Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen
13 mei 2022
Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.
Er zijn verschillende methoden voor het meten van ROS-productie of oxidatieve stress in cellen. Onder deze, 2'7'dichlorofluoresceïne diacetaat sonde is een van de meest gebruikte techniek voor directe meting van redox toestand. Deze sonde is lipofiel en niet-fluorescerend. Diffusie van deze sonde over het celmembraan zorgt ervoor dat de intracellulaire esterasen zich splitsen bij de twee esterbindingen, waardoor een relatief polair en celmembraan-ondoordringbaar product ontstaat. Deze niet-fluorescerende moleculen accumuleren intracellulair en daaropvolgende oxidatie door ROS levert het zeer fluorescerende product dichloorfluoresceïne op. De oxidatie van de sonde is het product van de werking van meerdere soorten ROS. Die kan worden gedetecteerd door flowcytometrie of confocale microscopie. In dit artikel hebben we een dichloormelincetaatsonde gebruikt om ROS te meten en te kwantificeren door middel van flowcytometrie. Breng 6-well platen over in een laminaire stroomkap van de incubator. Aspirateer de supernatant. En was de cellen een keer met PBS. Voeg 2 ml laag serum DMEM per putje toe. En incubeer de 6-well plaat gedurende twee uur in de incubator. Behandel de cellen met de antioxidant gedurende zes uur. Behandel de cellen met de ROS-inductor, A of B, gedurende 30 minuten. Aspirateer de supernatant. En was de cel drie keer met PBS om alle prikkels te verwijderen. Doe het licht van de laminaire flowkap uit en werk in het donker. Voeg 1 ml dichloorbelincetaatprode toe in DMEM zonder fenolrood. Voeg 1 ml DMEM zonder fenolrood toe aan de controleautofluorescentiecontrolecellen. Incubeer de 6-well plaat gedurende 30 minuten in de incubator. Breng de platen op ijs over naar het laboratorium. Was de cellen drie keer met 2 ml koude PBS per put. Voeg 0,5 ml koude losmaakbuffer toe aan elke put. Oogst de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren met een P1000-pipet. Verzamel ze in een gelabelde buis van 1,5 ml. En centrifugeer ze bij 600 x g gedurende vijf minuten bij 4 C.Gooi het supernatant voorzichtig weg en dissociëer de pellet voorzichtig met tikken. Voeg 1 ml FACS-buffer toe om de cellen aan elke gelabelde buis te wassen. Gebruik indien nodig vortex in de laagste intensiteit voor de volledige dissociatie van de pellet. Centrifugeer ze bij 600 x g gedurende vijf minuten bij 4 C.Herhaal deze stap twee keer meer. Drie wasbeurten in totaal. Resuspend celkorrels in 200 L FACS-buffer. Dissociëer voorzichtig de pellet in elke buis met behulp van vortex. En overbrengen naar gelabelde 5 ml voor flowcytometerbuizen. Houd de buisjes op ijs totdat ze op de flowcytometer worden geanalyseerd. Maak met behulp van de flowcytometriesoftware een nieuw experiment. Klik op het exemplaar en open een lijst met buizen. Dubbelklik en wijzig de naam. Plaats de autofluorescentiecontrolebuis op de aspiratorarm en beweeg de basis voorzichtig alleen naar links. Klik op Gegevens ophalen en vervolgens op Gegevens opnemen en selecteer de gewenste stopvoorwaarde. Teken een poort rond de cellen van belang, met uitzondering van dode cellen en puin. Verwijder de tube. Klik op Volgende buis en voer het basale controlemonster uit. Klik op Gegevens ophalen en vervolgens op Gegevens vastleggen.Open de software. Voeg de voorbeelden toe met de actieknop Voorbeelden toevoegen. Klik op Voorbeeld toevoegen.Selecteer de map Experimentele datum en klik op Kiezen.Dubbelklik op het eerste voorbeeld in uw werkruimte, in dit geval autofluorescentiebesturingselement. Teken een polygoonpoort om de cel van belang te isoleren, met uitzondering van dode cellen en puin. Verander de plot in een histogram. Dubbelklik in de M
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het detecteren van de niveaus van cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van de 2′,7′-dichloorfluoresceïne-diacetaat (DCFH-DA) probe in Müller-gliacellen (MGC's). De methode is ontworpen om toegankelijk en reproduceerbaar te zijn en kwantificeert ROS via flowcytometrie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Oxidatieve stress
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Reactieve zuurstofverbindingen (ROS) spelen een cruciale rol in diverse cellulaire processen.
- De meting van ROS is essentieel voor het begrijpen van oxidatieve stress in cellen.
- De DCFH-DA-sonde is een veelgebruikte methode voor het detecteren van ROS.
- Het protocol legt de nadruk op reproduceerbaarheid en gebruiksgemak.
Doel van de studie
- Om een duidelijk protocol te bieden voor het detecteren van ROS in Müller-gliacellen.
- Om kwantificering van oxidatieve stress in neuronale cellen mogelijk te maken.
- Om onderzoek naar de rol van ROS in gliafuncties en neurobiologie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Celcultuur van Müller-gliacellen werd uitgevoerd om het biologische model te creëren.
- Cellen werden behandeld met antioxidanten en ROS-inductoren om de ROS-niveaus te bepalen.
- De DCFH-DA-probe werd gebruikt voor de detectie van ROS en gekwantificeerd middels flowcytometrie.
- Kritische stappen omvatten het wassen van cellen met PBS en het beheersen van de lichtblootstelling tijdens de analyses.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol heeft effectief de cellulaire ROS-niveaus in Müller-gliacellen gemeten.
- Flowcytometrie zorgde voor een kwantitatieve analyse van de ROS-accumulatie.
- De resultaten bevestigden de haalbaarheid van het gebruik van de DCFH-DA-sonde onder de gespecificeerde condities.
Conclusies
- Deze studie stelt een betrouwbare methode vast voor het beoordelen van oxidatieve stress in gliacellen.
- Het protocol vereenvoudigt de ROS-meting, waardoor de toegankelijkheid voor onderzoekers wordt vergroot.
- De bevindingen hebben implicaties voor het begrijpen van oxidatieve stress in de neurobiologie en potentiële therapeutische doelwitten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Kwantitatieve meting van reactieve zuurstofspecies (ROS) in Müller-gliacellen met behulp van DCFH-DA en flowcytometrie maakt een robuuste beoordeling mogelijk van mechanismen van oxidatieve stress die relevant zijn voor neurodegeneratieve en retinaale ziektemodellen. Deze mogelijkheid ondersteunt de vroege fase van targetvalidatie en mechanische risicoreductie voor de modulatie van antioxidantpaden. Betrouwbare ROS-kwantificatie informeert portfoliobeslissingen over kandidaatmoleculen die gericht zijn op redoxhomeostase in ziekterelevante systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de activering van antioxidant-paden en redoxmodulatie in gliale celmodellen.
- Ondersteunt de functionele validatie van targets die betrokken zijn bij oxidatieve stress en cellulaire verdedigingsmechanismen.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor kandidaat-interventies die invloed hebben op ROS-niveaus.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde cellulaire systemen voor compound-screening tegen oxidatieve stress-eindpunten.
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve ROS-metingen die geschikt zijn voor assay-reproduceerbaarheid en vergelijking tussen studies.
- Maakt betrouwbare evaluatie van antioxidatieve of pro-oxidatieve effecten van compounds mogelijk in een schaalbaar formaat.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde modellen voor retina-pathologieën waarbij oxidatieve stress een rol speelt, zoals diabetische retinopathie.
- Ondersteunt translationele continuïteit door in vitro ROS-modulatie te koppelen aan preklinische biomarkerstrategieën.
- Informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van antioxidantkandidaten op basis van kwantitatieve cellulaire uitkomsten.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze workflow voor ROS-kwantificering bevindt zich in de fase tussen vroege ontdekking en lead-identificatie en ondersteunt zowel hypothesetesten als de integratie van downstream-screening.
- Ontdekkingsbiologie: Levert kwantitatief bewijs voor de activering van redoxpaden en de cellulaire respons op oxidatieve schade.
- Screening: Biedt reproduceerbare, op flowcytometrie gebaseerde ROS-metingen voor de triage van verbindingen.
- Analytica: Maakt statistische vergelijking van ROS-niveaus tussen experimentele condities mogelijk met behulp van de geometrische gemiddelde fluorescentie-intensiteit.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro modulatie van oxidatieve stress met ziekterelevante eindpunten in retinale modellen.
- Zakelijke herbruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerd ROS-assayplatform dat aanpasbaar is aan diverse celtypen en redox-modulerende middelen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij redox-gerichte ontdekkingen en vermindert mechanische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare ROS-kwantificering voor workflows tussen teams.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen voor modulatoren van antioxidatieve pathways en verhoogt de kapitaalefficiëntie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten die zich richten op mechanismen van oxidatieve stress.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de bediening van flowcytometrie en data-analyse.
- Toegang tot flowcytometrie-instrumentatie en compatibele analyse-software is noodzakelijk.
- Vereist cross-team standaardisatie van gating- en fluorescentiekwantificeringsprotocollen.
- Aanpasbaar aan andere celmodellen door optimalisatie van het protocol voor probe-loading en controles.
- Afhankelijk van een robuuste monsterverwerking om assay-variabiliteit en licht-geïnduceerde artefacten te minimaliseren.
