorganen een grote hindernis voor in vivo experimenten om hun klinische potentieel te ontwikkelen. Omdat kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsers of -remmers onderhevig zijn aan onmiddellijke afbraak door serum-RNase, wordt hun halfwaardetijd verkort bij systemische toediening in vivo6. Bovendien is de efficiëntie van miRNA-nabootsers of -remmers om het plasmamembraan en transfect cytoplasma te passeren over het algemeen veel lager zonder geschikte vectoren 7,8. Deze bewijslijnen suggereren dat de ontwikkeling van het miRNA-nabootsings- of remmersysteem voor de nier nodig is om het gebruik ervan in klinische omgevingen mogelijk te maken en ze een nieuwe behandelingsoptie te maken voor patiënten met verschillende nierziekten.
Virale vectoren zijn gebruikt als dragers om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren 9,10. Hoewel ze zijn ontwikkeld voor bioveiligheid en transfectie-werkzaamheid, kunnen virale vectoren nog steeds een interferonrespons en / of genetische instabiliteit veroorzaken11,12. Om deze zorgen weg te nemen, ontwikkelden we een miRNA-nabootsingssysteem voor de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP's), een niet-virale vector, in verschillende muismodellen van nierziekte13,14,15.
PEI-NP's zijn lineaire op polymeren gebaseerde NP's die oligonucleotiden, inclusief miRNA-nabootsers, effectief aan de nier kunnen afleveren en worden beschouwd als de voorkeur voor het bereiden van niet-virale vectoren vanwege hun veiligheid op lange termijn en biocompatibiliteit13,16,17.
Deze studie toont de effecten aan van systematische exogene miRNA-nabootsing toediening met PEI-NP's via staartaderinjectie in nierfibrosemodelmuizen geproduceerd door unilaterale ureterobstructie (UUO). Daarnaast demonstreren we de effecten van systematische exogene miRNA-nabootsing met PEI-NP's via staartaderinjectie in diabetische nierziektemodelmuizen (db / db-muizen: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) en acute nierbeschadigingsmodelmuizen geproduceerd door nierischemie-reperfusieletsel (IRI).

<table><tbody><tr><td>4&rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole voor kleuring van nucleïnezuren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Wasbuffer 2</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Wasbuffer 1</td></tr><tr><td>Control-miRNA-mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niet toegewezen</td><td>5&rsquo;-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3&rsquo; (sense) 5&rsquo;-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&prime; (antisense)</td></tr><tr><td>Cy3-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotiden</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>MIR7900</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne-gelabelde Lotus tetragonolobus lectin</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>FL-1321</td><td></td></tr><tr><td>In vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>101000021</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-well reactieplaat voor qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96-well reactieplaat</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Kleeffolie voor 96-well reactieplaat</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Niet toegewezen</td><td>5&rsquo;-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3&prime; (sense) 5&rsquo;-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&prime; (antisense)</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021)</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA)</td><td>Gene design</td><td>Niet toegewezen</td><td>5&rsquo;-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3&rsquo;</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00006083</td><td>Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021)</td></tr><tr><td>miRNA-5100-mimic (kunstmatig gesynthetiseerd miRNA)</td><td>Gene design</td><td>Niet toegewezen</td><td>5&rsquo;-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&prime;</td></tr><tr><td>miRNA-5100-primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00042952</td><td>Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021)</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Membraan verankerde spinkolom in een 2,0-mL opvangbuis</td></tr><tr><td>miScript II RT kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021)</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021)</td></tr><tr><td>QIA shredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Biopolymeer spinkolommen in een 2,0-mL opvangbuis</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Fenol/guanidine gebaseerde lysis reagent</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systeem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Real-time PCR instrument</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Software versie 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Real-time PCR instrument software</td></tr><tr><td>RNase-vrij water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>RNU6-2 primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>Niet beschikbaar omdat Qiagen qRT-PCR kits heeft gewijzigd (van miScript miRNA PCR systeem naar miRCURY LNA miRNA PCR Systeem vanaf mei 2021)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td><td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td><td>Niet toegewezen</td><td></td></tr></tbody></table>

levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde mirna-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNA's (miRNA's), kleine niet-coderende RNA's (21-25 basen) die niet worden vertaald in eiwitten, remmen veel doelboodschapper-RNA's (mRNA's) door hun vertaling bij verschillende nierziekten te destabiliseren en te remmen. Daarom is afwisseling van miRNA-expressie door exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen een potentieel nuttige behandelingsoptie voor het remmen van de ontwikkeling van veel nierziekten. Omdat serumRNAase echter onmiddellijk systematisch toegediende exogene miRNA-nabootsingen in vivo afbreekt, blijft de afgifte van miRNA aan de nier een uitdaging. Daarom zijn vectoren nodig die exogene miRNA-nabootsingen kunnen beschermen tegen afbraak door RNAase en ze aanzienlijk aan de nier kunnen afleveren. Veel studies hebben virale vectoren gebruikt om exogene miRNA-nabootsers of -remmers aan de nier te leveren. Virale vectoren kunnen echter een interferonrespons en/of genetische instabiliteit veroorzaken. Daarom is de ontwikkeling van virale vectoren ook een hindernis voor het klinische gebruik van exogene miRNA-nabootsers of -remmers. Om deze zorgen met betrekking tot virale vectoren weg te nemen, ontwikkelden we een niet-virale vectormethode om miRNA-nabootsingen aan de nier af te leveren met behulp van staartaderinjectie van polyethylenimine nanodeeltjes (PEI-NP's), wat leidde tot significante overexpressie van doel-miRNA's in verschillende muismodellen van nierziekte.

De hieronder beschreven doel-miRNA's voor nierfibrose, diabetische nefropathie en AKI werden geselecteerd op basis van de microarray, qRT-PCR en / of database-onderzoek voor gentherapietoepassingen. Voor nadere bijzonderheden wordt verwezen naar de vorige publicaties13,14,15.
Toediening en effecten van miRNA-146a-5p-mimic met behulp van PEI-NP's bij nierfibrosemuizen<sup class...

Hier leveren we exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsingen aan de nier via staartaderinjectie van een niet-virale vector en polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen. Dit leidde tot significante overexpressie van doelmiRNA in de nier, wat resulteerde in geremde progressie van nierziekte in verschillende muismodellen.

Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de therapie van microRNA naar de nier, wat een uitdaging blijft. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de therapie van microRNA-nabootsingen naar de nier mogelijk maakt zonder een interferonrespons of genetische instabiliteit te veroorzaken. Begin met het oplossen van 10 microliter PEI-NP's in 90 microliter 5% glucose-oplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Draai vervolgens de buis zachtjes en draai naar beneden. Meng 50 microliter kunstmatig gesynthetiseerde miRNA's opgelost in 100 micromolair nucleasevrij water met 50 micromolair 10% glucoseoplossing in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Draai de buis zachtjes en draai naar beneden.Dit proces levert miRNA opgelost in 5% glucose-oplossing. Meng vervolgens 100 microliter PEI-NP's in 5% glucose-oplossing en 100 microliter miRNA-mimiek in 5% glucose-oplossing. Draai de buis zachtjes en draai naar beneden.Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om een stabiel complex van PEI-NPs miRNA-nabootsing te bereiden. Los twee microliter PEI-NP's op in 98 microliter 10% glucoseoplossing in een microcentrifugebui

delivery-exogenous-artificially-synthesized-mirna-mimic-to-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

Dit artikel beschrijft een in situ hybridisatie protocol geoptimaliseerd voor colorimetrische detectie van microRNA expressie in formaline gefixeerde niersecties.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie voor formaline gefixeerde nierweefsel

Dit protocol beschrijft een methode om te injecteren plasmide DNA in de nier van de muis via de renal bekken te produceren transgenic expressie specifiek in de nier.

Hydrodynamische Renal bekken injectie voor niet-virale expressie van eiwitten in de nier

Dit protocol beschrijft een volledige nier werk-up die moet worden uitgevoerd in muismodellen van glomerulaire ziekte. De methoden toestaan voor gedetailleerde mechanistisch, functionele en structurele analyse van glomerulaire functie, die kan worden toegepast op alle Muismodellen van glomerulaire ziekte.

Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte

Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren van microRNA-expressie in de nieren van een muismodel met acuut nierletsel met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie polymerasekettingreactie. Dit protocol legt de nadruk op een ischemisch nierletselmuismodel en de zorgvuldige extractie van microRNA-monsters.

Een kwantitatieve detectiemethode voor microRNA's in de nier van een ischemisch nierletsel muismodel

We beschrijven een methode voor het evalueren van de microRNA-expressie in de nieren van muizen met eenzijdige ureterale obstructie (UUO) door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie. Dit protocol is geschikt voor het bestuderen van niermicroRNA expressieprofielen bij muizen met UUO en in de context van andere pathologische aandoeningen.

Kwantitatieve real-time PCR-evaluatie van microRNA-expressies in muisnier met eenzijdige ureterale obstructie

microRNA's zijn betrokken bij de pathogenese van IgA-nefropathie. We hebben een betrouwbare methode ontwikkeld voor het detecteren van microRNA-expressieniveaus in de nieren van een IgA-nefropathiemuismodel (HIGA-muizen). Deze nieuwe methode zal het gemakkelijker maken om te controleren op betrokkenheid van miRNA's bij IgA-nefropathie.

Detectie van microRNA-expressie in de nieren van immunoglobuline A nefropathische muizen

Dit manuscript beschrijft een methode voor gerichte levering aan een enkele nier via een katheter die in de infrarenale abdominale aorta in de muis wordt geplaatst.

Directe medicijnafgifte aan de nier via de nierslagader

We presenteren een methode voor het evalueren van microRNA-expressie in de nieren en het serum van muizen met leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerasekettingreactie.

Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie evaluatie van microRNA-expressie in nier en serum van muizen met leeftijdsafhankelijke nierinsufficiëntie

Hier beschrijven we het protocol voor in vivo toediening van magnetische ijzeroxide nanodeeltjes die RNA-oligomeren vervoeren naar uitgezaaide borstkanker in diermodellen, waardoor een klinisch haalbare benadering wordt geboden voor de therapeutische uitschakeling van oncogene nucleïnezuren.

Monitoring van de accumulatie van nanodrugs bij borstkankermetastasen bij muizen

Dit rapport beschrijft de gelokaliseerde injectiemethode van AAV-vectoren via het nierbekken voor effectieve en veilige genoverdracht naar de nier van de muis.

Effectieve en veilige genafgifte aan de nier van de muis via langzame retrograde injectie van nierbekken van adeno-geassocieerde virusvectoren

Leer miRNA-afgifte aan de nier met polyethylenimine nanodeeltjes in muismodellen voor nierziekten. Deze methode bereikt overexpressie van doel-miRNA zonder interferonrespons en remt ziekteprogressie effectief.

Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen (Video) | JoVE Journal

Levering van exogene kunstmatig gesynthetiseerde miRNA-nabootsing aan de nier met behulp van polyethylenimine nanodeeltjes in verschillende nierziektemuismodellen

Meer video's verkennen