Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie

Schatting van een presynaptisch calciumgehalte is een belangrijke taak bij het bestuderen van synaptische transmissie. Het bestuderen van calciumsignalering is ook belangrijk voor het vinden van manieren om neurodegeneratieve ziekten te behandelen. Het belangrijkste voordeel van de gepresenteerde laadtechniek is dat de kleuring alleen is uitgevoerd voor de cellen van belang.

Onze methode voor het registreren van calciumintransitie biedt een extreem goede ruimtelijk-temporele resolutie. De gepresenteerde registratiemethode kan nuttig zijn voor neurofysiologen die snelle periodieke processen moeten registreren met behulp van een confocale microscoop. De moeilijkste stap in de laadtechniek is het vasthouden van de zenuw in de pipet.

De diameter van de pipet moet perfect passen, dus maak er een paar. Weten dat alle stappen in het protocol ingewikkeld zijn en elk van hen demonstreren, zal veel helpen. Begin met het bevestigen van het levator auris longus spierweefsel op een licht uitgerekte manier in de met elastomeer gecoate petrischaal met de fijne roestvrijstalen pinnen en voeg Ringer's oplossing toe aan de schotel totdat de spier volledig bedekt is.

Gebruik vervolgens een micropipettetrekker om een micropipette met een fijne scherpe punt voor te bereiden voor de intracellulaire opnames. Gebruik haarvaten zonder interne filamenten. Nadat u de taper met een schuurmiddel hebt gescoord, breekt u de micropipettepunt af, waardoor een punt open blijft tot ongeveer 100 micrometer in diameter.

Poets vervolgens de punt totdat de interne diameter krimpt van 80 micrometer tot 12 micrometer. Als u klaar bent, bevestigt u een siliconen buis aan de ene kant en een spuit zonder naald aan de andere kant van de vulpipet. Zoek onder een stereomicroscoop waar de zenuwstam verandert in afzonderlijke zenuwtakken.

Plaats de vulpipet met was op de petrischaal en beweeg vervolgens de pipetpunt totdat deze boven de zenuw staat. Snijd de zenuw dicht bij de spiervezel met een fijne schaar, waardoor een klein stukje van de zenuwstomp overblijft, ongeveer een millimeter lang. Zuig vervolgens de zenuwstomp met wat Ringer's oplossing in de punt van de vulpipet, zonder de zenuw te knijpen.

Als u klaar bent, verwijdert u de siliconenbuis uit de vulpipet. Gebruik later een spuit met een lange gloeidraad om de oplossing voor het laden van kleurstof te trekken. Steek vervolgens de filamentpunt met de laadoplossing in de vulpipet en laat het mengsel los op de zenuwstomp, gevolgd door het zenuwpreparaat bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten te incuberen.

Spoel na de incubatie het zenuwpreparaat af met verse Ringer-oplossing voordat u het behandelt met 50 milliliter Ringer's oplossing in een glazen bekerglas bij 25 graden Celsius gedurende twee uur. Voor de confocale microscopie monteer je het zenuwpreparaat in een met siliciumelastomeer gecoate experimentele kamer en bevestig je het, enigszins uitgerekt, met een set stalen micronaalden. Spoel vervolgens het preparaat uitgebreid af met de Ringer's oplossing.

Installeer een zuigelektrode op de kamer. Nadat u de voorbereidingskamer op het microscooppodium hebt gemonteerd, plaatst u de inlaat- en uitlaatfittingen in de kamer. Schakel een zwaartekrachtstroomgestuurd systeem in om de overtollige oplossing uit het preparaat te verwijderen.

Als u klaar bent, steekt u de stimulerende zuigelektrode in een elektrische stimulator en zorgt u ervoor dat spiersamentrekkingen optreden na stimuli. Vul vervolgens het perfusiesysteem met de Ringer-oplossing die 10 micromolaire d-tubocurarine bevat en schakel de perfusie-zuigpomp in om de perfusie te starten. Kies in de confocale microscoop voor laserscanning of LSCM-software elektrofysiologie en acquisitiemodus om beeldparameters in te stellen.

Selecteer in de instellingen van het taakmenu de triggerinstellingen om de stimulator te activeren met de microscoopsynchronisatiepuls en stel de trigger uit op het frameveld naar het OUT 1-kanaal. Zet de scanmodus op XYT met een scanfrequentie van 1.400 hertz. De zoomfactor moet 6,1 zijn met het gaatje volledig open.

Zorg ervoor dat de sequentiële, transpassing, bidirectionele X-modus is ingeschakeld en stel vervolgens de minimale tijd in om een frame te vormen op 52 milliseconden en verzamel frames in een onbewerkte video met 20 frames. Stel de excitatiegolflengte van de argonlaser in op 488 nanometer met 8% uitgangsvermogen. Wanneer de parameters zijn ingesteld, drukt u op de live-modusknop om een live voorbeeld te krijgen van zenuwklemmen die met de kleurstof zijn geladen.

Zoek in de livemodus naar de gewenste regio of ROI om de beste focus te krijgen. Verschuif vervolgens de vertraging op de stimulator met twee milliseconden minder ten opzichte van de vorige waarde en voer de data-acquisitiesoftware uit om 26 sequenties te verkrijgen door elke reeks twee milliseconden van de vorige te verschuiven. Om de vastgelegde video's te verwerken, voert u Leica Application Suite X of LAS X-software uit en opent u het gemaakte project.

Klik vervolgens op exporteren en opslaan als om frames in TIF-indeling in de doelmap op te slaan. Voer vervolgens de ImageJ-software uit en klik op bestand, import en afbeeldingsvolgorde. Kies in het venster voor de volgorde van de afbeelding openen de doelmap en open het eerste frame.

Ga vanuit de reeksopties naar het veld voor de beginafbeelding en stel het framenummer in op één voor het eerste frame. Stel vervolgens in het increment-veld de waarde in die gelijk is aan het aantal frames in de eerste signaalopname voordat u op OK klikt. Als u het gegenereerde bestand met gestikte eerste frames in een aparte map wilt opslaan, klikt u op de tabbladen bestand, opslaan en map in de aangegeven volgorde.

Herhaal de procedures voor 19 frames door het bijbehorende framenummer in het veld voor de beginafbeelding in te stellen. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, klikt u op bestand, import en afbeeldingsvolgorde om er een te selecteren in de velden startafbeelding en increment. De laatste video met alle frames aan elkaar genaaid met een verhoogde temporele resolutie is te zien.

Sla vervolgens het videobestand op in TIF-indeling. Om de gestikte video te analyseren, klikt u op afbeelding, stapels, gereedschappen en stapelsorteerder. Ga vervolgens naar analyse, tools en ROI-manager.

Sleep het eerder opgeslagen TIF-bestand naar het ImageJ-venster en vouw de afbeelding vervolgens uit voor een betere weergave. Om de beeldvisualisatie te verbeteren, klikt u op afbeelding, past u deze aan en zet u het helderheidscontrast op automatisch. Stel de achtergrond dicht bij de zenuwterminal in door ROI te tekenen en waarde toe te voegen aan de ROI-manager.

Bereken vervolgens de achtergrond door op meer en meerdere metingen te klikken. Kopieer gemiddelde waarden om in het spreadsheetprogramma te plakken. Bereken vervolgens de gemiddelde waarde.

Trek vervolgens de berekende gemiddelde waarde af van de stapels door op proces, hoofd en aftrekken te klikken. Voer de verkregen waarde in en teken ROI rond een zenuwterminal via een polygoonlijn voordat u deze toevoegt aan de ROI-manager. Meet de voorbijgaande intensiteit van de zenuwterminal door op meer te klikken en meerdere tabbladen te meten.

Kopieer vervolgens de gemiddelde intensiteitswaarden en plak ze in het spreadsheetprogramma om de gemiddelde verschuiving van signalen te berekenen. Deel de signaalwaarden door de gemiddelde offsetwaarde. Trek van de verkregen waarde er een af en vermenigvuldig vervolgens met 100%, gevolgd door het uitzetten van een calciumtransiënte grafiek om de amplitude te bepalen.

Na het laden van het zenuwpreparaat met een kleurstof, bevindt het grootste deel van de synaps zich dicht bij de zenuwstomp, wat wijst op een voldoende niveau van fluorescentie. Na de beeldverwerking werd calciumtransitie met de gewenste ruimtelijke en temporele resolutie verkregen. Een van de belangrijkste stappen in dit protocol is dat de zenuwstomp in de eerste paar minuten na het snijden van de zenuw in de kleurstof met oplossing moet worden geplaatst.

Deze methode kan worden gebruikt om verschillende kleurstoffen en medicijnen in motorneuronen te laden. Registratieprotocol kan nuttig zijn voor het beoordelen van calcium in dendrieten en stekels in CZS-preparaten. Onze techniek maakt het mogelijk om een calciumsignaal te registreren met een goede ruimtelijke en temporele resolutie.

Het bestuderen van calciumtransicentie is een krachtig hulpmiddel bij de regulatie van een neurotransmitterafgifte en synaptische plasticiteit.