Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

De borstklier is zeer dynamisch en ondergaat meerdere rondes van remodellering gedurende het hele leven. Ons protocol maakt het mogelijk om de cellulaire dynamiek vast te leggen die weefselherschikkingen in de gezonde en zieke borstklier aandrijft. Ons borstbeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel maakt het mogelijk om longitudinale intravitale beeldvorming van de borstklier uit te voeren gedurende lange perioden, tot enkele weken.

Het vervangbare deksel van het borstbeeldvormingsvenster zorgt te allen tijde voor optimale beeldvormingsomstandigheden en maakt weefselmanipulatie of toediening van geneesmiddelen tussen beeldvormingssessies mogelijk. Onze methode biedt niet alleen inzicht in gezonde borstklierbiologie, maar stelt ons ook in staat om borsttumorinitiatie en progressie op eencellig niveau te bestuderen. Begin met het plaatsen van het deksel van het borstbeeldvormingsvenster op een steriel oppervlak en breng cyanoacrylaatlijm aan rond de hele randomtrek van het randdeksel.

Plaats voorzichtig een 10 millimeter ronde glazen afdekplaat op de bovenkant van het deksel. Gebruik een steriele houten stok om de glazen afdekselslip te positioneren en oefen wat kracht uit om deze naar beneden te duwen om te zorgen voor een luchtdichte afdichting tussen de glazen afdekselslip en het frame van het deksel. Zorg ervoor dat het glas de gaten in de armen van het deksel niet bedekt.

Desinfecteer de deksels en het melkbeeldvenster door ze gedurende ten minste 30 minuten onder te dompelen in 80% ethanol in een gesloten petrischaal. Gebruik een in aceton gedrenkte wattenpunt om de overtollige cyanoacrylaatlijm op de glazen afdekslip te verwijderen. Om de muis voor te bereiden op een operatie, scheert u het gebied rond de vierde borstklier met behulp van een scheermesje.

Gebruik de vierde tepel als oriëntatiepunt en verwijder de losse haren met plakband. Voer een poottrektest uit om te controleren of het dier voldoende verdoofd is. Til de huid voorzichtig op met een fijne Graefe-tang en gebruik een kleine veerschaar om een diagonale incisie van 10 tot 15 millimeter in de huid te maken bovenop het vierde borstvetkussen Gebruik de vierde tepel als oriëntatiepunt en zorg ervoor dat u het peritoneum of de borstklier niet snijdt of beschadigt.

Scheid de huid van het borstvetkussen en de onderliggende weefsellagen met behulp van stompe dissectie van maximaal vijf tot acht millimeter rondom de incisielijn om een zak te creëren die past bij het raamkozijn van de borstbeeldvorming. Definieer de regio van belang, of ROI, op basis van de macroscopische kenmerken van het borstweefsel, inclusief de locatie van de lymfeklier of een tumorlaesie. Probeer de ROI centraal te houden met betrekking tot de incisie.

Pak het borstbeeldvormingsvenster op met een steriele tang en test of de incisie groot genoeg is om het venster in te brengen. Vergroot indien nodig de incisie iets totdat het borstbeeldvormingsvenster erin past. Verwijder het venster en gebruik een 5-0 zijden hechtdraad om een tassnaarnaad op één tot twee millimeter afstand van de rand van de incisie te plaatsen, beginnend bij het caudale uiteinde en van buiten naar binnenkant van de huid.

Beweeg ongeveer vijf millimeter omhoog langs de incisie en laat de hechtdraad door de huid van binnen naar buiten gaan. Herhaal deze procedure langs de rand van de incisie, waardoor een cirkelvormige hechting ontstaat die bestaat uit vijf tot zes lussen. De uiteindelijke uitgang van de hechtdraad moet zich op ongeveer twee tot vijf millimeter afstand van de eerste ingang bevinden.

Plaats het borstbeeldvormingsvenster in de incisie en gebruik de Graefe-tang om de huid voorzichtig in de groef van het raam te plaatsen. Zorg ervoor dat u de lussen van de hechting buiten laat. Trek aan de lussen van de touwbevestiging van de portemonnee en trek voorzichtig aan beide uiteinden van de hechtdraad om deze in de groef van het borstbeeldvormingsvenster aan te spannen.

Knoop af met chirurgische knopen en knip de overtollige draad weg. Gebruik een tandenstoker om vaseline op de binnenrand van het raam aan te brengen en vermijd het onderliggende weefsel. Duw het raamkozijn voorzichtig naar beneden met een steriele tang en plaats het deksel in het raamkozijn.

Dit voorkomt een hoeveelheid lucht tussen het borstklierweefsel en het raamdeksel van de borstbeeldvorming. Plaats de uiteinden van de dunne tang door de gaten in de armen van het deksel en draai het deksel vast door het met de klok mee te draaien. Als er wat lucht overblijft na het aanspannen van het deksel, breng dan een steriele insulinenaald door de huid in de holte tussen het borstweefsel en het deksel en trek langzaam de zuiger eruit, waardoor een vacuüm ontstaat tussen het borstklierweefsel en het vensterdeksel van de borstbeeldvorming.

Nu kan de lymfeklier gemakkelijk worden waargenomen na deze procedure. Inspecteer de staat van het raamkozijn en het deksel, inclusief de stabiliteit van de hechtingen of mogelijke schade aan het deksel. Plaats de muis op de inlay zodanig dat het borstbeeldvormingsvenster in het gat van de inlay van de afbeeldingsdoos valt.

Breng semi-transparante en papieren tape aan op de achterkant van de muis om de muis te stabiliseren en de beweging van het weefsel als gevolg van ademhaling te verminderen. Voor beeldvormingssessies van meer dan drie uur plaatst u een flexibele naald subcutaan in de nek van de muis en bevestigt u deze met papieren tape. Bevestig een spuit van 10 millimeter met een voedingsmix aan een flexibele siliconenbuis en duw de voedingsmix totdat deze het einde van de buis bereikt.

Sluit de siliconenbuis aan op de flexibele naald en injecteer elke 30 minuten 50 microliter van de geïnfundeerde oplossing. Plaats het deksel op de afbeeldingsdoos om deze te sluiten. Bevestig vervolgens de beelddoos in het stadium van de microscoop.

Controleer of de muis stabiel is in de afbeeldingsdoos. Definieer het interessegebied met behulp van de epifluorescentiemodus van de microscoop en pas de microscoopinstellingen toe. Gebruik de spiral-functie in de navigatormodus van de imaging-software om een grote overzichtstegelscan te genereren en een referentiekaart van het weefsel te maken.

Definieer de interesseregio in het overzicht Spiraal en definieer vervolgens de bovenste en onderste Z-vlakken om de Z-stack te bepalen. Druk op Start om de gedetailleerde driedimensionale of vierdimensionale Z-stapels van het weefsel te verkrijgen. Plaats de uiteinden van de dunne tang door de raamgaten in de armen van het deksel en maak het deksel los door tegen de klok in te draaien.

Als alternatief kan het weefsel worden gemanipuleerd of geherpositioneerd met behulp van steriele stompe tangen om de beeldvormingsomstandigheden voor de specifieke regio van belang te optimaliseren. Breng vaseline aan op de binnenrand van het borstbeeldvormingsvenster en vermijd het onderliggende weefsel. Duw het raamkozijn voorzichtig naar beneden met een steriele tang en plaats het deksel in het raamkozijn.

Plaats ten slotte de uiteinden van de dunne tang door de gaten van de armen van het deksel en verlicht het deksel door het met de klok mee te draaien. Puberale Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membraan tomatenmembraan GFP muizen werden geïnjecteerd met een lage dosis tamoxifen, wat leidde tot Cre-gemedieerde recombinatie van het Rosa26-membraan tomatenmembraan GFP-allel. De muizen werden op dag één, drie en vijf in beeld gebracht om de dynamische veranderingen in de zich ontwikkelende borstklier te volgen.

De representatieve afbeeldingen tonen de 3D-weergave van een langwerpig en vertakkend borstkanaal gedurende meerdere dagen, afgebeeld door een mammabeeldvormingsvenster. Enkele Z-vlak afbeeldingen van de vertakkende punt en de langwerpige tak worden hier getoond. Afzonderlijke cellen in het stroma worden gemarkeerd door witte sterretjes.

De representatieve afbeeldingen tonen de inguinale lymfeklier van de muis afgebeeld door een borstbeeldvormingsvenster. De tweede harmonische generatie is in het groen afgebeeld. 3D-gerenderde afbeeldingen van een borstkanaalstructuur van een volwassen vrouwelijke E-cadherine membraan CFP-muis gedurende meerdere opeenvolgende dagen worden hier getoond.

Het collageen I-patroon werd gebruikt om dezelfde ROI te traceren en het E-cadherinemembraan CFP-signaal werd gebruikt om de ductale cellen te markeren. Kikume groenrode muizen werden afgebeeld op dag nul voor en na blootstelling aan violet licht. De beeldvormingssessies werden herhaald op dag twee, zes en 10 na conversie.

Hetzelfde gebied van de borstklier werd gedurende 10 dagen in beeld gebracht door een mammabeeldvormingsvenster. Kleinere regio's werden op dag nul omgerekend en vertoonden een vergelijkbare verdunningssnelheid van het Kikume-rode signaal in de loop van de tijd, wat wijst op een gelijke omloopsnelheid in het epitheel. Zoombeelden van de aangegeven gebieden tonen proliferatieve heterogeniteit op cellulair niveau zes en 10 dagen na fotoconversie.

Kwantificering van de rood-groene verhouding van verschillende cellen 10 dagen na fotoconversie onthulde zeer variabele verdunningssnelheden van sommige cellen binnen dezelfde ductale micro-omgeving. Een cruciale stap van deze procedure is het openen van het deksel tussen de beeldvormingssessies door. Dit unieke kenmerk van het venster verbetert de beeldvormingsomstandigheden en maakt longitudinale beeldvorming van het weefsel mogelijk.

Het borstbeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel zal nieuwe vragen vergemakkelijken met betrekking tot in vivo, snelwerkende drugstests en screening op het gebied van tumorinitiatie en progressie in de borstklier van de muis.