Stereotaxische chirurgische benadering van micro-injecteren van de caudale hersenstam en het bovenste cervicale ruggenmerg via de Cisterna Magna bij muizen

Dit protocol biedt stapsgewijze richtlijnen voor een reproduceerbare toegangsroute tot gebieden van belang in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale koord. Deze techniek verhoogt de precisie bij het leveren van kleine injectievolumes aan beperkte gebieden van belang in de caudale hersenstam en de bovenste cervicale navelstreng. Deze techniek is en kan worden toegepast op andere diermodellen.

Dr.Veronique VanderHorst, universitair hoofddocent neurologie en hoofdonderzoeker van het VanderHorst Laboratorium, zal deze procedure demonstreren. Zorg ervoor dat de zuurstofstroom naar de neuskegel wordt geleid. Beweeg de muis naar het stereotaxische frame en plaats de neus in een flexibele neuskegel.

Plaats de muis in het stereotaxische frame met alleen oorstaven. Breng glijmiddel op de ogen aan. Anteroflex de kop van de muis in een hoek van 90 graden door de neus handmatig te begeleiden.

Om deze positie te beveiligen, plaatst u een plastic barrière tussen de oorbalkstijlen van de muisadapter parallel aan de pilaren met het platte deel van de schedel als referentie. Plaats het verwarmingskussen onder de muis en zorg ervoor dat de nek en de rest van het lichaam evenwijdig aan de tafel zijn geplaatst door het lichaam met een klein doosje op te tillen. Plaats een gordijn onder het lichaam.

Injecteer een enkele dosis van vier milligram per kilogram Meloxicam slow release subcutaan bij een volume van twee microliter per gram lichaamsgewicht. Reinig de chirurgische incisieplaats eerst met een 70% alcoholvoorbereidingspad, vervolgens met een Betaïne-preppad en vervolgens opnieuw met een alcoholvoorbereidingspad en laat het drogen. Desinfecteer de handen en trek steriele handschoenen aan en plaats vervolgens een gordijn op de operatieplaats.

Zorg ervoor dat de muis op de juiste manier wordt verdoofd door in de tenen te knijpen of de hoornvliesreflex te controleren. Verlaag isofluraan om de niveaus op 2,0 te houden. Maak een incisie van één tot 1,2 centimeter met een chirurgisch 10-mesje van de rand van het achterhoofdsbeen naar de schouders in één vloeiende beweging.

Maak voorzichtig een incisie in de middellijn raphe van de trapeziusspier, waardoor de gepaarde longus capitis spieren worden blootgesteld. Plaats beide retractorhaken tussen de gepaarde longus capitis spieren, de ene naar links en de andere naar rechts. Gebruik de stompe laminectomietang om de linker- en rechterbuik van de gepaarde longus capitis spier te scheiden, te beginnen bij het achterhoofd waar de middellijn gemakkelijk zichtbaar is.

Leid de stompe tang over het bot van het achterhoofd in de middellijn naar beneden naar waar het de cisternal dura mater ontmoet en ga dan verder over de dura mater naar de atlas. Verplaats de retractors en pas de spanning aan door de hemostaten te herpositioneren. Gebruik de stompe laminectomietang om de spieren verder in de middellijn te scheiden om een goed zicht op de hersenstam en het cerebellum te krijgen.

Herhaal de bovenstaande procedure indien nodig totdat het cerebellum en de hersenstam onder de dura verschijnen. Gebruik stompe laminectomietang om de dura van de kleine strengen bindweefsel te verwijderen door de tang van de middellijn in een laterale richting te bewegen totdat er een duidelijk zicht op de hersenstam is, waardoor meer laterale ruimte ontstaat. Bekijk het dorsale oppervlak van de hersenstam met gedetailleerde oriëntatiepunten door de open dura.

Gebruik de schuine tang om de dura te grijpen die zich uitstrekt van het achterhoofdsbeen tot de atlas en gebruik vervolgens de veerschaar om een kleine opening van ongeveer 0,5 tot 1,5 millimeter in de dura te maken. Zodra de dura is geopend, voert u overtollig hersenvocht af met een steriele Q-tip. De obex, het punt waar het centrale kanaal uitkomt in de vierde ventrikel, is het standaard voorste-achterste en middellaterale nulpunt.

Plaats de pipet of spuit op het doel met behulp van de stereotaxische arm. Laat de arm van het dorsaal zakken op het dorsale oppervlak dat zich vormt vanuit het dorsoventrale nulpunt. Laat vervolgens de pipet op de hersenstam zakken en injecteer de oplossing.

Laat de naald één tot vijf minuten na injectie op zijn plaats om een naaldspoor te voorkomen bij gebruik van volumes tussen drie en 50 nanoliter. Til vervolgens de pipet of spuit op met behulp van de stereotaxische arm en herhaal dit voor meerdere doelen. Verwijder de haken voorzichtig uit het operatieveld.

De gepaarde longus capitis spieren zullen terugvallen in een neutrale positie die de cisterna magna volledig bedekt. Sluit de trapeziusspier en dura mater niet in de middellijn omdat ze te kwetsbaar zijn om hechtingen vast te houden. Sluit de huid met 3 nylon of polypropyleen hechtingen.

De cisterna magna-benadering maakt het mogelijk om de caudale hersenstam en bovenste cervicale koordstructuren aan te pakken die anders moeilijk te bereiken zijn via standaard stereotaxische benaderingen of gevoelig zijn voor inconsistente targeting. Bij muizen zijn structuren zoals de hypoglossale kern, ventrale respiratoire groep en aangrenzende reticulaire formatie in de caudale hersenstam routinematig aangevallen met behulp van de cisterna magna-benadering zoals hier geïllustreerd voor de hypoglossale kern en de ventromediale medulla. Om de nauwkeurigheid van de cisterna magna-benadering versus de standaardbenadering te bepalen, werd de afstand gemeten tussen de beoogde en werkelijke doellocaties in de anteroposteriorale, mediolaterale en dorsoventrale vlakken voor ventrale en dorsale gebieden.

De resultaten tonen significant kleinere fouten in de anteroposterior, mediolaterale en dorsoventrale vlakken in vergelijking met de standaardbenadering, wat de verbeterde nauwkeurigheid van de cisterna magna-benadering voor deze doelen benadrukt. Bij het proberen van dit protocol is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de anteroflexie van het hoofd en de verhoging van het lichaam wordt uitgevoerd zoals beschreven. Vervolgens is het belangrijk om belangrijke oriëntatiepunten te herkennen voordat u de spier of de dura mater manipuleert.

Als deze oriëntatiepunten niet worden herkend of als ze verloren gaan, zal het een uitdaging zijn om georiënteerd te blijven en de procedure uit te voeren zoals bedoeld. Deze techniek hielp bij het beantwoorden van conceptuele vragen met betrekking tot de functionele anatomische organisatie binnen de caudale hersenstam en de bovenste cervicale navelstreng.