Isolatie en profilering van menselijke primaire mesenteriale arteriële endotheelcellen op transcriptoomniveau
14 maart 2022
Het protocol beschrijft de isolatie, cultuur en profilering van endotheelcellen uit de menselijke mesenteriale slagader. Daarnaast wordt een methode aangeboden om de menselijke slagader voor te bereiden op ruimtelijke transcriptomics. Proteomics, transcriptomics en functionele assays kunnen worden uitgevoerd op geïsoleerde cellen. Dit protocol kan worden hergebruikt voor elke middelgrote of grote slagader.
Het karakteriseren van genexpressie op transcriptomisch niveau is de sleutel tot het begrijpen van de celfunctie in gezondheid en ziekte. Onze methode richt zich op het vastleggen van endotheelcellen, de cruciale laag van de vaatwand, uit de menesterische slagaders van menselijke donoren voor transcriptomische profilering met een eencellige en ruimtelijke resolutie. Er is een verrijkte populatie van endotheelcellen uit een vat zonder sorteerstap, wat celverlies kan veroorzaken.
Bovendien bestaan er andere celtypen die het mogelijk maken om cel-celinteracties in de weefselcontext te onderzoeken. We hebben deze techniek gebruikt om de arteriële veranderingen in diabetes en obesitas te onderzoeken. Afhankelijk van de beschikbaarheid van het vat, kunnen deze technieken ook worden hergebruikt om biologie te verkennen in andere vasculatuur en andere ziekten.
Als het de eerste keer is, vereisen twee belangrijke stappen de meeste oefening. Eén, schrapen, hoewel voldoende kracht moet worden uitgeoefend om integrale cellen te verwijderen zonder diepere lagen los te maken. En twee, cryostaatsectie.
Zorg ervoor dat secties koud en vlak zijn en binnen de grenzen van de gespecialiseerde dia liggen. De procedure wordt gedemonstreerd door Yingjun Luo en Xiaofang Tang, twee postdoctorale onderzoekers uit mijn laboratorium. Om te beginnen was het weefsel met DPBS.
Verwijder met een steriele tang en dissectieschaar het vet en de buitenste bindweefsels totdat het vat schoon is. Meet de lengte van het vat met een liniaal buiten de schaal en maak fotografische gegevens. Knip de mesenteriale slagader in de lengte af met een schaar om het vat lumen verticaal te openen.
Bevestig het vat met behulp van naalden op zwarte was op alle vier de hoeken, waardoor de intima wordt blootgesteld. Voeg een milliliter voorverwarmde digestiebuffer toe aan intima. Schraap met behulp van een steriel scalpel het lumen van het vat twee keer voorzichtig.
Breng de verteringsbuffer over in een buis. Voeg een milliliter verteringsbuffer toe aan de intima en pipetteer voorzichtig op en neer om de resterende cellen te verzamelen en breng de celsuspensie over naar een buis. Incubeer cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten in een incubator of op een rocker.
Voeg M199-medium toe aan de celsuspensie om de enzymatische reactie te dempen en meng voorzichtig. Centrifugeer de suspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en 600 keer G.At het einde van de centrifugatie, verwijder en bewaar het supernatant afzonderlijk als een controlecultuur om te observeren of alle cellen in de pellet worden gevangen. Suspensie vervolgens de celkorrel opnieuw in één milliliter M199-medium.
Beoordeel de levensvatbaarheid van de cel door 10 microliter trypanblauw te mengen met 10 microliter celvoorraad. Observeer de celmorfologie en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Bestrijk twee putten van een plaat met zes putten door 500 microliter bevestigingsreagens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in putten te pipetteren.
Na het wassen van de putten met steriele DPBS, doseer de volledige celvoorraad in één put en het supernatant wordt als controle in de tweede put gehouden. Centrifugeer eerder bereide celvoorraad bij vier graden Celsius en 600 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en suspensie de pellet voorzichtig opnieuw met een P-1000 pipet in 0,04% BSA in DPBS.
Meng goed om een eencellige suspensie te garanderen. Laat de oplossing door een zeef van 40 micrometer gaan om celresten te verwijderen. Centrifugeer vervolgens de suspensie en verwijder het supernatant zoals gedemonstreerd.
Suspensie de pellet opnieuw in 500 microliter van 0,04% BSA in DPBS met behulp van een P-1000 pipet en meng goed om een eencellige suspensie te garanderen. Zoals eerder aangetoond, beoordeel de levensvatbaarheid van de cel met behulp van trypan blue. Met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller, observeer de morfologie van de eencellige suspensie, controleer op weefselresten en bereken het aantal levende en dode cellen.
Na het toevoegen van isopentane aan een metalen bus, koel in vloeibare stikstof of droogijs. Giet OCT-verbinding in putten van gelabelde plastic cryomal, waardoor bubbelvorming wordt voorkomen. Laat cryovorm op droogijs afkoelen.
Snijd ten minste twee coronale secties van een centimeter in de lengte van het vat. Gebruik een 12-inch tang om het weefsel onder te dompelen in isopentane totdat het bevroren is. Dompel het weefsel snel onder in OCT bij oriëntatie met het lumen zichtbaar in het midden.
Pak en plaats de cryomallen op droogijs en observeer het bevriezen. De OCT wordt in één tot twee minuten geleidelijk wit van buitenaf. Bewaar deze secties in een beveiligde container bij min 80 graden Celsius gedurende maximaal zes maanden.
Stel de gewenste cryostaattemperatuur in voor de kamer en de monsterkop. Breng oct-embedded vatsecties, messen, borstels en glijden tot min 20 graden Celsius in evenwicht gedurende ongeveer 30 minuten in de cryostaat. Reinig tijdens het balanceren de machine en alle apparatuur die de secties kan raken, inclusief het mes, met 70% ethanol gevolgd door RNase-decontaminatieoplossing.
Bevestig het monster door een kleine hoeveelheid OCT op het cirkelvormige cryostaatblok te doseren en het monster erop te plaatsen voordat het bevriest. Nadat u het blok in het midden van de monsterkop hebt geplaatst, schroeft u het blok op zijn plaats met behulp van het hoge zwarte handvat aan de linkerkant. Snijd overtollige OCT rond het schip weg.
Stel de snijdikte in op 10 micrometer op de cryostaat, snijd ongeveer 60 secties en plaats ze in een voorgekoelde buis van 1,5 milliliter met RNA-extractiereagens. Vortex totdat de secties volledig zijn opgelost. Extraheer het RNA zoals beschreven in het teksthandschrift en los de gezuiverde RNA-pellet op in vijf microliter RNase-vrij water.
Snijd 10 micrometer dikke secties met anti-rolplaat op zijn plaats. Draai om en druk voorzichtig af door het gedeelte zachtjes aan te raken door de omringende OCT. Veeg de glijbaan af met ethanol en verwarm de achterkant van het vanggebied voor met uw vinger.
Gebruik RNase-vrije cryostaatborstels of de dia direct, plaats het weefselgedeelte in het vierkant met alleen de omringende OCT. Plaats onmiddellijk een vinger op de achterkant van het vanggebied om het gedeelte naar de dia te smelten. Zodra de sectie hecht, plaatst u de schuif op de cryobar om de sectie te laten bevriezen.
Knip 10 micrometer dikke weefselsecties zoals eerder aangetoond op weefseloptimalisatie of genexpressiedia's. Breng de dia over naar een slide mailer die op droogijs is geplaatst. De figuur toont geïsoleerde EC's gekweekt met behulp van het beschreven protocol met een duidelijke geplaveide morfologie met minimale contaminerende cellen.
Expressie van EC-marker vasculaire endotheel cadherine werd bevestigd met behulp van immunofluorescentie die cel-tot-cel juncties visualiseert. Ongeveer 80% van de cellen was CD31-positief, wat aangeeft dat menselijke mesenteriale arteriële EC's het grootste deel van de vers geïsoleerde celpopulatie uitmaakten. Mislukte isolaties resulteren in cellen met een verstoorde morfologie, die mogelijk mesenchymale markers tot expressie brengen of die langgerekten op een fibroblastische toestand lijken.
De figuur toont een representatieve uniforme variëteit benadering en projectie geïsoleerd voor mesenteriale slagader met behulp van het huidige protocol voor eencellige RNA-sequencing op geïsoleerde menselijke mesenteriale arteriële ECS, met 34% cellen geclusterd als EC's met PECAM1 en VWF als markers. RNA van hoge kwaliteit moet een RNA-integriteitsgetal van niet minder dan zes vertonen en de verhouding van 28S tot 18S ribosomale RNA-banden ligt zo dicht mogelijk bij twee. Een zwakke of afwezigheid van deze ribosomale RNA-signalen kan worden waargenomen wanneer RNA's worden afgebroken.
Hematoxyline en eosinekleuring visualiseerden de morfologie van het vat, waardoor interessante regio's konden worden geïdentificeerd. Genexpressie werd gevisualiseerd met ruimtelijke verankering op het met hematoxyline en eosine bevlekte vat. Ga zorgvuldig om met weefsel- en celvoorraad om de RNA-kwaliteit te behouden, vooral voor ruimtelijke transcriptoomprofilering.
Zorg ervoor dat het weefsel op droogijs wordt geplaatst om RNA-afbraak te verminderen. Behandel ook de secties en het weefsel met voorgekoelde instrumenten. We zijn in staat geweest om EC-genexpressieveranderingen te onderzoeken, inclusief LncRNA's in context van diabetes en hun interactie met andere celtypen.
We kunnen de locatie van deze transcriptomische veranderingen afleiden met behulp van ruimtelijke transcriptoomprofileringstechnieken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie en cultivering van endotheelcellen uit menselijke mesenteriale slagaders, waardoor transcriptoom-profilering mogelijk wordt. Het bevat ook een methode voor het voorbereiden van menselijke slagaders voor ruimtelijke transcriptomie, waardoor het onderzoek naar celinteracties in verschillende vasculaire contexten wordt vergemakkelijkt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Endotheelcellen zijn essentieel voor de vasculaire functie en gezondheid.
- Het begrijpen van genexpressie in deze cellen is cruciaal voor het onderzoek naar ziekten zoals diabetes en obesitas.
- Het vastleggen van endotheelcellen zonder sorteerproces minimaliseert celverlies.
- Deze methode kan worden aangepast voor andere vasculaire studies.
Doel van het onderzoek
- Het isoleren en profileren van endotheelcellen uit menselijke mesenteriale slagaders.
- Het mogelijk maken van ruimtelijke transcriptoomanalyse van vasculair weefsel.
- Het onderzoeken van cellulaire interacties en veranderingen in ziektecontexten.
Gebruikte methoden
- Isolatie van endotheelcellen uit menselijke mesenteriale slagaders.
- Cultivering van geïsoleerde cellen voor functionele assays.
- Voorbereiding van slagaders voor ruimtelijke transcriptomie.
- Analyse van genexpressie op single-cell niveau.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van een verrijkte populatie van endotheelcellen.
- Mogelijkheid om cel-cel interacties binnen het weefselcontext te bestuderen.
- Toepassing van de methode om arteriële veranderingen in diabetes en obesitas te onderzoeken.
- Mogelijkheden voor hergebruik van technieken voor andere vasculaire studies.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuuste methode voor endotheelcelprofilering.
- Het vergemakkelijkt de verkenning van vasculaire biologie in gezondheid en ziekte.
- Toekomstige studies kunnen deze aanpak gebruiken voor bredere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct isolation and transcriptomic profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells (ECs) addresses a critical need for native-state vascular cell models in early discovery and translational research. This workflow enables high-fidelity interrogation of EC gene expression and spatial context, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in vascular biology portfolios. The approach is adaptable to diverse disease states and vessel types, enhancing enterprise R&D impact across cardiovascular and metabolic indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EC transcriptional programs in native tissue for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by preserving in vivo-like gene expression and epigenetic states.
- Facilitates identification of disease-relevant EC subpopulations and pathways for hypothesis-driven research.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary ECs for downstream transcriptomic and spatial profiling workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing culture-induced artifacts and external variables.
- Enables quantitative assessment of EC marker expression and cell viability for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic outputs with disease models, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from human tissue to preclinical validation by preserving spatial and cellular context.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on high-quality, disease-relevant molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying native-state ECs and spatial transcriptomic data for target validation, lead identification, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct transcriptomic analysis of primary ECs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for EC marker validation and cell viability assessment.
- Analytics: Provides high-quality RNA and spatial gene expression data for robust comparative analyses.
- Translational Research: Enables alignment of molecular findings with disease context and tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for multiple vessel types and disease states, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes EC isolation and profiling, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions with high-fidelity molecular data, improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and metabolic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, cryosectioning, and RNA handling to maintain sample integrity.
- Demands access to specialized instrumentation for spatial transcriptomics and single-cell RNA sequencing.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and analytical workflows.
- Adaptable to various vessel types and donor conditions, but tissue quality and handling are critical.
- RNA degradation risk mandates stringent cold-chain and RNase-free practices throughout the workflow.
