Snelle inkapseling van gereconstitueerd cytoskelet in gigantische unilamellaire blaasjes

In de afgelopen jaren is inkapseling in lipide bilayer blaasjes ter grootte van cellen een nuttige methode gebleken voor in vitro reconstitutie-experimenten. De methode die we presenteren zal enorm helpen bij cytoskeletreconstructie in synthetisch celonderzoek. Met deze methode kunnen we heterogene gigantische unilamellaire blaasjes met een hoge opbrengst genereren.

De generatietijd van de blaasjes is aanzienlijk verminderd in vergelijking met de conventionele cDICE-techniek. We kunnen celvrije transcriptie-translatiesystemen inkapselen die geïsoleerd zijn van complexe, gelijktijdig optredende cellulaire processen om moleculaire routes te onderzoeken. Deze methode kan worden gebruikt om minimale protocellen samen te stellen voor het creëren van functionele synthetische cellen.

Begin met het bereiden van een olie-lipidenmengsel door dioleoyl-fosfocholine, cholesterol en rhodamine PE over te brengen naar een glazen injectieflacon van 15 milliliter. Voeg vervolgens 0,5 milliliter chloroform toe aan de injectieflacon. Pipetteer 7,2 milliliter siliconenolie en 1,8 milliliter minerale olie in een aparte buis van 15 milliliter en meng de oliën door te vortexen met een snelheid van 3.200 rotaties per minuut gedurende 10 seconden.

Voeg vervolgens het oliemengsel toe aan de injectieflacon met het lipide- en chloroformmengsel en vortex het mengsel met een snelheid van 3.200 rotaties per minuut gedurende 10 tot 15 seconden totdat het resulterende lipiden-in-oliemengsel enigszins troebel is, omdat de lipiden niet volledig in de olie zijn opgelost. Soniceer vervolgens het lipide in oliedispersie in een badsonicator met een ultrasoon vermogen van 80 watt en een werkfrequentie van 40 kilohertz gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Als het niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaart u het lipide-oliemengsel gedurende 24 uur bij vier graden Celsius.

Om de blaasjes te genereren, gebruikt u de assemblage met een 3D-geprinte as gemaakt van zwarte hars gemonteerd op de roerplaat op de bank met een snelheid van 1.200 rotaties per minuut. Monteer vervolgens de 3D-geprinte continue druppelinterface kruisingsinkapseling, of cDICE-kamer, gemaakt van de heldere hars op de zwarte harsas. Bereid 1 tot 10 micromolaire actine-oplossing in bolvormige actinebuffer of G-buffer, inclusief 10% ATO 488 actine.

Om de actinepolymerisatie te beginnen, voegt u filamenteuze actinepolymerisatiebuffer of F-buffer toe in actineoplossing op ijs en houdt u de oplossingen vervolgens op ijs om de actinepolymerisatie te vertragen voordat u een crosslinker toevoegt. Om de actinebindende eiwitten, of ABPs, te bereiden uit 1,75 milligram per milliliter fascinvoorraad, aliquot 1,57 microliter fascin in een aparte microbuis. Voeg vervolgens 7,5% van het dichtheidsgradiëntmedium toe aan de actine-oplossing om een dichtheidsgradiënt te creëren tussen de buitenste en de binnenste waterige fase en gigantische unilamellaire blaasjes of GUVs, sedimentatie te vergemakkelijken.

Geef vervolgens 700 microliter 200 millimolar glucose als de buitenste oplossing in de kamer. Voeg voldoende lipide-oliemengsel toe aan de kamer totdat 60% tot 80% van de kamer is gevuld. Er zal een interface worden gevormd tussen het lipide-oliemengsel en de buitenoplossing.

Bereid een actine-ABP-mengsel door ABPs over te brengen in de actine-oplossing. Gebruik vervolgens een gewone pipet van 100 tot 1.000 microliter om de 700 microliter van het lipide-oliemengsel over te brengen in het actine-ABP-mengsel. Pipetteer acht keer op en neer om celgrote lipide monolaag emulsiedruppels met een diameter van 7 tot 100 micron te genereren.

Gebruik dezelfde pipet van 100 tot 1.000 microliter om de volledige emulsie in de roterende kamer te doseren. De druppels zullen een tweede deel van lipiden verkrijgen door de lipide monolaag op het grensvlak tussen olie en buitenoplossing te kruisen, waardoor GUV's worden gevormd. Als u klaar bent, verwijdert u de kamer van de roerplaat en gooit u het grootste deel van het lipide-oliemengsel weg door de kamer in de afvalcontainer te kantelen.

Door de kamer met het deksel naar binnen te houden, opent u het kamerdeksel en kantelt u de kamer enigszins naar binnen. Het raakvlak tussen de buitenoplossing met GUVs en het lipide-oliemengsel is zichtbaar vanuit de kameropening waar het deksel zich bevindt. Gebruik een pipet om voldoende buitenoplossing met GUV's te verzamelen en doseer 50 tot 300 microliter van de buitenoplossing in een 96-putplaat om een geschikte dichtheid van GUVs te verkrijgen.

Voor het in beeld brengen van de GUVs, installeert u de 96-well plaat op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust met een olie-onderdompeling 60X objectieflens. Open een interessante afbeeldingsreeks in een beeldverwerkingssoftware, ImageJ Fiji, en identificeer de afbeelding met de hoogste intensiteit. Houd Control Shift C ingedrukt om het helderheids- en contrastvenster te openen en klik op het tabblad Opnieuw instellen.

Ga in het menu ImageJ Fiji naar de tabbladen Analyseren en Schaal instellen om de bekende fysieke afstand en eenheid voor elke afbeeldingspixel in te voeren. Als u klaar bent, gaat u naar de knoppen Afbeelding, Stapels en vervolgens 3D-project om een 3D-afbeelding uit de Z-stapel te reconstrueren. Stel de projectiemethode in als Helderheidspunt, Segmentafstand als 0,5 micrometer en vink het selectievakje Interpoleren aan.

Gebruik de standaardopties voor de rest van de instellingen en leg afbeeldingen vast. De representatieve afbeelding toont een confocale afbeelding van rhodamine PE-gelabelde GUVs met ingekapselde fascin-actinebundels. Het overbrengen van de actinebindende eiwitten in de actine-oplossing, vervolgens het toevoegen van lipide-oliemengsel en het genereren van lipide monolaagdruppels moet binnen enkele seconden plaatsvinden om de vorming van actinenetwerken vóór de inkapseling te voorkomen.

We hebben deze aangepaste cDICE-techniek gebruikt om de rollen van verschillende actinenet cross-linkers bij het organiseren van actinenetwerken te onderzoeken. We verwachten dat deze methode andere onderzoekers zal helpen om de regulatie van andere cytoskeleteiwitten te onderzoeken.