Analyse van het muismodel van de ziekte van Parkinson geïnduceerd door Adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor menselijk α-synucleïne

Het algemene doel van deze procedure is om de meeste essentiële aspecten van de ziekte van Parkinson te reproduceren in een diermodel. De stereotaxische afgifte van adeno-geassocieerde virale vectoren, coderend voor het menselijke synucleïne in de substantia nigra. De ziekte van Parkinson is een neurodegeneratieve aandoening die de dood van dopaminerge neuronen met zich meebrengt, in de nigrostriatale route, en bijgevolg de progressie van verlies van controle over vrijwillige beweging.

Dit neurodegeneratieve proces gaat gepaard met afzetting van eiwitaggregatie in de hersenen, die voornamelijk worden gevormd door synucleïne. Opkomend bewijs heeft aangetoond dat synucleïneaggregaten toll-like receptoren op de microglia kunnen stimuleren, waardoor neurale ontsteking in de substantia nigra wordt veroorzaakt. Bovendien zijn er aanwijzingen dat synucleïneaggregaten kunnen worden gevangen en gepresenteerd, door antigeen-presenterende cellen aan T-cellen, waardoor een adaptieve immuunrespons wordt geïnduceerd die specifiek is voor synucleïne.

De stereotaxische levering van adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor het menselijke synucleïne in de substantia nigra, heeft aangetoond dat het vele essentiële aspecten van de ziekte reproduceert, waaronder synucleïnepathologie, microgliale activering, T-celactivatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen. Deze studie presenteert een analyse van hoe een virale vector en de tijd na virale vectorafgifte de mate van menselijke synucleïneexpressie, neurodegeneratie en neuro-inflammatie in de nigrostriatale route beïnvloedt, evenals de mate van motorische stoornissen in een muismodel van unilaterale stereotaxische levering van menselijk synucleïne in substantia nigra. Om een aseptische omgeving te behouden, draagt u geschikte chirurgische kleding tijdens de hele operatie, inclusief schoenovertrekken, operatiemasker, sanitaire barrière, handschoenen en operatiemuts.

Spuit ethanol op de muis en al het chirurgische materiaal om de aseptische omgeving te behouden. Om een analgesie te induceren, injecteert u carprofen subcutaan elke 12 uur, beginnend een uur voor de operatie en doorgaand tot drie dagen na de operatie. Om de muis te verdoven, plaatst u het dier in een inductiekamer.

Open de isofluraanstroom met een snelheid van 0,5% en verhoog deze vervolgens langzaam tot 5% gedurende ongeveer vijf minuten totdat de muis zijn rechtreflex heeft verloren. Verwijder het dier uit de inductiekamer. Breng het dier onmiddellijk over naar een niet-rebreathing circuit met een neuskegel van de juiste grootte.

Handhaaf de muisanesthesie, met isofluraan 1% gedurende de hele tijd van de operatie. Bevestig dat de muis volledig is verdoofd door in zijn staarten en poten te knijpen. Wanneer de muis niet reageert bij het knijpen van de staart en poten, betekent dit dat de muis volledig is verdoofd.

Scheer de muizenkop met een schaar. Reinig de muizenhuid met een wattenstaafje met chloorhexidine 2% en verwijder al het haar. Bevestig de muiskop in het stereotaxische frame.

Plaats een hoornvliesbeschermer in beide muizenogen, met behulp van een wattenstaafje. Om stressinductie bij andere knaagdieren te voorkomen, vermijdt u de aanwezigheid van een andere muis in de operatiekamer. Reinig de muizenkop met drie ronden chloorhexidine 2%, gevolgd door ethanol 70% Bedek de schedel met chirurgisch materiaal en maak een dun gat met een boor op coördinaten anteroposterior 2,8 mm en mediolateraal 1,4 mm, met betrekking tot de mediale lijn.

Steek de naald van een spuit van 10 microliter in het gat en beweeg de naald langzaam in de hersenen, totdat hij 7,2 mm dorsoventral bereikt, ten opzichte van dura. Laat de naald twee minuten in de eindpositie staan, zodat het weefsel een beetje kan bezinken, en injecteer vervolgens elke 30 seconden een microliter virale vectoren in de rechter substantia nigra, met een snelheid van 0,2 microliter. Laat de naald vijf minuten na de levering van virale vectoren in dezelfde positie staan en trek hem vervolgens langzaam terug.

Sluit de wond met een steriele zijden hechtdraad. Plaats de muis in de huiskooi, voorverwarmd door hem over een elektrisch warm matras te leggen. Beoordeel 12 weken na de stereotaxische operatie de motorische prestaties met behulp van een vereenvoudigde versie van de straaltest, die eerder is beschreven.

Gebruik hiervoor een horizontale balk van 25 cm lang en 3 cm breed. Het balkoppervlak moet worden bedekt door een metalen rooster met vierkanten van één centimeter en een centimeter boven de balk worden verhoogd. Maak een video van de muis, terwijl je de rasteroppervlakstraal doorkruist, van het ene uiteinde naar het andere uiteinde van de balk, waar de thuiskooi zich bevindt.

Train de muis gedurende twee dagen, vóór de bepaling van de motorprestaties. Train de muis op de eerste dag om vijf keer door de balk te lopen, zonder het raster. Train op de tweede dag de muis om vijf keer door de balk te lopen, in aanwezigheid van raster.

Evalueer op de derde dag de motorprestaties. Om dit te doen, kwantificeert u het aantal fouten dat is uitgevoerd, door de linkerpoten of door de rechtervoeten afzonderlijk, door de video's in een slow-motionmodus te bekijken. Om de muis te verdoven, injecteert u een mengsel van ketamine en xylazine intraperitoneaal.

Zodra de muis volledig is verdoofd, opent u de thorax met chirurgisch materiaal en stelt u het hart bloot. Steek vervolgens een naald met platte punt in de linkerkamer van het hart. Door de naald aan een pijp te koppelen, perfundeer 50 milliliter fosfaatbufferzoutoplossing, met een snelheid van 9,5 milliliter per minuut, met behulp van een peristaltische pomp.

Verwijder de hersenen met een schaar en pincet en fixeer het vervolgens door onderdompeling, in vijf milliliter 4% paraformaldehyde, in fosfaatbufferzoutoplossing. Plaats daarna de vaste hersenen, in 15 milliliter van 30% sucrose gedurende 48 uur. Plaats vervolgens de hersenen in vier milliliter cryoprotectie-oplossing en bewaar de hersenen op 80 graden, of gebruik het onmiddellijk in de volgende stap.

Om striatale plakjes te verkrijgen, snijdt u de hersenen in 40 micrometer dikke secties, beginnend bij 1,34 mm en eindigend bij 0,26 mm. Oogst elke plak in een cryobuis van twee milliliter, volgens anteroposteriorbevel. Om immunohistochemische en immunofluorescentieanalyse in het striatum uit te voeren, kiest u vijf coronale striatale secties met uniforme intervallen, die de volledige rostrocaudale omvang van de kern bestrijken.

Om de juiste afgifte van virale vectoren in de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route te valideren, werden vectoren die coderen voor GFP geïnjecteerd, in de substantia nigra, en 12 weken later werden de GFP-fluorescentie en tyrosinehydroxylase-immunoreactiviteit geanalyseerd in de substantia nigra en het striatum door immunofluorescentie. De GFP-geassocieerde fluorescentie bevond zich uitsluitend op de ipsilaterale plaats en een significante colocalisatie met tyrosinehydroxylase-immunoreactiviteit werd waargenomen in zowel substantia nigra als striatum, wat wijst op de juiste afgifte van virale vectoren in de dopaminerge neuronen van de nigrostriatale route. Om de dosis vectoren te testen, coderend voor synucleïne vereist, om een significante overexpressie van menselijk synucleïne te induceren die neurodegeneratie van de ninigrale dopaminerge neuronen bevordert, werden verschillende doses van de vectoren geïnjecteerd.

En 12 weken later werden de menselijke synucleïne-immunoreactiviteit en de mate van tyrosinehydroxylase-immunoreactiviteit getest in de nigrostriatale route. Humane synucleïne immunoreactiviteit was duidelijk, met alle doses getest in de substantia nigra. Echter, alleen muizen die 10 tot de 10 virale genomen per muis ontvingen, vertoonden duidelijke menselijke synucleïne immunoreactiviteit, in het striatum.

Muizen die 10 tot de 10 virale genomen per muis ontvingen van vectoren die coderen voor menselijk synucleïne, vertoonden een significant verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra. Hoewel muizen die dezelfde dosis vectoren kregen die coderen voor GFP, een lage mate van neuronaal verlies vertoonden, vertoonden deze muizen een significant lagere mate van neurodegeneratie, in vergelijking met die muizen die vectoren ontvingen, coderend voor menselijk synucleïne. Met behulp van de bundeltest werd uitsluitend bij die muizen een significante vermindering van de motorische prestaties gedetecteerd, waarbij 10 tot 10 virale genomen per muis van vectoren die coderen voor menselijk synucleïne werden ontvangen, bij het vergelijken van het aantal fouten van de rechter- en de linkerpoot, of bij het vergelijken van het totale aantal fouten, van muizen die vectoren ontvingen die coderen voor menselijk synucleïne, waarbij die muizen de controlevector ontvangen.

Om het begin van menselijke synucleïne-expressie te definiëren, werden muizen behandeld met 10 tot de 10 virale genomen per muis, van vectoren die coderen voor menselijk synucleïne of schijnchirurgie, en de mate van menselijke synucleïne-expressie werd geanalyseerd in de substantia nigra, eenmaal per week, gedurende weken twee tot vijf na de stereotaxische operatie. De resultaten tonen aan dat menselijke synucleïne-expressie duidelijk begon te worden in week vijf na de stereotaxische operatie. Om de piek van microgliale activering te bepalen, werd de mate van cellen die hoge niveaus van Iba1 tot expressie brachten, gekwantificeerd in het striatum van muizen, gedurende weken 2-15 na de operatie.

De resultaten tonen een significante toename van microgliale activering van de ipsilaterale kant, vergeleken met de contralaterale kant van muizen, 15 weken na de virale inenting. Het aantal regulerende T-cellen geïnfiltreerd in de substantiële nigra werd geanalyseerd op verschillende tijdstippen, na de stereotaxische chirurgie door immunofluorescentie, gevolgd door confocale microscopie-observatie. De piek van regulerende T-celinfiltratie in de substantia nigra werd waargenomen in week 11 na de operatie.

Het muismodel van neurodegeneratie dat hier wordt geanalyseerd, vertegenwoordigt een nuttig model om aantallen belangrijke aspectbetrokkenheid in de pathofysiologie van de ziekte van Parkinson te bestuderen. Betrokkenheidsmechanismen die betrokken zijn bij synucleïnepathologie, microgliale activering, de betrokkenheid van het perifere immuunsysteem, bij neuro-inflammatie en de mechanismen van neurodegeneratie Een juiste dosis adeno-geassocieerde virale vector, subtype vijf die codeert voor menselijk synucleïne om neurodegeneratie, neuro-inflammatie, T-celleninfiltratie en motorische stoornissen te induceren, is 10 tot de 10 virale genomen per muis. Deze studie toont aan dat vijf weken na de stereotaxische operatie een belangrijk tijdstip vormt, waarin menselijke synucleïne-expressie al duidelijk was, maar zonder motorische stoornissen in dit diermodel.

Daarbij vertegenwoordigt dit tijdspunt een interessant temporeel punt, om te beginnen met de toediening van experimentele therapieën die zijn toegesneden op het stoppen van de voortgang van neuro-inflammatie en neurodegeneratie. Het meest geschikte tijdstip om neuro-inflammatie in dit diermodel te analyseren, is in week 15 na een stereotaxische operatie. Terwijl een goed moment om T-cel infiltratie in het centrale zenuwstelsel te analyseren.

lijkt in week 11 na virale vectorinenting te zijn.