2-fotonenmicroscopie gebruiken om de effecten van chronische unilaterale ureterale obstructie op glomerulaire processen te kwantificeren

In de gegevens die in deze studie worden gepresenteerd, tonen de dramatische effecten van unilaterale ureterale obstructie op de nierfunctie, ontsteking en fibrose. Het helpt ons om de pathofysiologische mechanismen van unilaterale ureterale obstructie te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om cel-celinteracties, subcellulaire gebeurtenissen te bestuderen en structuur en functie op een dynamische manier te associëren binnen een functionerende nier.

Het demonstreren van de ureterale procedure zal worden gedaan door Dr.Silvia Campos-Bilderback, een chirurg in ons laboratorium. Verdoof de rat om te beginnen, maak vervolgens een incisie langs de middellijn en lokaliseer de linker nier om deze te scheiden van de omliggende peritoneale organen. Na het lokaliseren van de nierpikel, bestaande uit de nierslagader, nierader en urineleider, scheidt u de urineleider zonder de delicate structuur te beschadigen.

Gebruik een tang om een 3-0 hechting rond de urineleider te lusen en bind vervolgens een knoop van een paar millimeter aan weerszijden van de eerste knoop om volledige obstructie te garanderen. Zodra de urineleider is vastgebonden, sluit u voorzichtig de opeenvolgende spierlagen en sluit u de buik volledig. Sluit de buitenste huid met chirurgische nietjes.

Voor chirurgische voorbereiding plaatst u de verdoofde rat met een inwonende veneuze toegangslijn aan de zijkant met de geschoren linkerflank plat en recht op de tafel gericht. Zorg ervoor dat de voorpoten van de rat elkaar raken, net als de achterpoten. Zodra de rat is gepositioneerd, palpeer je de linkerflank net onder de ribben om voor de nier te voelen en de natuurlijke positie in de buik te bepalen, trek dan een lijn met behulp van een permanente marker langs het geschoren gebied, waarbij het niercentrum in een neus-tot-staart oriëntatie wordt doorsneden.

Gebruik een getande tang om de huid vast te pakken en op te tillen en knijp de permanente markerlijn samen met een paar hemostaten om de onderliggende vasculatuur te verpletteren en bloedingen te voorkomen. Herhaal de procedure voor de dunne buitenste spierlaag om bloedingen te minimaliseren. Om de uiteindelijke incisie van de dunne binnenste buikspierlaag te maken, palpeert u de nier om de grootte en positie te schatten en tilt u de binnenste spierlaag op met een tang, en verplettert u vervolgens een lijn die de huid boven de nier doorsnijdt met de hemostaten die ongeveer 1/3 van de geschatte grootte van de nier is.

Terwijl u de grip op de spierlaag met de tang behoudt, maakt u de laatste incisie. Gebruik vervolgens een tang in elke hand om het niervet aan de onderkant van de nier vast te pakken en vast te houden met een hand-over-handtechniek die naar beneden werkt. Met één hand stevig grip op het vet, trek je aan het vet en knijp je heel voorzichtig de nier door de incisie.

Als de nier niet doorgaat, verbreedt u de incisie gemakkelijk. Om de witte bloedcellen of WBC's in de capillaire lussen te identificeren, dient u Hoechst 33342 kernvlek toe met 8 microgram per kilogram rattengewicht via een inwonende veneuze toegangslijn. Plaats op de microscoop de blootgestelde nier met een lichte rotatie tegen de rand van de schaal, zodat de buikzijde van de nier contact maakt met de afdekslip en de dorsale kant weg van de rand is gericht.

Om de beweging verder te minimaliseren, pak je twee steriele 2-bij-2 gaasjes in, bevochtigd met zoutoplossing tegen de dorsale kant van de nier, waardoor het contact van de buikzijde van de nier tot aan de rand wordt versterkt. Wanneer het monster is gepositioneerd, kijkt u door het microscoopoculair onder epifluorescentieverlichting met behulp van een dual-pass rhodamine FITC-kubus. Als er een beweging wordt gedetecteerd in de monsterpositie, breng dan kleine aanpassingen aan door het gaas aan te passen zodat het niet onder de nier duwt.

Rol de rat iets om zodat de thorax verder van de schaal af staat. Scan het oppervlak van de nier met behulp van epifluorescentieverlichting en markeer de glomeruliposities met behulp van de software die is gekoppeld aan de gemotoriseerde podiumcontroller. Neem voor elk kleurkanaal onder 2-fotonverlichting een ondiep 3D-volume van het bovenste gedeelte van elke gemarkeerde glomerulus om als achtergrondafbeelding te dienen.

Gebruik in de weergaveoptie van de beeldvormingssoftware een pseudo-kleurenpalet om de zwakke intensiteiten van de achtergrondfluorescentie van de glomerulaire capillaire lussen te visualiseren. Gebruik een oppervlakkig bloedvat als brandpunt en infundeer langzaam het fluorescerende Texas Red RAP-serumalbumine of TRRSA terwijl u de opkomst en ondergang van fluorescentie als gevolg van de systemische distributie observeert totdat een intensiteit in de peritubulaire vasculatuur en capillaire lussen net onder de verzadiging ligt. Verkrijg na 10 minuten 3D-volumes voor alle gemarkeerde en afgebeelde glomeruli met intervallen van 1 micrometer.

Zoek een geschikt vat, een capillaire lus of een peritubulair vat, en roteer vervolgens het beeld met behulp van de functie Roteren, omdat de functie Line Scan in de beeldacquisitiesoftware vereist dat het vat loodrecht staat. Zodra het vat is gedraaid en plat ligt, selecteert u de XT-functie in het menu Acquisitie en stelt u deze in om 4.000 lijnen te scannen. Plaats de lijn over het te onderzoeken vat met het brandpuntsvlak op de maximale diameter van het segment.

Klik vervolgens met de linkermuisknop op de samengestelde kleurenafbeelding en selecteer het tabblad Momentopname maken om een referentieafbeelding te genereren van het gebied waar de lijnscan is gemaakt. Klik onmiddellijk op de knop Start om de lijnscan van het schip vast te leggen. Importeer later de lijnscans in de beeldverwerkingssoftware om het RBC-debiet te bepalen.

Open in het vervolgkeuzemenu Meten het dialoogvenster Regiostatistieken weergeven en selecteer het gereedschap Tekening met één lijn om een lijn te tekenen die overeenkomt met de helling van de RBC-schaduwen. Nadat u de breedte en hoogte van de lijn hebt genoteerd, gebruikt u een vergelijking om de snelheid te berekenen en vervolgens een gemiddelde van vijf berekeningen te verkrijgen om de snelheid voor elke lijnscan te rapporteren. Centreer een glomerulus in het beeldvormingsveld en neem een 3D-dataset die begint bij het glomerulaire oppervlak en eindigt bij 30 tot 35 micrometer.

Gebruik een stapgrootte van 1 micrometer in de Z-richting. Identificeer de WBC's door het blauwe Hoechst-kanaal te vergelijken met het Texas Red-albuminekanaal door te zoeken naar uitsluiting van rode kleurstof in de capillaire lus en een overeenkomstige nucleaire vlek. Als de WBC's statisch lijken over drie optische secties, definieert u de cellen als gehecht en rapporteert u de waarden als voorkomend per 10 optische secties vanaf de bovenkant van de glomerulus genomen met intervallen van 1 micrometer.

Het aantal glomerulaire per veld in München Wistar Fromter- of MWF-ratten was verhoogd in de 5-weekse UUO-groep dan in onbehandelde ratten. Sprague-Dawley-ratten, of SD-ratten, gingen van geen oppervlakteglomeruli naar 2,02 per veld na vijf weken van de unilaterale ureterale obstructie. Driedimensionale gereconstrueerde beelden werden waargenomen om het nieroppervlak te bekijken.

De unilaterale uretale obstructie van 5 weken bij de SD-ratten resulteerde niet in gebieden die leken op normale buisvormige epithelia zoals gezien in de MWF, onbehandeld en gedeeltelijk bij 5-weekse UUO MWF-ratten. In de studie van de renale vasculaire dynamica was de renale bloedstroom significant verminderd in de 5-weekse UUO MWF- en SD-groepen in vergelijking met onbehandelde ratten. De RBC-snelheid binnen de glomerulaire capillaire lussen was significant afgenomen bij de 5-weekse UUO MWF en SD-ratten in vergelijking met onbehandelde MWF-ratten.

Bovendien hadden onbehandelde MWF-ratten minder WBC's per 10 optische secties vanaf de top, terwijl het aantal toenam in 5-weekse UUO MWF- en 5-weekse UUO SD-ratten. Bij unilaterale uretale obstructie werd een toename van de albuminedoorlaatbaarheid waargenomen. Een albumine accumulatie in de Bowman ruimte was intens na unilaterale uretal obstructie.

Het S1-segment endocytose grote hoeveelheden albumine zoals waargenomen met fysiologische omstandigheden bij onbehandelde MWF-ratten. Dezelfde opname kon niet worden gezien bij de MWF- of SD-ratten na 5 weken unilaterale uretale obstructie. Veel verschillende methoden zoals herhaalde beeldvorming om een proces in de loop van de tijd te bestuderen, fixatie van een specifiek gebied voor beeldvorming en vervolgens gebruik van het vaste weefsel om microscopie met een hogere resolutie uit te voeren, kunnen in combinatie met deze techniek worden gedaan.

De techniek wordt beschouwd als disruptieve technologie. Het stelt onderzoekers in staat om veel nieuwe vragen te beantwoorden. Daarbij zijn nieuwe inzichten verschaft en paradigmaverschuivingsgegevens verkregen.