Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om het mitochondriale energiemetabolisme en naadloze sferoïden te onderzoeken om vergelijkingen mogelijk te maken tussen verschillende cellijnen, celnummers en fenotypen, evenals medicamenteuze behandelingen in een veldgeneesmiddelontdekking en kankeronderzoek. Ons werk presenteert een gedetailleerd protocol voor het verkennen van mitochondriaal energiemetabolisme met behulp van 3D-sferoïden die het superieure fysiologische model bieden in vergelijking met celmonolagenexperimenten. Biologische waarnemingen kunnen extrapoleren van een glasachtig sferoïden naar in vivo tumoren en routes identificeren die zich kunnen richten op het metabolisme van sferoïde tumoren.

Bijvoorbeeld koolhydraat nut tijdens de groei van sferoïden. Alle gegevens seahorse extracellular flux 96 instrument is zeer gevoelig. Het positioneren van in vitro sferoïden in de testplaat is van het grootste belang voor het verkrijgen van nauwkeurige gegevens op het niveau van de enkele sferoïde.

Controleer de levensvatbaarheid van sferoïden met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop met fasecontrast bij 4x vergroting om een intacte sferoïde structuur, morfologie en algehele uniformiteit tussen monsters te garanderen. Om de sensorcartridge te hydrateren, voert u ongeveer 20 milliliter van het kalibrant in een conische buis. Plaats de conische buis met het kalibrant een nacht in een niet-kooldioxide-incubator van 37 graden Celsius.

Haal de inhoud van de testkit eruit. Plaats de sensorcartridge ondersteboven naast de gebruiksplaat. Pipetteer 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water in elke put van de nutsplaat met behulp van een meerkanaals P300-pipet.

Plaats de sensorcartridge bovenop de gebruiksplaat. Controleer of het waterniveau in elke put hoog genoeg is om de sensorsondes onder te dompelen. Breng de geassembleerde sensorcartridge over naar een niet-kooldioxide 37 graden Celsius incubator en laat deze een nacht staan.

Om de sferoïde testmicroplaat te coaten, voegt u 30 microliter steriele 0,1 milligram per milliliter Poly-D-Lysine-oplossing per putje sferoïde microplaat toe met behulp van een septische techniek. Haal de oplossing uit elk putje van de sferoïde microplaat, keer de plaat om en tik deze stevig op tissuepapier om eventuele restoplossing te verwijderen. Was elke put van de plaat met 200 microliter steriel dubbel gedestilleerd water.

Na de laatste wasbeurt keert u de microplaat om en tikt u deze stevig op tissuepapier om eventueel restwater te verwijderen. Laat de plaat 30 minuten aan de lucht drogen voor toekomstig gebruik. Bereid het XF RPMI-medium voor zoals beschreven in het manuscript.

Prewarm het aangevulde XF RPMI-testmedium tot 37 graden Celsius een uur voorafgaand aan de test. En prewarm de gecoate sferoïde assay microplaat in een niet-koolstofdioxide 37 graden Celsius incubator. Haal de conische buis met het kalibrant en de sensorcartridge uit de luchtincubator.

Verwijder de sensorcartridge van de gebruiksplaat en plaats deze ondersteboven op het werkoppervlak. Gebruik een P300 meerkanaals pipet om het water van de nutsplaat te halen en weg te gooien. Voeg 200 microliter van het voorgewarmde kalibrant toe aan elk putje van de gebruiksplaat.

Plaats de sensorcartridge op de gebruiksplaat en zorg ervoor dat de sensoren goed ondergedompeld zijn in het kalibrant. Breng de geassembleerde sensorcartridge over in de niet-kooldioxide, 37 graden Celsius incubator totdat het klaar is om de poortinjectieoplossingen te laden. Haal de sferoïde kweekplaat uit de incubator en observeer de sferoïden onder de microscoop om hun integriteit te waarborgen voordat de sferoïde overdracht stappen onderneemt.

Laad 180 microliter prewarm assay medium in elk putje van de sferoïde plaat, inclusief eventuele achtergrondcorrectieputten. Vul een petrischaaltje van zeven centimeter gedeeltelijk met drie milliliter van het testmedium. Breng de sferoïden van de 96 putkweekplaat over in een petrischaaltje, met behulp van een meerkanaals pipet geladen met brede opening pipetpunten, en volume ingesteld op 10 tot 50 microliter.

Stel het volume van een eenkanaals pipettor uitgerust met een brede opening pipetpunt in op 20 microliter en aspirateer voorzichtig een enkele sferoïde. Plaats de punt direct in het midden van elk putje van deze sferoïde assay microplaat en laat capillaire actie de sferoïde uit de pipetpunt trekken. Bevestig de evolutie onder de microscoop door de inhoud van de pipettor terug te pipetteren in de petrischaal.

Zodra al deze sferoïden zijn overgebracht naar de sferoïde assay microplaat, breng de plaat over naar een niet-koolstofdioxide 37 graden Celsius incubator voor een minimum van een uur. Bereid de werkvoorraadconcentraties van elke verbinding voor zoals beschreven in het manuscript, met behulp van een volledig aangevuld voorgewarmd XF RPMI-testmedium. Dispenseerde 20 microliter van de werkoplossing van elke verbinding in alle overeenkomstige poorten met behulp van een gekalibreerde P100 meerkanaals pipet.

Bereid de analyzer voor op het laden van de sensorcartridge. Om goed gevormde compacte sferoïden te verkrijgen, werd elke cellijn individueel geoptimaliseerd voor zaaidichtheid en duur van de teelt. Bij geoptimaliseerde zaaistrategieën was het sferoïde volume voor SK-OV-3 ongeveer 5,46 x 10 tot de zeven micrometer geblokt en voor A549 was het 1,45 x 10 tot acht micrometer geblokt.

Alle sferoïde types hadden een lineaire correlatie tussen de initiële zaaidichtheid en het sferoïde volume. Perfecte sferoïde symmetrie had een circulariteit van 1,0 en een afwijking van 1,0 duidde op een verlies van circulariteit. Voor alle sferoïdetypen nam het zuurstofverbruik toe met de grootte van de sferoïden en was lineair gecorreleerd aan het sferoïdevolume met het hoogste in MCF-7-sferoïden en het laagste in SK-OV-3-sferoïden.

MCF-7-sferoïden reageerden niet op de voertuigcontrole gedurende het hele experiment. Het zuurstofverbruik in MCF-7-sferoïden werd verlaagd met oligomycine na vijf meetcycli na de eerste injectie van 0,5 microgram per milliliter. In reactie op BAM15 werd het zuurstofverbruik verhoogd vóór de tweede injectie.

Terwijl de combinatie van Rotenone plus AntimycinE A het verlaagde. Een protocol voor het nauwkeurig onderzoeken van basale mitochondriale ademhaling. ADP fosforyleringsademhaling, lekademhaling, koppelingsefficiëntie, maximale ademhalingscapaciteit en reserverespiratoire capaciteit werd ontwikkeld met behulp van van kanker afgeleide 3D-sferoïden.

Alle ademhalingsverbindingen leverden de verwachte kinetische zuurstofverbruiksprofielen op voor de geselecteerde verbindingen, die een gemiddelde stabiele basale ademhalingssnelheid van 20 tot 30 picomol zuurstof per minuut per put onthulden. Locatie van sferoïden binnen de microplaat en meetcyclusnummer na samengestelde injectie om ervoor te zorgen dat de ademhalingssnelheden stabiel zijn tussen samengestelde toevoegingen. Bij het verkennen van mitochondriale ademhalingscapaciteit met ontkoppelaars, is niet alleen de concentratiesleutel, maar ook het vermogen om de ademhaling los te koppelen in aanwezigheid van oligomycine, dat meestal wordt toegevoegd voordat het wordt ontkoppeld in experimenten die mitochondriaal energiemetabolisme onderzoeken.