Name: Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Ontdek mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankersferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse. Deze methode biedt een superieur fysiologisch model voor kankeronderzoek en geneesmiddelenontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.J.C werd ondersteund door een BBSRC MIBTP CASE Award met Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Belangrijkste bevindingen en outputs Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om het mitochondriale energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden te onderzoeken met behulp van een reeks van kanker afgeleide cellijnen met de XFe96 XF Analyzer. Een methode wordt ontwikkeld en beschreven voor de snelle teelt van A549, HepG2/ C3A, MCF7 en SK-OV-3 cellulaire sferoïden met behulp van celafstotende technologieën voor gedwongen aggregatie. Dit protocol behandelt veel overwegingen van het onderzoeken van het ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

Vooruitgang in in vitro modellen in biologisch onderzoek is de afgelopen 20 jaar snel vooruitgegaan. Dergelijke modellen omvatten nu organ-on-a-chip-modaliteiten, organoïden en 3D-microtissue-sferoïden, die allemaal een gemeenschappelijke focus zijn geworden om de translatie tussen in vitro en in vivo studies te verbeteren. Het gebruik van geavanceerde in vitro modellen, met name sferoïden, omvat verschillende onderzoeksgebieden, waaronder tissue engineering, stamcelonderzoek, kanker en ziektebiologie 1,2,3,4,5,6,7, en veiligheidstests, waaronder genetische toxicologie 8,9,10, nanomaterialen toxicologie11, 12,13,14, en drug veiligheid en werkzaamheid testen 8,15,16,17,18,19.
Normale celmorfologie is van cruciaal belang voor biologisch fenotype en activiteit. Het kweken van cellen tot 3D-microtissue-sferoïden stelt cellen in staat om een morfologie, fenotypische functie en architectuur aan te nemen, meer verwant aan die waargenomen in vivo , maar moeilijk te vangen met klassieke monolayer celkweektechnieken. Zowel in vivo als in vitro wordt de cellulaire functie direct beïnvloed door de cellulaire micro-omgeving, die niet beperkt is tot cellulaire communicatie en programmering (bijv. Cel-cel junctie formaties, mogelijkheden om celniches te vormen); celblootstelling aan hormonen en groeifactoren in de directe omgeving (bijv. cellulaire cytokineblootstelling als onderdeel van een ontstekingsreactie); samenstelling van fysische en chemische matrices (bijvoorbeeld of cellen worden gekweekt in stijf weefselkweekplastic of een elastische weefselomgeving); en vooral, hoe het cellulaire metabolisme wordt beïnvloed door voeding en toegang tot zuurstof, evenals de verwerking van metabole afvalproducten zoals melkzuur.
Metabole fluxanalyse is een krachtige manier om het cellulaire metabolisme binnen gedefinieerde in vitro systemen te onderzoeken. In het bijzonder maakt XF-technologie de analyse mogelijk van levende, real-time veranderingen in cellulaire bio-energetica van intacte cellen en weefsels. Gezien het feit dat veel intracellulaire metabole gebeurtenissen plaatsvinden binnen de orde van seconden tot minuten, zijn real-time functionele benaderingen van het grootste belang voor het begrijpen van real-time veranderingen in cellulaire metabole flux in intacte cellen en weefsels in vitro.
Dit artikel bevat protocollen voor het cultiveren van van kanker afgeleide cellijnen A549 (longadenocarcinoom), HepG2 / C3A (hepatocellulair carcinoom), MCF-7 (borstadenocarcinoom) en SK-OV-3 (ovarieel adenocarcinoom) als in vitro 3D-sferoïde modellen met behulp van gedwongen aggregatiebenaderingen (figuur 1). Het beschrijft ook in detail hoe mitochondriaal energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden kan worden onderzocht met behulp van de Agilent XFe96 XF-analyzer, (ii) wijst op manieren om XF-assays te optimaliseren met behulp van enkele 3D-sferoïden, en (iii) bespreekt belangrijke overwegingen en beperkingen van het onderzoeken van het 3D-sferoïdemetabolisme met behulp van deze aanpak. Het belangrijkste is dat dit artikel beschrijft hoe datasets worden verzameld die de berekening van zuurstofverbruik (OCR) mogelijk maken om oxidatieve fosforylering en dus mitochondriale functie in cellulaire sferoïden te bepalen. Hoewel niet geanalyseerd voor dit protocol, is extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) een andere parameter die wordt gemeten naast OCR-gegevens in XF-experimenten. ECAR wordt echter vaak slecht of onjuist geïnterpreteerd uit XF-datasets. We geven commentaar op de beperkingen van het berekenen van ECAR volgens basisbenaderingen van de technologiefabrikant.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#86012804</td><td>Longkankercellijn</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>XF-assaymedium met 1 mM HEPES, zonder fenol rood, natriumbicarbonaat, glucose, L-glutamine en natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Instrument voor het meten van de snelheid van zuurstofopname in afzonderlijke sferoïden</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>Remmende stof voor mitochondriaal ademhalingscomplex III</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Mitochondriale protonofore ontkoppeler</td></tr><tr><td>Zwart-wandige microplaat</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>Voor op fluorescentie gebaseerde assays</td></tr><tr><td>CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Microplates voor het genereren van sferoïden</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Assay voor de bepaling van celviabiliteit in 3D microweefsel-sferoïden</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R&amp;D Systems a biotechne brand</td><td>3439-100-01</td><td>Moleculair celklevend materiaal voor het coaten van XFe96 sferische microplates om het hechten van sferoïden te vergemakkelijken</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>Aanvulling voor celkweekgroei en XF-assaymedium</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>Kweekmedium voor HepG2/C3A sferoïden</td></tr><tr><td>EVOS XL Core Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Phase-contrast beeldvormingsmicroscoop</td></tr><tr><td>EZ-PCR Mycoplasma testkit</td><td>Biological Industries</td><td>20-700-20</td><td>Mycoplasma-screening in celcultures</td></tr><tr><td>FIJI Is Just Image J</td><td></td><td></td><td>Analyse van verzamelde beelden</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Aanvulling voor celkweekmedium</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>Hepatisch kankercellijn, een klonale afgeleide van de ouder HepG2-cellijn</td></tr><tr><td>Lactate-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Assay voor meting van lactaat in sferische kweekmedium</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM oplossing)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>Aanvulling voor celkweekgroei en XF-assaymedium</td></tr><tr><td>M50 Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>LEICAM50</td><td>Stereo dissectiemicroscoop; gebruikt voor sferische handeling</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td><td>#86012803</td><td>Borstkankercellijn</td></tr><tr><td>Oligomycine van Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>ATP-synthase-remmer</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antibiotica toegevoegd aan celkweekmedium</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Initrogen</td><td>P7589</td><td>Analyse van dsDNA in sferoïden</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Mitochondriale ademhalingscomplex I-remmer</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>Kweekmedium voor A549, MCF7 en SK-OV-3 sferoïden</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Build 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>Elke Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak bevat: 6 Seahorse XFe96 Spheroidal Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges en 1 fles Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)</td></tr><tr><td>Serologische pipet: 5, 10 en 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107; 760107</td><td>Consumables voor celkweek</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#HTB-77</td><td>Ovariekankercellijn</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat (100 mM oplossing)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Aanvulling voor celkweekgroei en XF-assaymedium</td></tr><tr><td>T75 cm2 celkweekkolf</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Behandelde flessen voor celkweek</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Celdissociatiereagens</td></tr><tr><td>Wave controller software</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Tip met brede opening</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Pipettips met brede opening voor sferische handeling</td></tr></tbody></table>

onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3d-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Driedimensionale (3D) cellulaire aggregaten, sferoïden genoemd, zijn de afgelopen jaren de voorhoede geworden van in vitro celkweek. In tegenstelling tot het kweken van cellen als tweedimensionale, eencellige monolagen (2D-cultuur), bevordert, reguleert en ondersteunt sferoïde celcultuur fysiologische cellulaire architectuur en kenmerken die in vivo bestaan, waaronder de expressie van extracellulaire matrixeiwitten, celsignalering, genexpressie, eiwitproductie, differentiatie en proliferatie. Het belang van 3D-cultuur is erkend in vele onderzoeksgebieden, waaronder oncologie, diabetes, stamcelbiologie en tissue engineering. In het afgelopen decennium zijn verbeterde methoden ontwikkeld om sferoïden te produceren en hun metabole functie en lot te beoordelen.
Extracellulaire flux (XF) analyzers zijn gebruikt om de mitochondriale functie in 3D-microtissues zoals sferoïden te onderzoeken met behulp van een XF24 eilandje capture plate of een XFe96 spheroid microplaat. Verschillende protocollen en de optimalisatie van het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in sferoïden met behulp van XF-technologie zijn echter niet in detail beschreven. Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in enkele 3D-sferoïden met behulp van sferoïde microplaten met de XFe96 XF-analyzer. Met behulp van verschillende kankercellijnen is aangetoond dat XF-technologie in staat is om onderscheid te maken tussen cellulaire ademhaling in 3D-sferoïden van niet alleen verschillende groottes, maar ook verschillende volumes, celnummers, DNA-inhoud en type.
De optimale mitochondriale effectorverbindingsconcentraties van oligomycine, BAM15, rotenon en antimycine A worden gebruikt om specifieke parameters van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-sferoïden te onderzoeken. Dit artikel bespreekt ook methoden om gegevens verkregen uit sferoïden te normaliseren en behandelt vele overwegingen die moeten worden overwogen bij het verkennen van sferoïdemetabolisme met behulp van XF-technologie. Dit protocol zal helpen bij het stimuleren van onderzoek in geavanceerde in vitro sferoïde modellen.

Om goed gevormde, compacte sferoïden te verkrijgen, werd elke cellijn individueel geoptimaliseerd voor de zaaidichtheid en de duur van de teelt (figuur 3). A549, HepG2/C3A en SK-OV-3 cellijnen vormden aanvankelijk losse aggregaten die pas na 7 dagen in cultuur evolueerden naar ronde sferoïden met duidelijk gedefinieerde perimeters. Omgekeerd kunnen MCF-7-cellen binnen 3 dagen sferoïden vormen. Er was een duidelijke correlatie tussen de initiële celzaaidichtheid en het sferoïde volume na de k...

Deze protocollen zullen gebruikers helpen bij het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankercellijn-afgeleide sferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse.

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om het mitochondriale energiemetabolisme en naadloze sferoïden te onderzoeken om vergelijkingen mogelijk te maken tussen verschillende cellijnen, celnummers en fenotypen, evenals medicamenteuze behandelingen in een veldgeneesmiddelontdekking en kankeronderzoek. Ons werk presenteert een gedetailleerd protocol voor het verkennen van mitochondriaal energiemetabolisme met behulp van 3D-sferoïden die het superieure fysiologische model bieden in vergelijking met celmonolagenexperimenten. Biologische waarnemingen kunnen extrapoleren van een glasachtig sferoïden naar in vivo tumoren en routes identificeren die zich kunnen richten op het metabolisme van sferoïde tumoren.Bijvoorbeeld koolhydraat nut tijdens de groei van sferoïden. Alle gegevens seahorse extracellular flux 96 instrument is zeer gevoelig. Het positioneren van in vitro sferoïden in de testplaat is van het grootste belang voor het verkrijgen van nauwkeurige gegevens op het niveau van de enkele sferoïde.Controleer de levensvatbaarheid van sferoïden met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop met fasecontrast bij 4x vergroting om een intacte sferoïde structuur, morfologie en algehele uniformiteit tussen monsters te garanderen. Om de sensorcartridge te hydrateren, voert u ongeveer 20 milliliter van het kalibrant in een conische buis. Plaats de conische buis met het kalibrant een nacht in een niet-kooldioxide-incubator van 37 graden Celsius.Haal de inhoud van de testkit eruit. Plaats de sensorcartridge ondersteboven naast de gebruiksplaat. Pipetteer 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water in elke put van de nutsplaat met behulp van een meerkanaals P300-pipet.Plaats de sensorcartridge bovenop de gebruiksplaat. Controleer of het waterniveau in elke put hoog genoeg is om de sensorsondes onder te dompelen. Breng de geassembleerde sensorcartridge over naar een niet-kooldioxide 37 graden Celsius incubator en laat deze een nacht staan.Om de sferoïde testmicroplaat te coaten, voegt u 30 microliter steriele 0,1 milligram per milliliter Poly-D-Lysine-oplossing per putje sferoïde microplaat toe met behulp van een septische techniek. Haal de oplossing uit elk putje van de sferoïde microplaat, keer de plaat om en tik deze stevig op tissuepapier om eventuele restoplossing te verwijderen. Was elke put van de plaat met 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water.Na de laatste wasbeurt keert u de microplaat om en tikt u deze stevig op tissuepapier om eventueel restwater te verwijderen. Laat de plaat 30 minuten aan de lucht drogen voor toekomstig gebruik. Bereid het XF RPMI-medium voor zoals beschreven in het manuscript.Prewarm het aangevulde XF RPMI-testmedium tot 37 graden Celsius een uur voorafgaand aan de test. En prewarm de gecoate sferoïde assay microplaat in een niet-koolstofdioxide 37 graden Celsius incubator. Haal de conische buis met het kalibrant en de sensorcartridge uit de luchtincubator.Verwijder de sensorcartridge van de gebruiksplaat en plaats deze ondersteboven op het werkoppervlak. Gebruik een P300 meerkanaals pipet om het water van de nutsplaat te halen en weg te gooien. Voeg 200 microliter van het voorgewarmde kalibrant toe aan elk putje van de gebruiksplaat.Plaats de sensorcartridge op de gebruiksplaat en zorg ervoor dat de sensoren goed ondergedompeld zijn in het kalibrant. Breng de geassembleerde sensorcartridge over in de niet-kooldioxide, 37 graden Celsius incubator totdat het klaar is om de poortinjectieoplossingen te laden. Haal de sferoïde kweekplaat uit de incubator en observeer de sferoïden onder de microscoop om hun integriteit te waarborgen voordat de sferoïde overdracht stappen onderneemt.Laad 180 microliter prewarm assay medium in elk putje van de sferoïde plaat, inclusief eventuele achtergrondcorrectieputten. Vul een petrischaaltje van zeven centimeter gedeeltelijk met drie milliliter van het testmedium. Breng de sferoïden van de 96 putkweekplaat over in een petrischaaltje, met behulp van een meerkanaals pipet geladen met brede opening pipetpunten, en volume ingesteld op 10 tot 50 microliter.Stel het volume van een eenkanaals pipettor uitgerust met een brede opening pipetpunt in op 20 microliter en aspirateer voorzichtig een enkele sferoïde. Plaats de punt direct in het midden van elk putje van deze sferoïde assay microplaat en laat capillaire actie de sferoïde uit de pipetpunt trekken. Bevestig de evolutie onder de microscoop door de inhoud van de pipettor terug te pipetteren in de petrischaal.Zodra al deze sferoïden zijn overgebracht naar de sferoïde assay microplaat, breng de plaat over naar een niet-koolstofdioxide 37 graden Celsius incubator voor een minimum van een uur. Bereid de werkvoorraadconcentraties van elke verbinding voor zoals beschreven in het manuscript, met behulp van een volledig aangevuld voorgewarmd XF RPMI-testmedium. Dispenseerde 20 microliter van de werkoplossing van elke verbinding in alle overeenkomstige poorten met behulp van een gekalibreerde P100 meerkanaals pipet.Bereid de analyzer voor op het laden van de sensorcartridge. Om goed gevormde compacte sferoïden te verkrijgen, werd elke cellijn individueel geoptimaliseerd voor zaaidichtheid en duur van de teelt. Bij geoptimaliseerde zaaistrategieën was het sferoïde volume voor SK-OV-3 ongeveer 5,46 x 10 tot de zeven micrometer geblokt en voor A549 was het 1,45 x 10 tot acht micrometer geblokt.Alle sferoïde types hadden een lineaire correlatie tussen de initiële zaaidichtheid en het sferoïde volume. Perfecte sferoïde symmetrie had een circulariteit van 1,0 en een afwijking van 1,0 duidde op een verlies van circulariteit. Voor alle sferoïdetypen nam het zuurstofverbruik toe met de grootte van de sferoïden en was lineair gecorreleerd aan het sferoïdevolume met het hoogste in MCF-7-sferoïden en het laagste in SK-OV-3-sferoïden.MCF-7-sferoïden reageerden niet op de voertuigcontrole gedurende het hele experiment. Het zuurstofverbruik in MCF-7-sferoïden werd verlaagd met oligomycine na vijf meetcycli na de eerste injectie van 0,5 microgram per milliliter. In reactie op BAM15 werd het zuurstofverbruik verhoogd vóór de tweede injectie.Terwijl de combinatie van Rotenone plus AntimycinE A het verlaagde. Een protocol voor het nauwkeurig onderzoeken van basale mitochondriale ademhaling. ADP fosforyleringsademhaling, lekademhaling, koppelingsefficiëntie, maximale ademhalingscapaciteit en reserverespiratoire capaciteit werd ontwikkeld met behulp van van kanker afgeleide 3D-sferoïden.Alle ademhalingsverbindingen leverden de verwachte kinetische zuurstofverbruiksprofielen op voor de geselecteerde verbindingen, die een gemiddelde stabiele basale ademhalingssnelheid van 20 tot 30 picomol zuurstof per minuut per put onthulden. Locatie van sferoïden binnen de microplaat en meetcyclusnummer na samengestelde injectie om ervoor te zorgen dat de ademhalingssnelheden stabiel zijn tussen samengestelde toevoegingen. Bij het verkennen van mitochondriale ademhalingscapaciteit met ontkoppelaars, is niet alleen de concentratiesleutel, maar ook het vermogen om de ademhaling los te koppelen in aanwezigheid van oligomycine, dat meestal wordt toegevoegd voordat het wordt ontkoppeld in experimenten die mitochondriaal energiemetabolisme onderzoeken.

exploring-mitochondrial-energy-metabolism-single-3d-microtissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een beschrijving van een methode voor het profileren van mitochondriale functie in cellen wordt verzorgd. De gegenereerde mitochondriale profiel biedt vier parameters van mitochondriële functie die kan worden gemeten in een experiment: basale ademhaling, ATP-linked ademhaling, proton lek, en reservecapaciteit.

Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

This protocol describes the technique for performing extracellular flux assay on 3D spheroids generated from the co-culture of pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblasts (PS1) to measure the two major energy-producing pathways, glycolysis and mitochondrial respiration.

Extracellular Flux Assay in 3D Spheroids: A Method for Measuring the Metabolic Activity of Pancreatic Tumor Spheroids

Hier, wordt een methode beschreven voor de bereiding van 3-dimensionale (3D) sferoïde co cultuur van pancreatic kankercellen en fibroblasten, gevolgd door meting van metabolische functies met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Voorbereiding en metabole kwantitatieve analyse van 3-dimensionale sferoïde co culturen van Pancreatic kankercellen en fibroblasten

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

In dit werk beschrijven we een aangepast protocol om mitochondriale respiratoire substraatflux te testen met behulp van recombinant perfringolysine O in combinatie met respirometrie op basis van microplaten. Met dit protocol laten we zien hoe metformine de mitochondriale ademhaling van twee verschillende tumorcellijnen beïnvloedt.

Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Hier zetten we een metabool profileringsplatform op dat driedimensionale (3D) glioomsferoïden integreert met op beeldvorming gebaseerde normalisatie via extracellulaire fluxanalyse. Deze benadering maakt een nauwkeurigere beoordeling mogelijk van tumormetabole reacties op medicamenteuze behandelingen en biedt inzicht in mogelijke resistentiemechanismen.

Vooruitgang in de metabole profilering van driedimensionale hersentumorsferoïden voor screening op geneesmiddelen

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve manier om een glycolyse-stresstest uit te voeren om metabole herprogrammering in primaire muismicroglia te kwantificeren. Na isolatie en ontstekingsstimulatie wordt de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) gemeten met vers bereide, pH-gecorrigeerde reagentia, gevolgd door eiwitnormalisatie om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van glycolytische verschuivingen mogelijk te maken.

Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay

Ontdek mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankersferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse. Deze methode biedt een superieur fysiologisch model voor kankeronderzoek en geneesmiddelenontwikkeling.

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse (Video) | JoVE Journal

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Meer video's verkennen