Terminale H-reflexmetingen bij muizen
16 juni 2022
De klinische evaluatie van spasticiteit op basis van de Hoffmann-reflex (H-reflex) en met behulp van elektrische stimulatie van perifere zenuwen is een gevestigde methode. Hier bieden we een protocol voor een terminale en directe zenuwstimulatie voor H-reflexkwantificering in de voorpoot van de muis.
De H-reflex maakt elektrofysiologische validatie van de integriteit van neurocircuits mogelijk. We presenteren een terminaal protocol om de H-reflex direct op de zenuwen van de voorpoot bij muizen te kwantificeren. Anders dan conventionele, vrij zenuw-niet-specifieke transcutane opnames, zijn de resultaten minder variabel tussen muizen en meetdagen.
Vergelijkbaar met H-reflexopnamen bij patiënten, omdat nauwkeurige kwantificering elektrofysiologische karakterisering in ziektemodellen mogelijk maakt, bijvoorbeeld ruggenmergletsel en beroerte. Het protocol vereist solide experimentele vaardigheden in het werken met operatieapparatuur bij muizen.
Als je niet zeker weet hoe je zenuwen van bindweefsel en bloedvaten kunt scheiden, oefen dan eerst. De procedure wordt gedemonstreerd door Frederique Wieters, een promovendus uit mijn laboratorium. Plaats om te beginnen de volwassen verdoofde 8 tot 16 weken oude C57 zwarte / 6J-muis op het afgedekte verwarmingskussen en wacht tot de muis kalm is, de ademhaling stabiel is en reflexen afwezig zijn.
Draai de muis op zijn rug. Bevestig vervolgens de voorpoten met tape. Plaats de tape zo dat de meetelektroden gemakkelijk in de voorpoten kunnen worden gestoken.
Om de temperatuur van een muis te meten, plaatst u een rectale sonde en bevestigt u deze met tape. Breng oogzalf aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen. Verwijder de vacht voorzichtig met een fijne, afgeronde schaar terwijl je de huid met een pincet optilt.
Maak vervolgens een incisie van één centimeter in de huid langs de ventroposterieure as van de voorpoot met een fijne, afgeronde schaar. Verwijder voorzichtig het bindweefsel en leg de onderliggende spier en zenuw bloot. Verwijder vervolgens de blootgestelde musculus pectoralis profundus met behulp van een tang om de mediane zenuw te beoordelen.
Verwijder kleine hoeveelheden bloed en weefselvloeistof met zacht tissuepapier. Snijd vervolgens voorzichtig de borst of okselspier van boven naar beneden om de zenuwbundel bloot te leggen. Bevrijd de zenuwbundel van het bind- en spierweefsel over een lengte van ongeveer 1,5 centimeter.
Scheid de ulnaire en mediane zenuw van de voorpoot voorzichtig met behulp van een gebogen glazen pipet. De bovenzenuw is de nervus ulnaris en de onderste is de mediane zenuw. Plaats de stimulatorhaakelektroden parallel op een afstand van 0,5 tot één millimeter en gebruik een micromanipulator om de dubbele haak dicht bij de zenuw te plaatsen.
Gebruik de glazen haak om de nervus ulnaris op de stimulatiehaakelektroden te tillen. Trek vervolgens de elektrode met de zenuw terug en scheid deze van de andere zenuwen. Plaats de elektroden langs de lange as van de poot om de overspraak tussen de spieren te verminderen.
Droog oppervlakkig de elektrodehaken die aan de zenuw zijn bevestigd en breng vaseline aan met behulp van een spuit om elektrische isolatie van het aangrenzende weefsel te bieden. Om de H-reflex te meten, plaatst u de elektromyografie-elektroden intramusculair in de voorpoot. Plaats vervolgens de referentie-elektrode subcutaan in de achterpoot, vastgehouden door een miniatuur krokodillenklem.
Wanneer de stimulator is ingeschakeld, observeer dan een succesvolle stimulatie als kleine spiertrekkingen van de voorpoot. De minimale stimulatiestroom om de M-golf en kleine zichtbare spiertrekkingen in de voorpoot uit te lokken liggen tussen de 10 en 50 microampère. Voer de zenuwstimulatie 15 keer uit met elk pulsen van 0,2 milliseconden.
Met pauzes van twee minuten tussen de sets stimuli wordt de frequentie verhoogd van 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 naar 5 hertz. Een illustratie van de opname die is opgezet in paden om de Hoffman-reflex en spierrespons te meten, wordt hier getoond. De verhouding tussen H-en M-golf amplitude werd geëvalueerd.
De stimulus en het respectievelijke stimulatieartefact werden ingesteld op nul milliseconden, gevolgd door de directe M-golf en de daaropvolgende kleinere piek die de H-golf vertegenwoordigt. De M-golf treedt ongeveer twee milliseconden na stimulatie op en de H-golf na zes tot acht milliseconden vanwege de langere transittijd door het ruggenmerg. Naast de scheiding van de zenuwen is het aanbrengen van vaseline op de elektrode en ook tussen de twee haken van cruciaal belang.
Dit is een terminaal experiment. In ons lab leverde deze techniek een nieuwe gouden standaardreferentie op voor de transcutane H-reflex opnames.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het kwantificeren van de Hoffmann-reflex (H-reflex) in de voorpoot van de muis met behulp van terminale en directe zenuwstimulatie. De methode is een verbetering ten opzichte van conventionele transcutane registraties door consistentere resultaten te leveren over verschillende muizen en experimentele dagen, met als doel de elektrofysiologische karakterisering in ziektemodellen zoals dwarslaesies en beroertes te faciliteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Elektrofysiologie
- Neurobiologie
- Ziektemodellering
Achtergrond
- De H-reflex is een gevestigde methode voor het evalueren van spasticiteit.
- De integriteit van neurale circuits kan elektrofysiologisch worden beoordeeld.
- Het protocol is erop gericht de variabiliteit in metingen gerelateerd aan de biologie van de muis te verminderen.
Gebruikte methoden
- H-reflex registratie via directe zenuwstimulatie
- Muizen (C57 black/6J), 8–16 weken oud
- Elektromyografie voor evaluatie van zenuw- en spierrespons
Belangrijkste resultaten
- Het nieuwe terminale protocol vertoont een verminderde variabiliteit in vergelijking met traditionele methoden.
- Succesvolle stimulatie leidde tot waarneembare reacties van de voorpoot, waarmee de H-reflexregistraties zijn gevalideerd.
- Belangrijke metingen omvatten de amplitudeverhoudingen van de H-golf en de M-golf.
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor het kwantificeren van de H-reflex in onderzoek.
- Dit protocol kan worden gebruikt bij het bestuderen van neurologische aandoeningen die spasticiteit beïnvloeden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Directe elektrofysiologische meting van de integriteit van neurale circuits ondersteunt de validatie van targets in neurologische ziektemodellen. Het terminal H-reflexprotocol vermindert de variabiliteit bij de beoordeling van spasticiteit, waardoor het voorspellend vertrouwen voor translationeel onderzoek wordt verbeterd. Dit maakt betrouwbaardere go/no-go beslissingen mogelijk in preklinische portfolio's die gericht zijn op dwarslaesies en beroertes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de integriteit van de spinale reflexbaan te kwantificeren.
- Operationele waarde: Biedt biologische risicoreductie via directe metingen van zenuwstimulatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door ziektemodellen met elektrofysiologische spasticiteitsfenotypes te identificeren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaar voor analyse: Levert gestandaardiseerde H-reflexmetingen met een lage variabiliteit tussen muizen en experimentele dagen.
- Kwantitatieve output: Genereert ratio's van de H-golf- tot M-golfamplitude voor een objectieve beoordeling van spasticiteit.
- Herbruikbaarheid van het platform: Aanpasbaar voor de nervus ulnaris, nervus medianus, nervus tibialis en nervus ischiadicus met geringe wijzigingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Modelleert spasticiteit na een beroerte via H-reflexaugmentatie die correleert met hypertonie en onwillekeurige contracties.
- Translationele continuïteit: Weerspiegelt klinische H-reflexregistraties bij patiënten, wat validatie tussen verschillende soorten mogelijk maakt.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door target-engagement in spinale banen te bevestigen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische werkzaamheidstesten in neurologische ziektemodellen.
- Discovery Biology: Test de verduidelijking van signaalpaden door de bijdragen van spinale reflexen aan de spierrespons te isoleren.
- Screening: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay via directe zenuwstimulatie en isolatie met vaseline.
- Analytics: Biedt de H-wave/M-wave ratio als kwantitatieve readout voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translational Research: Sluit aan bij klinische biomarkers voor spasticiteit via elektrofysiologische homologie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gouden standaardreferentie voor elektrofysiologische validatie tussen verschillende laboratoria.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door de meetvariabiliteit bij de beoordeling van de integriteit van neurale circuits te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen proefpersonen en meetdagen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door een vroegere identificatie van niet-transleerbare targets mogelijk te maken.
- Impact op de portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van elektrofysiologische targetvalidatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muischirurgie, nerve dissectie en elektrofysiologische registratie.
- Vereist precisie-instrumentarium, waaronder micromanipulatoren, stimulatoren en EMG-versterkers.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor technieken voor nerve-isolatie en elektrodeplaatsing.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij toepassing van het protocol op zenuwen van de achterpoot.
- Beperkt door het terminale karakter, waardoor longitudinale studies in hetzelfde dier zijn uitgesloten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:15
Preparation
1:53
Surgery
2:54
Electrode Placement
3:34
Placement of the Recording and Reference Electrodes and Measurement
4:25
Results: Terminal H-Reflex Quantification at the Ulnar and Median Nerves of the Mouse Forepaw
5:04
Conclusion
