Name: Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Leer de extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever. Deze methode behoudt de fysiologische vouw en katalytische activiteit van het eiwit voor biochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn erg dankbaar voor de technische assistentie van Ayse Öztürk en Eva Albertini. Muizen die werden gebruikt voor het genereren van leverweefsel werden onderhouden onder toezicht van Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituut voor Biomedisch Verouderingsonderzoek aan de Universiteit van Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Oostenrijk).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).</li>
<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

Kritieke stappen in het protocol Het volgen van gemeenschappelijke richtlijnen voor de omgang met eiwitten is essentieel, zoals werken op ijs en bij matige pH- en zoutcondities. Het gebruik van proteaseremmers is gunstig voor de methode, terwijl het gebruik van proteasoomremmers ten zeerste wordt aanbevolen. Het invriezen en ontdooien van het monster kan altijd leiden tot eiwitprecipitatie (ten minste gedeeltelijk), dus elk ontdooide aliquot van initieel eiwitlysaat (stap 2) moet continu worden verwer...

Het eukaryote FAH-domeinbevattende eiwit 1 (FAHD1) werkt als bifunctioneel oxaalacetaat (OAA) decarboxylase (ODx)1 en acylpyruvaathydrolase (ApH)2. Het is gelokaliseerd in mitochondriën2 en behoort tot de brede FAH-superfamilie van enzymen 1,2,3,4,5,6. Hoewel de ApH-activiteit slechts van ondergeschikt belang is, is de ODx-activiteit van FAHD1 betrokken bij de regulatie van de TCA-cyclusflux 1,7,8,9. OAA is niet alleen nodig voor de centrale citraatsynthasereactie in de tricarbonzuurcyclus, maar fungeert ook als een competitieve remmer van succinaatdehydrogenase als onderdeel van het elektronentransportsysteem en als een kataplerotische metaboliet. Downregulatie van FAHD1-genexpressie in menselijke navelstrengas endotheelcellen (HUVEC) resulteerde in een significante vermindering van de snelheid van celproliferatie10 en significante remming van mitochondriaal membraanpotentiaal, geassocieerd met een gelijktijdige omschakeling naar glycolyse. Het werkmodel verwijst naar mitochondriale disfunctie geassocieerde senescentie (MiDAS)11-achtige fenotype8, waarbij mitochondriale OAA-niveaus strak worden gereguleerd door FAHD1-activiteit 1,8,9.
Recombinant eiwit is gemakkelijker te verkrijgen via expressie en zuivering van bacteriën12 in plaats van uit weefsel. Een eiwit dat tot expressie komt in bacteriën kan echter bevooroordeeld zijn door mogelijk gebrek aan posttranslationele modificaties, of kan eenvoudigweg problematisch zijn (d.w.z. als gevolg van plasmideverlies, bacteriële stressreacties, vervormde / ongevormde disulfidebindingen, geen of slechte secretie, eiwitaggregatie, proteolytische splitsing, enz.). Voor bepaalde toepassingen moet eiwit worden verkregen uit cellysaat of weefsel, om dergelijke modificaties op te nemen en/of mogelijke artefacten uit te sluiten. Gezuiverd eiwit uit weefsel ondersteunt de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en/of krachtige en specifieke farmacologische remmers voor geselecteerde enzymen, zoals voor FAHD113.
Dit manuscript presenteert een reeks methoden voor de extractie en zuivering van FAHD1 uit varkensnieren en muizenlever. De beschreven methoden vereisen snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC), maar maken verder gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Alternatieve methoden zijn elders te vinden 14,15,16,17. Na totale eiwitextractie omvat het voorgestelde protocol een testfase, waarin subprotocollen voor ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie worden besproken (figuur 1). Na het definiëren van deze subprotocollen wordt het eiwit van belang geëxtraheerd via een sequentiële strategie met behulp van ionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie met FPLC. Op basis van deze richtlijnen kan het uiteindelijke protocol individueel worden aangepast voor andere eiwitten van belang.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg"> Figuur 1: De algemene strategie van dit protocol. Van boven naar beneden: Eiwit wordt gewonnen uit weefsels. Weefselhomogenaat wordt bereid, gecentrifugeerd en gefiltreerd. Voor elk paar supernatant- en pelletmonsters moeten tests voor ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie (FPLC) worden uitgevoerd om optimale omstandigheden te onderzoeken. Na het vaststellen van deze subprotocollen kan het eiwit worden geëxtraheerd via een sequentiële procedure van ammoniumsulfaatprecipitatie, ionische uitwisselingschromatografie en repetitieve grootte-uitsluitingschromatografie (FPLC) bij verschillende pH- en zoutconcentraties. Alle stappen moeten worden gecontroleerd door western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

```html
<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m filter units</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0.22 &micro;m, PES 33 mm, niet steriel</td></tr><tr><td>0.45 &micro;m filter units</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0.45 &micro;m, PES 33 mm, niet steriel</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>centrifugaalbuizen</td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>centrifugaalbuizen</td></tr><tr><td>96-Well UV Microplate</td><td>Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>UV/VIS transparante platte bodem 96 well platen</td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3,3% crosslinker) oplossing voor het gieten van polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>&Auml;KTA FPLC system</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>-</td><td>gebruikmakend van het FPLC systeem van GE Healthcare; er bestaan verschillende aangepaste versies; dit werk gebruikte het "&Auml;KTA pure" systeem</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>centrifugale filters voor eiwitverrijking; 10 kDa moleculair massa filter; 15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC801024</td><td>centrifugale filters voor eiwitverrijking; 10 kDa moleculair massa filter; 4 mL</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate powder</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>ammoniumsulfaat voor moleculaire biologie, &ge;99,0%</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat reagent grade, 98%</td><td>MERCK</td><td>215589</td><td>Katalysator voor acrylamide gel polymerisatie.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant blue R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) voor elektroforese Handelsmerk van Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 &deg;C)</td></tr><tr><td>Dialysis tubing cellulose membrane</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>Cellulose membranen voor het uitwisselen van buffers via dialyse.</td></tr><tr><td>Eppendof tubes 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>microcentrifugale buisjes; geautoclaveerd</td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>28989334</td><td>HiLoad Superdex 75 pg voorgevulde kolommen zijn voor hoogwaardige scheiding van eiwitten door grootte-uitsluitingschromatografie</td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membrane</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>PVDF membranen zijn eiwitblot membranen geoptimaliseerd voor fluorescente en multiplex fluorescente toepassingen.</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>Gebruik de Mini Trans-Blot Cell voor snel blotten van Mini-PROTEAN voorgevormde en handgemaakte gels.</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>4-gel verticale elektroforese systeem, inclusief elektrodenassemblage, begeleidende draaimodule, tank, deksel met stroomkabels, mini cell buffer dam.</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Mono Q kolommen zijn sterke anion uitwisselingschromatografie kolommen voor eiwitanalyse of kleinschalige, hoge resolutie verfijning van eiwitten.</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Mono S kolommen zijn sterke kation uitwisselingschromatografie kolommen voor eiwitanalyse of kleinschalige, hoge resolutie verfijning van eiwitten.</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 tot 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>Een mengsel van 10 blauw-, oranje- en groen-gekleurde eiwitten (10 tot 180 kDa) voor gebruik als maatstaven in eiwitelektroforese (SDS-PAGE) en western blotting.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>Een tweecomponent, hoge precisie, detergent-compatibel eiwit assay voor het bepalen van de eiwitconcentratie.</td></tr><tr><td>Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter</td><td>Branson</td><td>-</td><td>Nieuwe modellen op https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated)</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>Het antilichaam gebruikt voor de konjugatie van paardenradenklaver reageert met konijn immunoglobulinen van alle klassen.</td></tr><tr><td>TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethyleendiamine) is een molecuul dat een snelle polymerisatie van polyacrylamide gels mogelijk maakt.</td></tr><tr><td>Tube Roller</td><td>-</td><td>-</td><td>Een algemene buisrotator roller; bijv. een nieuw model op https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>-</td><td>-</td><td>Een algemene buisrotator wiel; bijv. een nieuw model op https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td></tr><tr><td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>Nieuwe modellen op https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>
```

extractie en zuivering van fahd1-eiwit uit varkensnier en muizenlever

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) is het eerste geïdentificeerde lid van de FAH-superfamilie in eukaryoten, handelend als oxaalacetaatdecarboxylase in mitochondriën. Dit artikel presenteert een reeks methoden voor de extractie en zuivering van FAHD1 uit varkensnier en muizenlever. Behandelde methoden zijn ionische uitwisselingschromatografie met snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC), preparatieve en analytische gelfiltratie met FPLC en proteomische benaderingen. Na totale eiwitextractie werden ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie onderzocht en FAHD1 werd geëxtraheerd via een sequentiële strategie met behulp van ionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze representatieve benadering kan worden aangepast aan andere eiwitten van belang (uitgedrukt in significante niveaus) en worden gewijzigd voor andere weefsels. Gezuiverd eiwit uit weefsel kan de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en / of krachtige en specifieke farmacologische remmers ondersteunen.

FAHD1-eiwit werd geëxtraheerd uit varkensnieren en muizenlever met behulp van het gepresenteerde protocol. Voor muizenweefsel zijn meerdere organen nodig om meerdere μg te verkrijgen na de laatste zuiveringsstap. Om deze reden richt dit artikel zich op de extractie van FAHD1 uit varkensnieren, wat een veel voorbeeldiger experiment is. De extractie van FAHD1 uit de muizenlever wordt uitgevoerd om de moeilijkheden en mogelijke valkuilen van dit protocol te presenteren. Het wordt over het algemeen aanbevolen om organen te g...

Dit protocol beschrijft hoe fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) uit varkensnier en muizenlever kan worden geëxtraheerd. De vermelde methoden kunnen worden aangepast aan andere eiwitten van belang en worden gewijzigd voor andere weefsels.

Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Zuivering van recombinant eiwit uit bacteriën is een gevestigde methode. Er kunnen echter verschillende problemen optreden bij het gebruik van deze technieken. Het hebben van methoden om eiwit uit weefsel te extraheren is zeker aantrekkelijk.Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat men het eiwit in zijn fysiologische vorm kan extraheren, inclusief alle wederzijdse effecten die van invloed kunnen zijn op de vouw- en katalytische activiteit. Deze benadering kan worden aangepast aan andere eiwitten van belang en worden gemodificeerd voor ander weefsel. Gezuiverd eiwit uit weefsel kan de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en farmacologische remmers ondersteunen.Bereid om te beginnen eiwitlysisbuffer door 250 milliliter PBS te mengen met 50 millimolair natriumfluoride, één millimolair fenylmethylsulfonylfluoride, twee microgram per milliliter aprotinine en één millimolair geactiveerd orthovanadaat. Filtreer de oplossing met behulp van een spuitfiltereenheid van 0,22 micrometer. Bereid buisjes voor met twee milliliter lysisbuffer per gram weefsel en leg ze op ijs.Om het weefselmonster voor te bereiden, ontleedt u het weefsel van ongeveer 100 milligram elk op een voorgezuiverde glasplaat die op ijs in een piepschuimdoos is geplaatst. Breng de weefselstukken over in de voorbereide buizen voor daaropvolgende lysis. Om een verzadigde ammoniumsulfaatoplossing te bereiden, verwarmt u 500 milliliter dubbel gedestilleerd water tot 70 graden Celsius.Voeg tijdens het roeren geleidelijk ammoniumsulfaatpoeder toe totdat er geen ammoniumsulfaat meer is opgelost. Koel deze verzadigde oplossing tot kamertemperatuur en bewaar deze 's nachts bij vier graden Celsius. Om de varkensnierweefsels te homogeniseren, soniceert u de suspensie bij voorkeur door een ultrasone sonde terwijl het monster op ijs blijft.Gebruik in het geval van leverweefsels van muizen een elektrische homogenisator en was deze regelmatig in PBS om verstopping te voorkomen terwijl de monsters op ijs worden bewaard. Neem 20 microliter uit de monsters en controleer onder de microscoop of de cellen van het gehomogeniseerde weefsel goed zijn vernietigd. Herhaal anders de homogenisatie.Centrifugeer de buizen op 10.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant in een verse tube en leg het op ijs. Filter vervolgens het supernatant met behulp van 0,45 micrometer en 0,22 micrometer spuitfiltereenheden.Verdeel het supernatant in batches van 10 milliliter en vries ze in bij min 20 graden Celsius voor kortetermijnopslag of bij min 80 graden Celsius voor langere opslag. Bereid een monster van 50 microliter voor SDS-PAGE- of Western blot-analyse door 10 microliter van vijf keer de SDS-monsterbuffer toe te voegen aan 40 microliter van het supernatant en vervolgens gedurende 10 minuten te koken bij 95 graden Celsius. Bereid een discontinue 12,5% polyacrylamide SDS-PAGE-gel volgens de instructies van de fabrikant.Om SDS-PAGE-analyse uit te voeren, laadt u de putjes van de gel vervolgens met een eiwitmarkerladder, vijf nanogram menselijk FAHD1-recombinant eiwit als positieve controle, 20 microliter van het te analyseren monster en de resterende putten met 20 microliter bereide SDS-PAGE-monsterbuffer. Laat de SDS-PAGE gels op 125 volt draaien met behulp van de SDS running buffer. Nadat SDS-PAGE is voltooid, voert u een Western blot-analyse uit, onderzoekt u de membranen met behulp van het beschikbare antilichaam tegen FAHD1.Na het bereiden van supernatant aliquots zoals eerder beschreven, ofwel verwerken na het ontdooien of direct na eiwitextractie verwerken zonder het monster in te vriezen. Filtreer het monster met behulp van een filtereenheid van 0,22 micrometer om mogelijke neerslag na het ontdooien uit te sluiten. Bereid zes buizen van 1,5 milliliter op ijs en breng vervolgens 250 microliter monster over in elke buis.Bereid een verdunningsreeks ammoniumsulfaat in de voorbereide buizen en maak het uiteindelijke volume aan tot 1.000 microliter met eiwitlysisbuffer. Incubeer de monsters bij vier graden Celsius 's nachts op een buisrotator. Gebruik een tafelcentrifuge, centrifugeer bij 10.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en breng alle supernatanten voorzichtig over in afzonderlijke buizen.Droog de resulterende pellets aan de lucht en resuspend elk van hen in 1.000 microliter dubbel gedestilleerd water. Meng voor elk paar geresuspendeerde pellets en supernatant uit de vorige stap 40 microliters met 10 microliters van vijf keer de SDS-monsterbuffer en kook bij 95 graden Celsius met open deksels totdat het grootste deel van de vloeistof is verdampt. Breng de pellet vervolgens opnieuw onder in een mengsel van 50% dimethylsulfoxide in dubbel gedestilleerd water.Voer SDS-PAGE uit door de monsters afgeleid van de geresuspendeerde pellets en supernatant in paren te laden, gevolgd door een Western blot-analyse. Laat de gels echter drie uur op 80 volt draaien. Stel het FPLC-systeem in met de anionische of kationische uitwisselingskolom.Was de kolom met vijf kolomvolumes van 20% ethanol in dubbel gedestilleerd water, gevolgd door vijf kolomvolumes dubbel gedestilleerd water. Breng het monster aan op de kolom door injectie of met behulp van een monsterpomp en vang de doorstroming op. Was de kolom met één kolomvolume van de lage zoutbuffer.Stel een lineaire gradiënte-elutie in van 100% lage zoutbuffer tot 100% hoge zoutbuffer binnen drie kolomvolumes. Verzamel continu een milliliter fracties. Nadat de gradiënt is voltooid, blijft u met een hoge zoutbuffer werken totdat er geen eiwitgerelateerde pieken meer worden gedetecteerd in het chromatogram over het bereik van één kolomvolume.Breng één milliliter 25% SDS opgelost in 0,5 molair natriumhydroxide en dubbel gedestilleerd water aan om de kolom te reinigen. Was de kolom achtereenvolgens met drie kolomvolumes dubbel gedestilleerd water en drie kolomvolumes van 20% ethanol in dubbel gedestilleerd water. Verzamel de SDS-PAGE monsters van alle piekfracties en de doorstroming.Vries de verzamelde fracties in vloeibare stikstof en bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Nadat je ze via Western blot hebt onderzocht, ontdooi en pool je de fracties die de eiwitten van belang bevatten en gooi je de andere weg. Om de zuiveringsstap uit te voeren, verlaagt u het volume van de eiwitoplossing tot twee milliliter met behulp van ultracentrifugatiefiltereenheden.Filter de oplossing sequentieel met 0,45 micrometer en 0,22 micrometer spuitfiltereenheden om eventuele microprecipitatie te verwijderen. Breng de maatuitsluitingschromatografiekolom in evenwicht met één kolomvolume van de lopende buffer met één millimolair dithiothreitol. Laad het monster op de kolom en voer de chromatografie-eenheid uit totdat alle eiwitten zijn geëlueerd zoals eerder beschreven.Bereid 50 microlitermonsters voor SDS-PAGE en Western blot-analyse voor die eerder zijn beschreven. Was de kolom achtereenvolgens met één kolomvolume dubbel gedestilleerd water en één kolomvolume van 20% ethanol in dubbel gedestilleerd water. Na het uitvoeren van Western blot-analyse, pool alle FAHD1 bevattende fracties.Reduceer het volume van de eiwitoplossing tot twee milliliter met behulp van ultracentrifugatiefiltereenheden. Western blot screening toont de aanwezigheid van varkens FAHD1 in het supernatant met een band op 25 kilodalton, terwijl de gelabelde positieve controle loopt op 34 kilodalton. Het varken FAHD1 uit lysaat werd gezuiverd door anionische uitwisselingschromatografie en de bindende eiwitten werden verwijderd door elutie.Fracties die varkens FAHD1 bevatten, werden geïdentificeerd door Western blot-analyse, gepoold en geconcentreerd. Eiwitmonsters werden gezuiverd door SEC en geïdentificeerd door Western blot-analyse. De opbrengst van het FAHD1-eiwit van varkens was ongeveer één milligram met een zuiverheidsniveau van 80%.Western blot-analyse detecteerde het FAHD1-eiwit van de muis in de doorstroming samen met andere eiwitten. De doorstroming werd toegepast voor maatuitsluitingschromatografie. Fracties die FAHD1 bevatten, werden samengevoegd, geconcentreerd en toegepast op SDS-PAGE-analyse.De opbrengst van eiwitten was echter niet erg hoog. De specifieke enzymatische activiteit van het varken FAHD1 neemt toe met het zuiverheidsniveau bij het verhogen van de relatieve hoeveelheid FAHD1 per totaal eiwit. Hogere concentraties ammoniumsulfaat veroorzaken het glimlacheffect, dat bij een lagere spanning kan worden opgelost.Verder eiwit werd gevonden in het lysaat en supernatant bij een concentratie van 15%. Bij hogere concentraties kunnen monsters echter neerslaan en kunnen ze niet worden gedetecteerd. Het hier gepresenteerde protocol vereist dat het eiwit oplosbaar is.Optimale omstandigheden voor neerslag en pH- of grootteaanpassing voor chromatografie moeten worden getest en gedefinieerd. De studie van de enzymatische functie, het onderzoek naar de eiwitstructuur en de ontwikkeling van antilichamen worden sterk ondersteund bij het hebben van eiwit geëxtraheerd uit weefsel in plaats van geëxtraheerd uit bacteriën.

extraction-purification-fahd1-protein-from-swine-kidney-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van gezonde en functionele primaire muisknop hepatocyten. Instructies voor het opsporen van hepatische ontluikende eiwitsynthese door niet-radioactieve labeling substraat werden verstrekt om te helpen begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de eiwitsynthese in het kader van de homeostase van de energie-metabolisme in de lever.

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Dit protocol is bedoeld voor het beschrijven van varkens hepatocyte isolatie en ex vivo gene levering om te genezen van modellen van metabole ziekten via cel autologe transplantatie. Hoewel dit model geniet van unieke voordelen die succesvolle therapie gunst, is de toepassing een relevante Stichting bijkomende ziekten en aanduidingen aan te pakken.

Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.

Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

We presenteren een methode die membraan eiwit zuivering en reconstitutie in peptidiscs combineert in een enkele chromatografische stap. Biotinyated steigers worden gebruikt voor directe oppervlakte bevestiging en meting van eiwit-ligand interacties via biolayer interferometrie.

PeptiQuick, een in één stap incorporatie van membraan eiwitten in Biotinylated Peptidiscs voor gestroomlijnde eiwit binding assays

Hier presenteren we een affiniteitszuiveringsmethode van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus die eenvoudig, goedkoop en efficiënt is.

Affiniteitszuivering van een fibrinolytisch enzym van Sipunculus nudus

Dit artikel biedt een procedure voor de affiniteitszuivering van een humaan recombinant eiwit, flap endonuclease 1 (FEN1), dat is gelabeld met een 6X-histidine-tag. Het protocol omvat het gebruik van twee afzonderlijke geïmmobiliseerde metaalionkolommen voor de zuivering van het gelabelde eiwit.

Affiniteitszuivering van een 6X-His-gelabeld eiwit met behulp van een snel eiwitvloeistofchromatografiesysteem 

Dit protocol schetst de isolatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) van skelet- en hartspierfibromen (Acomys) via enzymatische dissociatie en fluorescentie-geactiveerde celsortering. De FAP's die uit dit protocol worden verkregen, kunnen effectief worden uitgebreid en gedifferentieerd tot myofibroblasten en adipocyten.

Isolatie, uitbreiding en differentiatie van fibro-adipogene voorlopers van het stekelige muismodel

Leer de extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever. Deze methode behoudt de fysiologische vouw en katalytische activiteit van het eiwit voor biochemisch onderzoek.

Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever

Meer video's verkennen