Name: Robuuste differentiatie van menselijke iPSCs in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer hoe u menselijke iPSC's differentieert naar een zuivere adipocytenpopulatie met behulp van retinoïnezuur en Nile red-sortering. Deze methode verbetert de opbrengst en zuiverheid voor onderzoek naar stofwisselingsziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi werd ondersteund door een GSRA-beurs van het Qatar National Research Fund (QNRF).

De studie is goedgekeurd door de juiste ethische commissie voor institutioneel onderzoek en uitgevoerd volgens de ethische normen zoals vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen of vergelijkbare ethische normen. Het protocol is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van HMC (nr. 16260/16) en QBRI (nr. 2016-003). Dit werk is ook geoptimaliseerd voor hESCs zoals H1 en H9. Bloedmonsters werden verkregen van gezonde personen met volledige geïnformeerde toestemming. De iPSC's worden gegenereerd uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van gezonde individuen.
1. Het kweken en onderhouden van iPSC's
<ol><li>Bereid keldermembraanmatrix-gecoate platen voor door de coatingmatrix in knockout-DMEM te reconstitueren in een verhouding van 1:80 en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid iPSC-kweekmedia door 50 ml 10x stamcelsupplementmedia toe te voegen aan 500 ml stamcelbasaal media, samen met 5 ml 100x penicilline-streptomycine (P / S) en bewaar bij 4 ° C voor korte termijn of bij -20 ° C voor langdurig gebruik.</li>
	<li>Bekleed de platen met coatingmatrix-1 ml voor een 6-well plaat, 500 μL voor een 12-well plaat, 250 μL voor een 24-well plaat-en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 1-2 uur.</li>
	<li>Verwijder een hoeveelheid iPSC-kweekmedia en verwarm deze voor gebruik op kamertemperatuur.</li>
	<li>Ontdooi een injectieflacon met iPSC's (SER's of iPSC's) in een waterbad van 37 °C en breng over in een conische buis van 15 ml met 2-3 ml kweekmedia.</li>
	<li>Centrifugeer de buis op 120 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT-23 °C).</li>
	<li>Verwijder het supernatant en voeg 2 ml verse kweekmedia toe, aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632). Plaats de cellen in één put van een matrix-gecoate 6-well plaat en plaats de plaat op 37 °C.</li>
	<li>Verwijder na 24 uur de media en vervang deze door nieuwe cultuurmedia.</li>
	<li>Verander de media elke dag totdat de cellen 80% -90% confluentie bereiken.</li>
	<li>Bij het bereiken van confluentie, passage cellen door het volgen van de onderstaande stappen.<ol><li>Verwijder de media en was de cellen met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS).</li>
		<li>Voeg iPSC's dissociatiereagens toe (zie materiaaltabel)-500 μl voor een put van een 6-wellenplaat, 250 μl voor een put van een 24-wellenplaat en incubeer gedurende 1 min bij 37 °C.</li>
		<li>Verwijder het dissociatiereagens en incubeer de cellen gedurende 1 minuut droog bij 37 °C.</li>
		<li>Verzamel de cellen met behulp van kweekmedia - 1 ml voor een put van een 6-putplaat en 250 μl voor een put van een 24-putplaat - in een conische buis van 15 ml en centrifugeer op 120 x g gedurende 4 minuten.</li>
		<li>Resuspendeerde cellen in kweekmedia-2 ml voor een put van een 6-well-plaat en 500 μL voor een put van een 24-well plaat-aangevuld met 10 μM ROCK-remmer en plaat ze op verse matrix gecoate platen met 40% confluentie.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Differentiatie van iPSC in MSC's
<ol><li>Bereid MSC-differentiatiemedia door 15% foetaal runderserum (FBS) en 1% P / S toe te voegen aan DMEM met lage glucose + pyruvaat en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Gebruik bij het bereiken van 80% confluentie iPSC's voor de vorming van embryoïde lichamen (EB) volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Was de cellen met DPBS en incubeer ze met dissociatiemedium/EDTA-500 μL voor een putje van een 6-well plaat, 250 μL voor een putje van een 24-well plaat.</li>
		<li>Incubeer gedurende 1 minuut bij 37 °C, zuig het dissociatiereagens op en houd de cellen nog eens 1 minuut op 37 °C. Om MSC-differentiatie te starten, zijn ~10-12 x 106 cellen vereist.</li>
		<li>Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml met behulp van kweekmedia. Zorg ervoor dat je heel voorzichtig bent tijdens het verzamelen om te voorkomen dat cellen single worden en EB-vorming mogelijk maken. Centrifugeer de cellen op 120 x g gedurende 4 min.</li>
		<li>Resuspendie van de cellen in 3 ml MSC-differentiatiemedia met 10 μM ROCK-remmer.</li>
		<li>Meng en verdeel 0,5 ml/put in een 24-well ultra-low attachment plate. OPMERKING: Het gebruik van een ultralage bevestigingsplaat zou celaggregatie in EB's aanmoedigen in plaats van hun bevestiging aan het oppervlak.</li>
		<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Induceer na 24 uur de bereikte EB's met een behandeling met hoog retinoïnezuur (RA) door de onderstaande stappen te volgen.<ol><li>Voeg 10 μM RA toe aan 3 ml MSC-differentiatiemedia. Verzamel EB's in een buis van 15 ml en laat ze 15 minuten bezinken.</li>
		<li>Verwijder het supernatant uit EB's en voeg MSC-differentiatiemedia toe, aangevuld met 10 μM RA.</li>
		<li>Resuspendeer voorzichtig en verdeel 0,5 ml/put in dezelfde 24-well ultra-low bevestigingsplaat.</li>
		<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C. Stoor de EB's de komende 48 uur niet.</li>
		<li>Verzamel na 48 uur EB's in een buis van 15 ml en laat ze 15 minuten bezinken.</li>
		<li>Verwijder het supernatant uit EB's en voeg MSC-differentiatiemedia toe, aangevuld met 0,1 μM RA.</li>
		<li>Resuspendeer voorzichtig en verdeel 0,5 ml/put in dezelfde 24-well ultra-low bevestigingsplaat.</li>
		<li>Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C. Stoor de EB's de komende 48 uur niet.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder de RA die aan de cellen is toegevoegd door de onderstaande stappen te volgen.<ol><li>Na 48 uur van de laatste RA-behandeling, verzamel de EB's en laat ze 15 minuten bezinken.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en voeg DMEM-lage glucosemedia toe zonder cytokines.</li>
		<li>Resuspendeer voorzichtig en verdeel 0,5 ml/put in een 24-well ultra-low bevestigingsplaat. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de van iPSC's afgeleide EB's door de onderstaande stappen te volgen.<ol><li>Na 48 uur na de vorige stap (stap 2.4), verzamelt u de EB's in een buis van 15 ml en laat u ze gedurende 15 minuten bezinken.</li>
		<li>Verwijder supernatant en resuspensie in 2 ml verse MSC-differentiatiemedia.</li>
		<li>Breng over naar twee putten van een keldermembraan matrix-gecoate 6-well plaat.</li>
		<li>Verander de media om de andere dag gedurende nog eens 5 dagen.</li>
		<li>Verwijder na 5 dagen de gebruikte media en vervang deze door verse MSC-differentiatiemedia die 2,5 ng / ml basisfibroblastgroeifactor (bFGF) bevatten.</li>
	</ol></li>
	<li>Passeer de vergulde EB's wanneer ze 80% -90% samenvloeiing bereiken, door de onderstaande stappen te volgen.<ol><li>Was de cellen met DPBS, voeg trypsine-EDTA-500 μL toe voor een putje van een 6-well plaat en incubeer de cellen op 37 °C gedurende 3 min.</li>
		<li>Verzamel de cellen met behulp van MSC-differentiatiemedia in een conische buis van 15 ml en draai gedurende 4 minuten op 750 x g .</li>
		<li>Resuspendeer in MSC-differentiatiemedia met 2,5 ng/ml bFGF en plaats de cellen op keldermembraanmatrix-gecoate platen in een verhouding van 1:3.</li>
		<li>Herhaal de passage wanneer de cellen 70% -80% confluency bereiken. Er wordt verwacht dat het 3-6 miljoen cellen krijgt door 2-3 passages.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Flowcytometrie-analyse van van iPSC's afgeleide MSC's
OPMERKING: Na het ondergaan van 2-3 passages moeten de cellen toegankelijk zijn voor de efficiëntie van MSC-differentiatie. Differentiatie zal als succesvol worden beschouwd als de cellen MSC-differentiatiemarkers-CD44, CD73, CD90 en CD105 met een efficiëntie van meer dan 90% tot expressie brengen en geen hoge niveaus van hematopoietische markers-CD14, CD19, CD34 en CD45 tot expressie brengen. De efficiëntie van deze markers kan worden benaderd door de onderstaande stappen te volgen.
<ol><li>Passeer de cellen met behulp van de hierboven beschreven stappen (stap 2.6) en bereik 1 x 105 cellen in één put van een v-bodem 96-putplaat.</li>
	<li>Centrifugeer de plaat op 375 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Resuspendeer 1 x 105 cellen in 100 μL koude DPBS met 1 μL geconjugeerd antilichaam (Ab) (zie Tabel met materialen) en incubeer bij 4 °C gedurende 30-40 minuten om blootstelling aan licht te voorkomen.</li>
	<li>Resuspendeer nog eens 1 x 105 cellen in 100 μL koude DPBS met de respectieve isotypecontrole van het geconjugeerde Ab in een concentratie van 1:100 ) en incubeer bij 4 °C gedurende 30-40 minuten om blootstelling aan licht te voorkomen.</li>
	<li>Na incubatie wordt de plaat gedurende 4 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 375 x g . Gooi het supernatant weg door de plaat over de gootsteen te schudden.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 100 μL koude DPBS.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen op 375 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 200 μL koude DPBS en verzamel ze in donkere, koude microcentrifugebuizen van 1,5 ml en houd ze op ijs totdat ze worden geanalyseerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).</li>
	<li>Voor FACS-analyse verdeelt u de cellen met behulp van side scattered (SSC-A) versus forward scattered (FSC-A) om het puin uit te sluiten. Verdeel verder de gated cellen met behulp van forward scattered height (FSC-H) versus forward scattered area (FSC-A) om singlets te onderscheiden van doubletten uit de levende celpopulatie. OPMERKING: Cellen werden omheind ten opzichte van de verschuiving van isotypecontrole voor elke marker en een minimum van 10.000 gated events van elk gekleurd monster werd gebruikt voor analyse.</li>
</ol>4. Differentiatie van MSC's in adipocyten
<ol><li>Bereid adipocytendifferentiatie basale media door 10% knockout serumvervanging (KOSR), 1% Glutamine, 1% P / S, 4,5 ng / μL glucose toe te voegen aan minimaal essentiële media (MEM) -alfa en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Laat MSC's meer dan 90% confluency bereiken. Blijf ze nog 48 uur kweken om ze een periode van groeistilstand te laten ondergaan.</li>
	<li>Bereid complete adipocytendifferentiatiemedia door 100 μg / ml 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethason, 0,2 U / ml insuline, 100 μM indomethacine en 10 μM rosiglitazon toe te voegen aan de basale media.</li>
	<li>Verwijder MSC-differentiatiemedia en was de cellen met DPBS.</li>
	<li>Voeg volledige adipocytendifferentiatiemedia toe - 2 ml voor een put van een 6-putplaat en 1 ml voor een put van een 12-putplaat - en incuber de cellen bij 37 °C. Verander volledige differentiatiemedia om de andere dag gedurende 14 dagen.</li>
</ol>5. Evaluatie van de differentiatie-efficiëntie van adipocyten
<ol><li>Controleer op dag 14 van differentiatie de efficiëntie van differentiatie door cellen te kleuren voor adipocytenrijpingsmarkers, FABP4 en adiponectine.</li>
	<li>Verwijder de media en was de cellen met DPBS.</li>
	<li>Bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) - 200 μL aan een put van een plaat met 24 putten - en incuber gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi de PFA weg en was met tris-gebufferde zoutoplossing met 0,5% tween (TBST) en plaats deze gedurende 15 minuten op een shaker bij kamertemperatuur. Herhaal het proces twee keer.</li>
	<li>Permeabiliseer de vaste cellen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 0,5% Triton X-100 (PBST) en plaats het op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten.</li>
	<li>Gooi de PBST weg en voeg de blokkeringsbuffer (5%-6% runderserumalbumine (BSA) in PBST)-500 μL voor een putje van een 6-wells plaat en 250 μL voor een putje van een 12-well plaat-en incubeer bij kamertemperatuur op de shaker gedurende 40-60 min.</li>
	<li>Verdun de primaire antilichamen tegen FABP4, adiponectine in 2%-3% BSA, in een concentratie van 1:500 (zie tabel met materialen). Voeg deze antilichamen alleen bij verschillende dieren aan elkaar toe en plaats de plaat bij 4 °C een nacht op de schudder.</li>
	<li>Verwijder de primaire antilichamen en was de cellen drie keer met TBST (elk 15 minuten) en plaats het op een shaker bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid Alexa Fluor secundaire antilichamen voor in PBST (1:500). Incubeer de cellen in de secundaire antilichaamcombinaties (volgens de soort waarbij het primaire antilichaam wordt verhoogd) gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en bedek de plaat met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.</li>
	<li>Gooi de secundaire antilichamen weg, was drie keer met TBST en plaats de plaat op de shaker.</li>
	<li>Om de kernen te kleuren, voegt u 1 μg / ml Hoechst 33342-200 μL toe voor een put van een 24-well plaat verdund in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi de Hoechst-oplossing weg en voeg PBS-500 μL toe voor een put van een 24-putplaat aan de cellen. Houd de platen bedekt tegen licht totdat ze worden gevisualiseerd met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>6. Sorteren van adipocyten met nijlrood
<ol><li>Bereid nijlrode werkoplossing door toevoeging van 1 mg/ml nijlrode stamoplossing in DMSO en bewaar bij -20 °C. Ontdooi vlak voor gebruik de rode nijlvoorraad en reconstitueer in DPBS tot een concentratie van 300 nM werkoplossing.</li>
	<li>Gooi op of na dag 14 van adipocytendifferentiatie de media uit de cellen en was met DPBS.</li>
	<li>Voeg nijlrode werkoplossing -1 ml toe in een put van een plaat met 6 putten - en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Verwijder de Nile red solution en voeg trypsine-EDTA -500 μL toe in een putje van een 6-well plaat- en incubeer bij 37 °C gedurende 4 min.</li>
	<li>Verzamel de cellen met DMEM met 5% FBS in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 750 x g gedurende 4 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie in DPBS-1 ml gedurende 1 x 106 cellen. Centrifugeer op 750 x g gedurende 4 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie in DPBS-1 ml gedurende 1 x 106 cellen. Gebruik een FACS-sorteerder om de nijlrood-positieve cellen te isoleren met behulp van het FL1-kanaal.</li>
	<li>Herkweek de gesorteerde cellen in adipocytendifferentiatiemedia of verzamel de gesorteerde cellen voor RNA- en eiwitisolatie.</li>
	<li>Extraheer RNA uit de gesorteerde cellen en voer een relatieve kwantitatieve analyse uit van adipocytendifferentiatiemarkers, waaronder FABP4, PPARG en C / EBPA. De nijlrood-positieve cellen vertonen een significante upregulatie in de genexpressie van ten minste twee vouwen in vergelijking met niet-gesorteerde cellen.</li>
</ol>

<ol><li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%3A+CCS%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).</li>
<li>Wagner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+replicative+senescence+have+related+effects+on+human+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells.</a> PLoS One. 4 (6), 5846(2009).</li>
<li>Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+evaluation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow.</a> Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).</li>
<li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).</li>
<li>Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+multipotent+mesenchymal+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells.</a> PLoS Medicine. 2 (6), 161(2005).</li>
<li>Xiong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+adipocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).</li>
<li>Cuaranta-Monroy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+adipocytes+by+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).</li>
<li>van Harmelen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+lipolytic+regulation+in+human+embryonic+stem+cell-derived+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes.</a> Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).</li>
<li>Noguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+and+engraftment+of+adipocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).</li>
<li>Ahfeldt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+human+pluripotent+stem+cells+into+white+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes.</a> Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).</li>
<li>Lee, Y. K., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+white+and+brown+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).</li>
<li>Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+different+types+of+diabetes+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).</li>
<li>Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li>
<li>Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Generation+of+mesenchymal+stem+cells+and+adipocytes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li>
<li>Karam, M., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+and+highly+efficient+protocol+for+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).</li>
<li>Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+E-cadherin+and+other+cell+adhesion+molecules+in+survival+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).</li>
<li>Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+endothelial+cell+proliferation+during+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis.</a> Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).</li>
<li>Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+inhibits+proliferation+of+intestinal+epithelial+cells+by+inhibiting+expression+of+the+gene+encoding+Kruppel-like+factor+5%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5.</a> FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).</li>
<li>di Masi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+receptors%3A+from+molecular+mechanisms+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy.</a> Molecular Aspects of Medicine. 41, 1(2015).</li>
<li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).</li>
<li>De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+retinoic+acid+treatment+sustains+pluripotency+and+suppresses+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Death & Disease. 9 (1), 6(2018).</li>
<li>Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lats1%2F2-mediated+alteration+of+hippo+signaling+pathway+regulates+the+fate+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> BioMed Research International. 2018, 4387932(2018).</li>
<li>Moldes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome-proliferator-activated+receptor+gamma+suppresses+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+during+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis.</a> The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).</li>
<li>Ross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+adipogenesis+by+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling.</a> Science. 289 (5481), 950-953 (2000).</li>
<li>Wang, Y. K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+and+mechanical+stimulation+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).</li>
<li>Mohsen-Kanson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+brown+and+white+adipocytes%3A+role+of+Pax3%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3.</a> Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).</li>
<li>Billon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+adipocytes+by+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The generation of adipocytes by the neural crest.</a> Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).</li>
<li>Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+crest+cell+fate+by+the+retinoic+acid+and+Pparg+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways.</a> Development. 137 (3), 389-394 (2010).</li>
<li>Ussar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASC-1%2C+PAT2%2C+and+P2RX5+are+cell+surface+markers+for+white%2C+beige%2C+and+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes.</a> Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).</li>
<li>Festy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+protein+expression+between+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+and+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).</li>
<li>Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor+CD36+expression+contributes+to+adipose+tissue+inflammation+and+cell+death+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity.</a> PLoS One. 7 (5), 36785(2012).</li>
<li>Mesuret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+role+of+the+Alanine-Serine-Cysteine-1+transporter+%28SLC7A10%2C+Asc-1%29+for+glycine+inhibitory+transmission+and+respiratory+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8536(2018).</li>
<li>Silverstein, R. L., Febbraio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36%2C+a+scavenger+receptor+involved+in+immunity%2C+metabolism%2C+angiogenesis%2C+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior.</a> Science Signaling. 2 (72), (2009).</li>
<li>Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+decay-accelerating+factor%2C+membrane+cofactor+protein%2C+and+CD59+in+the+protection+of+human+endothelial+cells+against+complement-mediated+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis.</a> European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).</li>
<li>Davies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD59%2C+an+LY-6-like+protein+expressed+in+human+lymphoid+cells%2C+regulates+the+action+of+the+complement+membrane+attack+complex+on+homologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).</li>
<li>Lapid, K., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form%28ul%29ation+of+adipocytes+by+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Form(ul)ation of adipocytes by lipids.</a> Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).</li>
<li>Aldridge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+validation+for+the+assessment+of+adipogenesis+of+multipotential+stromal+cells--a+direct+comparison+of+four+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods.</a> Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).</li>
<li>Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+sort+ESC-derived+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A simple method to sort ESC-derived adipocytes.</a> Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).</li>
<li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions%3A+implications+for+further+clinical+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dit protocol is van het grootste belang vanwege het vermogen om MSC's met een hoge opbrengst en efficiëntie te leveren. Deze massaproductie van MSC's werd mogelijk gemaakt door tijdelijke incubatie van van iPSC's afgeleide EB's met 10 μM RA14,15. Voorbijgaande behandeling met 10 μM RA verhoogde de MSC-opbrengst met 11,2 tot 1542 maal14,15, waarbij dit protocol van toepassing was op zowel iPSC's als hPSC's...

Mesenchymale stamcellen (MSC's) fungeren als een effectieve tijdelijke bron voor het produceren van cellen van mesodermale oorsprong zoals adipocyten, osteocyten en chondrocyten, die verder kunnen worden gebruikt voor het modelleren van hun respectieve genetische aandoeningen. Eerdere benaderingen waren echter gebaseerd op het bereiken van deze MSC's uit volwassen weefsels 1, wat de uitdaging oplegde om ze in grote aantallen van de donoren te verkrijgen, en de beperking om ze functioneel levensvatbaar te houden in suboptimale in vitro kweekomstandigheden 1,2. Deze obstakels hebben geleid tot een grote vraag naar een protocol voor het genereren van MSC's in vitro. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gebruikt als een waardevolle bron van MSC's en vertonen MSC-kenmerken 3,4,5. iPSCS-afgeleide MSC's kunnen worden gebruikt als een therapeutische optie bij verschillende ziekten. Ook het vermogen van van iPSC's afgeleide MSC's om adipocyten te genereren, maakt ze een waardevol in vitro menselijk model om menselijke adipogenese, obesitas en adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen.
De huidige differentiatieprotocollen van adipocyten kunnen in twee groepen worden ingedeeld, waarbij de ene differentiatie van adipocyten met behulp van chemische of op eiwitten gebaseerde cocktails met een resulterende opbrengst van 30% -60% 6,7,8,9 oplevert, terwijl de andere genetische manipulatie omvat voor robuuste inductie van belangrijke transcriptiefactoren die de ontwikkeling van adipocyten regelen om een opbrengst van 80% -90% 10 te geven, 11. Genetische manipulatie vat echter niet het natuurlijke proces van adipocytendifferentiatie samen en maskeert vaak de subtiele paradigma's die tijdens adipogenesis aankomen, waardoor het niet effectief is voor ziektemodelleringsdoeleinden12,13. Daarom presenteren we een manier om chemisch afgeleide volwassen adipocyten te sorteren van onrijpe adipocyten door fluorescerend lipide-dragende adipocyten te labelen met behulp van Nijlrood.
Hier presenteren we een protocol met voorbijgaande incubatie van van iPSC's afgeleide embryoïde lichamen (EB's) met all-trans retinoïnezuur om een groot aantal snel prolifererende MSC's te produceren, die verder kunnen worden gebruikt voor het genereren van adipocyten14. We presenteren ook een manier om chemisch afgeleide rijpe adipocyten uit de heterogene differentiatiepool te sorteren door hun lipidedruppeltjes fluorescerend te labelen met behulp van een lipofiele kleurstof; Nijlrood. Dit zou het mogelijk maken om een zuivere populatie van volwassen adipocyten te genereren met verbeterde functionaliteit om adipocyt-geassocieerde metabole stoornissen nauwkeurig te modelleren.

<table><tbody><tr><td>Adiponectin</td><td>Abcam</td><td>ab22554</td><td>Adipocyte maturation marker</td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Pharmingen</td><td>560839</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>anti-CD14</td><td>BD Pharmingen</td><td>561712</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>BD Pharmingen</td><td>555415</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>anti-CD44</td><td>abcam</td><td>ab93758</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td> 560975</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>anti-CD73</td><td>BD Pharmingen</td><td>550256</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>anti-CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>555596</td><td>MSC differentiatie marker</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D</td><td>233-FP</td><td>MSC cultuurmedia supplement</td></tr><tr><td>C/EBPA</td><td>Abcam</td><td>ab40761</td><td>Adipocyte maturation marker</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Torics</td><td>1126</td><td>Adipocyte differentiatie media supplement</td></tr><tr><td>FABP4</td><td>Abcam</td><td>ab93945</td><td>Adipocyte maturation marker</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td>MSC cultuurmedia supplement</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td>MSC cultuurmedia supplement</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td>Adipocyte differentiatie media supplement</td></tr><tr><td>Indomethacine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Adipocyte differentiatie media supplement</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td>Adipocyte differentiatie media supplement</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12660012</td><td>Basal media voor het bereiden van matrigel</td></tr><tr><td>Low glucose DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11885084</td><td>MSC cultuur media</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Coating matrix</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td>Adipocyte differentiatie media</td></tr><tr><td>Nilered</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19123</td><td>Sorteringsmarker voor adipocyte</td></tr><tr><td>Penicilline</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>MSC/Adipocyte media supplement</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>Wasbuffer</td></tr><tr><td>Pierce&trade; 20X TBS Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>28358</td><td>Wasbuffer</td></tr><tr><td>PPARG</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2443</td><td>Adipocyte maturation marker</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td>Dissociatie reagens</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td>MSC differentiatie media supplement</td></tr><tr><td>Rock inhibitor</td><td>Tocris</td><td>1254/10</td><td>hPSC cultuurmedia supplement</td></tr><tr><td>Roziglitazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2408</td><td>Adipocyte differentiatie media supplement</td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A334901</td><td>hPSC cultuurmedia</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Thermo Fisher</td><td>28314</td><td>Permebealisatie reagens</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td>Dissociatie reagens</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7942</td><td>Wasbuffer</td></tr></tbody></table>

robuuste differentiatie van menselijke ipsc's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie hebben het genereren van verschillende celtypen mogelijk gemaakt, waaronder adipocyten. De huidige differentiatiemethoden hebben echter een lage efficiëntie en produceren geen homogene populatie van adipocyten. Hier omzeilen we dit probleem door een volledig trans-retinoïsche methode te gebruiken om mesenchymale stamcellen (MSC's) met een hoge opbrengst te produceren. Door routes te reguleren die celproliferatie, overleving en adhesie regelen, maakt onze differentiatiestrategie de efficiënte generatie van embryonale lichamen (EB's) mogelijk die differentiëren in een zuivere populatie van multipotente MSC's. Het grote aantal MSC's dat door deze methode wordt gegenereerd, biedt een ideale bron voor het genereren van adipocyten. De heterogeniteit van de steekproef als gevolg van adipocytendifferentiatie blijft echter een uitdaging. Daarom gebruikten we een op Nijlrood gebaseerde methode voor het zuiveren van lipide-dragende volwassen adipocyten met behulp van FACS. Deze sorteerstrategie stelde ons in staat om een betrouwbare manier te vinden om adipocyten-geassocieerde metabole stoornissen te modelleren met behulp van een pool van adipocyten met verminderde heterogeniteit van het monster en verbeterde celfunctionaliteit.

Schematische en morfologie van cellen tijdens mesenchymale differentiatie: Differentiatie van iPSC's in MSC's omvat verschillende stadia van ontwikkeling die zich uitstrekken over EB-vorming, MSC-differentiatie en MSC-expansie (figuur 1). Tijdens deze stadia van ontwikkeling verwerven cellen verschillende morfologie als gevolg van de verschillende stimulerende chemicaliën waaraan ze worden blootgesteld. Bij het initiëren van differentiatie worden cellen in suspensie geplaatst en wordt verwac...

Het protocol maakt het mogelijk om een zuivere adipocytenpopulatie te genereren uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Retinoïnezuur wordt gebruikt om iPSC's te differentiëren in mesenchymale stamcellen (MSC's) die worden gebruikt voor de productie van adipocyten. Vervolgens wordt een sorteerbenadering op basis van Nijlrode kleuring gebruikt om zuivere adipocyten te verkrijgen.

Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Eerdere benaderingen vertrouwden op zeer invasieve methoden voor het verkrijgen van mesenchymale stamcellen in vitro, maar die mesenchymale stamcellen hadden een beperking van het produceren van heterogene pool van 30% met een efficiëntie variërend van 30 tot 60% Hier presenteren we een protocol voor het produceren van een groot aantal snel prolifererende mesenchymale stamcellen die een zuivere populatie van volwassen adipocyten kunnen produceren door te sorteren met nijlrood. Wanneer de iPSC's 80% samenvloeiing hebben bereikt, wast u de cellen met DPBS en voegt u dissociatiemedium toe dat EDTA bevat. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende één minuut.Zuig na één minuut het dissociatiereagens op en plaats de cellen nog een minuut op 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens de plaat uit de couveuse. Voeg één milliliter StemFlex-media per put toe en verzamel de cellen voorzichtig in een conische buis van 15 milliliter.Centrifugeer de cellen. Verwijder het supernatant en resuspensie ze voorzichtig in drie milliliter MSC-differentiatiemedia met 10 micromol van een rotsremmer. Meng de celsuspensie en verdeel 500 microliter per put in een 24-well ultra-low bevestigingsplaat.Plaats de plaat vervolgens in een couveuse op 37 graden Celsius. Na 24 uur, om de verkregen embryonale lichamen te induceren, verzamelt u ze in een buis van 15 milliliter en laat u ze bezinken. Verwijder na 15 minuten het supernatant en voeg MSC-differentiatiemedium aangevuld met 10 micromolair retinoïnezuur toe.Resuspendeer de embryonale lichamen voorzichtig en verdeel 500 microliter per put in dezelfde 24-well ultra-lage bevestigingsplaat. Plaats de plaat vervolgens in de couveuse. Verzamel na 48 uur de embryonale lichamen in een buis van 15 milliliter en laat ze 15 minuten bezinken.Verwijder vervolgens het supernatant en voeg MSC-differentiatiemedium aangevuld met 0,1 micromolair retinoïnezuur toe. Na het opnieuw verdelen van de embryonale lichamen 500 microliter per put in dezelfde 24-putplaat en plaatst u de plaat in de couveuse. Achtenveertig uur na de laatste behandeling met retinoïnezuur, verzamel de embryonale lichamen, verwijder het supernatant en voeg DMEM-glucosearm medium toe zonder cytokines.Resuspendeer voorzichtig en verdeel 500 microliter van de celsuspensie per put in dezelfde 24-well ultra-low bevestigingsplaat en incuber de plaat vervolgens bij 37 graden Celsius. Na 48 uur, om de iPSC-afgeleide embryonale lichamen te plaatsen, verzamelt u de embryonale lichamen in een buis van 15 milliliter, laat ze bezinken, verwijder vervolgens het supernatant en resuspendien in twee milliliter vers MSC-differentiatiemedium. Breng vervolgens de suspensie over naar twee putten van een keldermembraan matrix-gecoate zes-well plaat en incuber de cellen bij 37 graden Celsius.Vervang na vijf dagen de gebruikte media door een vers MSC-differentiatiemedium met 2,5 nanogram per milliliter basisfibroblastgroeifactor en zet de MCS-differentiatie voort gedurende maximaal 11 en 15 dagen. Wanneer de vergulde embryonale lichamen 80 tot 90% samenvloeiing hebben bereikt, passeert u ze door te wassen met DPBS, Trypsine-EDTA toe te voegen en gedurende één minuut bij 37 graden Celsius te broeden. Haal de Trypsine-EDTA uit de plaat en incubeer opnieuw bij 37 graden Celsius gedurende één minuut.Voeg vervolgens één milliliter media per put toe. Verzamel na drie minuten de cellen met behulp van MSC-differentiatiemedia in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen. Resuspendeer vervolgens de cellen in een MSC-differentiatiemedium met basische fibroblastgroeifactor en plaats de cellen op keldermembraanmatrix-gecoate platen in een verhouding van één tot drie.Nadat de MSC's 90% samenvloeiing hebben bereikt, blijf je ze nog 48 uur kweken om ze een periode van groeistilstand te laten ondergaan. Verwijder vervolgens het medium en was de cellen met DBPS. Voeg na het wassen volledig adipocytendifferentiatiemedium toe aan de plaat en incuber de cellen bij 37 graden Celsius.Verander het medium om de andere dag gedurende 14 dagen. Differentieer iPSC-afgeleide MSC's in adipocyten. Om de adipocyten te sorteren met behulp van Nijlrood, bereidt u nijlrode werkoplossing in DMSO zoals beschreven in het tekstmanuscript.Ontdooi voor gebruik de stamoplossing en reconstitueer deze in DPBS om een concentratie van 300 nanomolaire werkoplossing te bereiken. Op of na dag 14 van adipocytendifferentiatie gooit u het medium uit de cellen en wast u met DPBS. Voeg vervolgens Nile rode werkoplossing toe.Bedek de plaat en incuber de cellen bij 37 graden Celsius. Vervang na 15 minuten de nijlrode oplossing door trypsine-EDTA en incuber de cellen gedurende vier minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel vervolgens de cellen met DMEM met 5% FBS in een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de cellen.Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in DPBS met een dichtheid van 1 miljoen cellen per milliliter. Isoleer vervolgens met behulp van de FACS-sorteerder de nijlroodpositieve cellen met behulp van het FL-1-kanaal. Verzamel de gesorteerde cellen en kweek ze opnieuw in adipocytendifferentiatiemedia of ga verder met RNA-extractie gevolgd door kwantitatieve analyse van adipocytendifferentiatiemarkers.Bij het initiëren van differentiatie zijn cellen die in suspensie zijn verguld rond met gedefinieerde celranden en hebben ze een kleine tot middelgrote diameter. De levensvatbaarheid van embryonale lichamen wordt waargenomen door het snelle proliferatiegedrag dat aanleiding geeft tot meer MSC's. Dit snelle proliferatiegedrag, samen met hun eigenaardige en langwerpige morfologie, blijft behouden, zelfs na het passeren van de MSC's op verse matrix-gecoate platen.Goede differentiatie produceert betrouwbare MSC's met een expressie-efficiëntie van meer dan 90% van mesenchymale oppervlaktemarkers CD73, CD44 en CD90. Bovendien toonde de beoordeling van cellen op de afwezigheid van oppervlaktemarkers die het hematopoietische fenotype CD14, CD34 en CD19 weergeven, minder dan 1% expressie-efficiëntie, Hoge expressie in cytoplasmatische distributie van FABP4, een marker voor terminaal gedifferentieerde adipocyten, geeft hun ontwikkelingsrijpheid aan. Bovendien geeft een hoge expressie van adiponectine, een andere marker van adipocytenrijpheid, aan dat de adipocyten functioneel genoeg zijn om lipideopslag en adipogenese te ondergaan als reactie op glucosesignalering.Bij kleuring bindt Nijlrood uitsluitend aan de lipide-dragende rijpe adipocyten, waardoor het een effectief hulpmiddel is voor het sorteren van volwassen adipocyten met behulp van fluorescerende geactiveerde flowcytometrie. De nijlrood-positieve cellen vertonen een significante upregulatie van rijpingsmarkers met ten minste twee keer in vergelijking met ongesorteerde cellen. Je moet heel voorzichtig zijn tijdens het verzamelen van cellen tijdens embryonale lichaamsvorming en mesenchymale celdissociatie, omdat dat een grote invloed zou hebben op de overlevingsefficiëntie na dissociatie van mesenchymale stamcellen.Zuivere populatie van adipocyten verkregen van mutatiedragende patiënten kan worden onderworpen aan functionele en de hele transcriptoomsequencing om regulerende en signaleringsroutes te bepalen die door een bepaalde mutatie worden beïnvloed zonder dat de gegevens worden beïnvloed door heterogeniteit van de steekproef. Deze techniek zal schaalbare generatie van mesenchymale stamcellen in vitro mogelijk maken, waardoor het niet nodig is om ze van menselijke donoren te oogsten om ze gemakkelijk te onderscheiden van adipocyten, chondrocyten en osteocyten voor het begrijpen van weefselgerelateerde ziektepathogenese.

robust-differentiation-human-ipscs-into-pure-population-adipocytes-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Volwassen adipocyten kunnen een overvloedige bron van stamcellen vertegenwoordigen door dedifferentiatie, wat leidt tot een homogene populatie van fibroblast-achtige cellen. Collagenase-digestie wordt gebruikt om volwassen adipocyten uit menselijk vet te isoleren. Het doel van ons protocol is om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit menselijke volwassen adipocyten.

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

Dit protocol beschrijft de isolatie van varkens-vetafkomstige stamcellen (pADSC) uit subcutaan vetweefsel met onderzoek van multipotentie. De multipotente pADSC worden gebruikt om processen van adipocytendifferentiatie te bepalen en transdifferentiatie in meerdere cellijnen van mesodermaal mesenchym of verdere lijnen van ectoderm en endoderm te bestuderen voor regeneratieve onderzoeken.

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Dit rapport beschrijft een protocol voor de gelijktijdige isolatie van primaire bruine en witte preadipocyten van pasgeboren muizen. Geïsoleerde cellen kunnen in cultuur worden gekweekt en worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in volgroeide witte en bruine adipocyten. De methode maakt genetische, moleculaire en functionele karakterisering van primaire vetcellen in cultuur mogelijk.

Isolatie en differentiatie van primaire witte en bruine preadipocyten van pasgeboren muizen

Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.

Gedifferentieerde muis adipocyten in primaire cultuur: een model van insulineresistentie

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer hoe u menselijke iPSC's differentieert naar een zuivere adipocytenpopulatie met behulp van retinoïnezuur en Nile red-sortering. Deze methode verbetert de opbrengst en zuiverheid voor onderzoek naar stofwisselingsziekten.

Robuuste differentiatie van menselijke iPSCs in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen (Video) | JoVE Journal

Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen

Meer video's verkennen