Residu-specifieke uitwisseling van Proline door Proline-analogen in fluorescerende eiwitten: hoe "moleculaire chirurgie" van de ruggengraat de vouwing en stabiliteit beïnvloedt

In de meeste gevallen is conventionele plaatsgerichte mutagenese niet geschikt om de functionele rol van prolines in eiwitten te bestuderen. Hier presenteren we een methode om proline-analogen als niet-canonieke aminozuren op te nemen in ribosomaal gesynthetiseerde eiwitten om de rol van prolineresiduen op eiwitvouwing en -functie te onderzoeken. De vervanging van prolines door standaard aminozuren is een riskante aanpak.

Integratie van proline analogen maakt een soort moleculaire chirurgie mogelijk. Met andere woorden, het introduceert subtiele moleculaire veranderingen om eiwiteigenschappen rationeel te beïnvloeden en te manipuleren. Aangezien prolineresiduen een essentiële rol spelen in de stabiliteit van eiwitsteigers, kan onze technologie nuttig zijn om de redenen achter eiwitvouwtekorten te begrijpen, die ten grondslag liggen aan bepaalde pathologische toestanden bij mensen.

De eiwitveranderingen geïnduceerd door proline-vervangingen hebben implicaties voor de biotechnologische engineering van enzymen en bieden mogelijkheden voor verbetering van ribosomale eiwitomzetting of -vouwing. Deze methode vereist geen speciale apparatuur en dure instrumentatie. Speciale zorg moet worden besteed aan protocolstappen, waarbij inheemse proline wordt uitgeput van E.coli-culturen voorafgaand aan de toevoeging van proline-analogen.

Om te beginnen met de productie van de fluorescerende eiwitten met inheemse proline, ent u 200 milliliter vers NMM-medium in een Erlenmeyer van twee liter met twee milliliter van de nachtcultuur. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker bij 220 RPM gedurende ongeveer 3,5 uur. Meet tijdens de incubatie elke 30 minuten de optische dichtheid op 600 nanometer in een spectrofotometer.

Wanneer de optische dichtheid 0,7 bereikt, draai je de celsuspensie naar beneden en decanteer je het supernatant voorzichtig in afval. Was vervolgens de cellen door opnieuw uit te geven in 50 milliliter ijskoude NMM zonder aminozuren of NMM zonder proline. Draai de cellen opnieuw en decanteer het supernatant in afval.

Vervolgens resuspendeert u de celkorrel door zachtjes te pipetteren in 200 milliliter NMM zonder proline en aangevuld met ampicilline in een Erlenmeyer van twee liter, en incubeer de cellen gedurende 30 minuten in een orbitale shaker om de volledige uitputting van proline mogelijk te maken. Voeg na incubatie een geschikt volume L-proline of de proline-analogen uit de 50-millimolar stock-oplossingen toe om een eindconcentratie van één millimol in de celsuspensie te verkrijgen. Induceer vervolgens doeleiwitexpressie door 500-micromolaire IPTG toe te voegen uit een één-molaire stamoplossing.

Druk het doeleiwit 's nachts uit bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker en meet de optische dichtheid de volgende dag. Verzamel de bacteriële cellen door centrifugering en decanteer het supernatant in afval. Was vervolgens de cellen door voorzichtig te pipetteren in 50 milliliter bindingsbuffer met 10% glycerol.

Draai de cellen opnieuw, decanteer het supernatant en bewaar de celkorrel in een buis van 50 milliliter bij min 20 of 80 graden Celsius tot verder gebruik. Voordat u de fluorescentie-emissie evalueert, voert u een SDS-PAGE uit om ervoor te zorgen dat de zuiverheid van het monster hoger is dan 95%, pas vervolgens de monsters van elke gezuiverde eiwitvariant aan tot een concentratie van 0,3 micromol, waarbij u de berekende absorptiewaarde op de juiste golflengte als referentie neemt. Zorg ervoor dat het uiteindelijke monstervolume bij benadering 200 microliter bedraagt.

Laat de verdunde monsters bij kamertemperatuur in evenwicht brengen. Breng de monsters na een uur over in een kwartscuvet van één centimeter en meet het fluorescentie-emissiespectrum van de monsters met behulp van een fluorescentiespectrometer. Om denaturatie te induceren, verdunt u de monsters van elke eiwitvariant twintigvoudig door de twee microliter van 300 micromolaire monsters toe te voegen aan 18 microliter 1,11x PBS-buffer met 8,89-molair ureum en 5,56-millimolar DTT.

Incubeer de monsters bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Verdun vervolgens de monsters 100-voudig door 1.980 microliter PBS toe te voegen die vijf millimolaire DTT bevat om renaturatie te induceren en breng onmiddellijk 200 microliter van de monsters over in een kwartscuvet van één centimeter. Plaats het kwartscuvet in een geschikte fluorescentiespectrometer en controleer het opnieuw vouwen van eiwitten door elke drie seconden gedurende 30 minuten een fluorescentiespectrum te verkrijgen.

Breng de hervouwmonsters over in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter, sluit vervolgens het deksel en bewaar de monsters bij kamertemperatuur in het donker om een volledige hervouwing van EGFP-varianten mogelijk te maken. Meet na 24 uur de fluorescentie-emissie van de opnieuw gevouwen eiwitmonsters met dezelfde excitatiegolflengte als voorheen om het temporele eindpunt van fluorescentieherstel vast te leggen. Pellets van cellen die inheemse eiwitten tot expressie brengen en varianten met S-fluoroproline en dehydroproline hadden een typische heldere kleur vanwege de intacte chromofoor.

Daarentegen bleven varianten die R-fluoroproline en difluoroproline bevatten kleurloos, wat wijst op verkeerd vouwen en afzetting van ongevouwen eiwit in inclusielichamen. SDS-PAGE-analyse verifieerde de aanwezigheid van onoplosbare R-fluoroproline-bevattende eiwitten. Daarentegen werden inheemse eiwitten en S-fluoroproline- en dehydroproline-dragende varianten gevonden in de oplosbare fracties.

In vloeistofchromatografie/massaspectrometrie-analyse produceerde elke prolinevervanging door S-fluoroproline een positieve 18-daltonverschuiving per prolineresidu, terwijl vervanging door dehydroproline een negatieve verschuiving van twee dalton per residu opleverde. In lichtabsorptie- en emissiespectra werd chromofoorabsorptie gevonden bij 488 nanometer voor EGFP en 493 nanometer voor NowGFP. In KillerOrange bestond het chromofoorabsorptiegebied uit twee banden die overeenkomen met twee mogelijke configuratie- en ladingstoestanden van de complexe chromofoor.

Verder impliceerden fluorescentiespectra geregistreerd bij excitatie op de overeenkomstige maximale absorptiegolflengten dat de analogen de chemische omgeving van de chromoforen niet veranderden. In hervouwexperimenten herstelde de inheemse EGFP-chromofoorfluorescentie gedeeltelijk, hoewel de tryptofaanspecifieke fluorescentie groter was na renaturatie. Vergelijkbaar gedrag werd waargenomen voor de variant die dehydroproline bevat.

In EGFP-bevattende S-fluoroproline werd een vergelijkbaar resultaat waargenomen met een excitatie van 295 nanometer, terwijl fluorescentie in veel hogere mate herstelde bij 488 nanometer. Alleen de EGFP-varianten vertoonden een snelle hervouwkinetiek waarbij tryptofaanemissieterugwinning twee keer zo snel was in vergelijking met de chromofooremissie. Er moeten verse bacterieculturen met geschikte groeimedia worden gebruikt.

Steriele technieken en regelmatige monitoring van de cultuurgroei zijn ook belangrijke voorwaarden voor het succes van het experiment. Deze methode is van toepassing op eiwittechnologie, omdat het de rol van andere canonieke aminozuren kan bestuderen. Hiervoor zijn geschikte auxotrofische E.coli-stammen en aminozuuranalogen nodig.

Massaspectrometrie van hele eiwitten is vereist als analytisch bewijs om de opname van niet-canonieke aminozuuranalogen te bevestigen. De SPI-methode voor het opnemen van proline-analogen stelt ons in staat om de eiwitbackbone direct te manipuleren en biedt voordelen voor rationeel ontwerp en vergemakkelijkte productie van eiwitten door wereldwijde stabilisatie en verbetering van ribosomale translatie of vouwing.