Isolatie van rat vetweefsel Mesenchymale stamcellen voor differentiatie in insulineproducerende cellen
29 augustus 2022
Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) kunnen een potentiële bron zijn van MSC's die differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC's). In dit protocol bieden we gedetailleerde stappen voor de isolatie en karakterisering van epididymale Ad-MSC's bij ratten, gevolgd door een eenvoudig, kort protocol voor het genereren van IPC's van dezelfde rat Ad-MSC's.
Het algemene doel van dit protocol is om rood vetweefsel, gedroogde mesenchymale stamcellen te isoleren en te karakteriseren en te differentiëren naar insulineproducerende cellen met behulp van eenvoudige methoden. Mesenchymale stamcellen hebben de wegen gevonden op het gebied van genetica. Ze kunnen worden geïsoleerd uit verschillende bronnen zoals beenmerg, vetweefsel en perinataal weefsel.
Ze accepteren uitstekende culturele kenmerken. Ze zijn multi-potent en kunnen mogelijk verschillende ziekten behandelen. Vetweefsel biedt een rijke bron van mesenchymale stamcellen.
Deze vetachtige MSC's kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit lipo-aspiraten met een hoge opbrengst in vergelijking met andere bronnen zoals beenmerg. En ze kunnen een goede bron zijn voor zowel autologe als allogene transplantatie. In deze video presenteren we een eenvoudig protocol voor isolatie en karakterisering van vet mesenchymale stamcellen uit rattenepidemaal vet.
Deze procedure is een eenvoudige, zeer efficiënte methode voor isolatie. Na isolatie zullen we de differentiatie van deze vet mesenchymale stamcellen in insulineproducerende cellen doorstaan met behulp van een eenvoudig, relatief kort protocol. We zullen beginnen met isolatie van vet mesenchymale stamcellen door collageenachtige vertering van epididymal vet om een sterkere vasculaire fractie te verkrijgen.
Dan zullen mesenchymale stamcellen worden gekenmerkt door hun plastic hechting, evenals expressie van CD-markers en differentiatie in meerdere mesodermale afstammingslijnen. Anesthiseer het dier en euthanaseer vervolgens met behulp van cervicale dislocatie. Spray over het hele lichaam met 70% ethanol en begin met excisie van de huid en de spieren aan de onderkant van de buik.
Stel vervolgens de teelballen bloot met het epididymale vet. Snijd voorzichtig het epididymale vet. Pas op dat je de bloedvaten niet doorsnijdt met de vetten.
Snijd in een bioveiligheidskast het vetweefsel in kleine stukjes met behulp van een tang en scalpel. Breng het vetweefsel over in een centrifugebuis met 10 milliliter steriel PBS. Begin met wassen door de Falcon-buis gedurende 45 seconden te kantelen.
Houd de buis vervolgens vijf minuten staan om in twee lagen te scheiden. Verwijder de infranated PBS met een spuit van 10 milliliter. Herhaal deze wasstappen vier tot vijf keer totdat PBS duidelijk is.
Na het wassen, suspensieer vetweefsel opnieuw in collageenoplossing en incubeer vervolgens in schudwaterbad totdat het weefsel bijna homogeen is. Vortex daarna het weefselcollageenmengsel gedurende 15 seconden en centrifugeer daarna gedurende vijf minuten. Na centrifugatie heb je drie lagen.
Gooi het supernatant voorzichtig weg over de stromale vasculaire fractie. Gooi eerst de olielaag aan de bovenkant voorzichtig weg, gevolgd door de echolaag zonder de stromale vasculaire fractiekorrel te verstoren. Suspensie de stromale vasculaire fractie opnieuw in steriel BSA en centrifugeer gedurende vijf minuten opnieuw.
Hele centrifugatie, plaats complete DMEM F-12 media in een vierkante kolf van 25 centimeter. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en suspensie de stromale vasculaire pellet opnieuw in volledige DMEM F-12-media. En overhevel naar de kweekfles.
Plaats in 37 graden 5% kooldioxide incubator. Verwijder de volgende dag niet-losse cellen en vervang de media door nieuwe media. Vanaf de volgende dag van isolatie zullen de fibroblastachtige cellen beginnen te verschijnen.
Geleidelijk aan naarmate de tijd verstrijkt, zullen ze in aantal en grootte toenemen. Door passaging worden cellen homogener. Deze cellen vertonen alle mesenchymale stamcelkarakteriseringscriteria.
Deze cellen werden gedifferentieerd naar insulineproducerende cellen met behulp van dit eenvoudige protocol dat nicotinamide bèta-mercaptoethanol en Exendin-4 bevat. Tijdens de differentiatiestappen beginnen de cellen hun fibroblastische vorm te verliezen en ik denk clusterachtige morfologie. Wanneer gebruikte insulineproducerende cellen positieve karmozijnrode disithone-kleuring vertonen, waarna gebruikte insulineproducerende cellen verschillende bètacelmarkers tot expressie brengen, zoals Pdx-1, mafA en insuline.
Bovendien scheiden geïnduceerde insulineproducerende cellen hogere niveaus van insuline in het supernatant af wanneer ze worden uitgedaagd met een hogere glucoseconcentratie. We hebben een gedetailleerd, stapsgewijs protocol verstrekt voor isolatie en karakterisering van vetmensachtige mesenchymale stamcellen. We bieden hier ook een relatief kort, eenvoudig en efficiënt protocol voor differentiatie van vet mesenchymale stamcellen in insulineproducerende cellen.
Dit biedt een toegangspoort voor onderzoekers om het veld van mesenchymale stamcellen te betreden en hun differentiatie in insulineproducerende cellen te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie en karakterisering van uit vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC's) uit epididymaal weefsel van ratten, gevolgd door hun differentiatie tot insuline-producerende cellen (IPC's). De beschreven methoden zijn eenvoudig en ontworpen voor een gemakkelijke toepassing in een laboratoriumomgeving.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Endocrinologie
Achtergrond
- Mesenchymale stamcellen (MSC's) kunnen worden afgeleid van verschillende weefsels, waaronder vetweefsel.
- Vetweefsel is een rijke bron van MSC's met gunstige kweekkenmerken.
- MSC's hebben het potentieel om te differentiëren in diverse celtypen, waaronder insuline-producerende cellen.
- Inzicht in het differentieproces kan helpen bij de ontwikkeling van therapieën voor diabetes.
Doel van de studie
- Om rat epididymale Ad-MSC's te isoleren en te karakteriseren.
- Om een protocol te ontwikkelen voor het differentiëren van deze cellen tot IPC's.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor toekomstig onderzoek in de regeneratieve geneeskunde.
Gebruikte methoden
- Isolatie van uit vetweefsel afgeleide MSC's uit rattenepididymale vetten.
- Karakterisering van geïsoleerde MSC's met behulp van standaardmarkers.
- Inductie van differentiatie tot insuline-producerende cellen.
- Beoordeling van de functionaliteit van IPC's na differentiatie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle isolatie van Ad-MSC's met karakteristieke oppervlaktemarkers.
- Aangetoonde differentiatie van Ad-MSC's tot IPC's.
- Functionele beoordeling toonde aan dat IPC's in staat zijn tot insulinesecretie.
- Het protocol biedt een reproduceerbare methode voor het genereren van IPC's uit Ad-MSC's.
Conclusies
- Ad-MSC's zijn een levensvatbare bron voor het genereren van insulineproducerende cellen.
- Het protocol kan verder onderzoek naar de behandeling van diabetes faciliteren.
- Toekomstige studies kunnen het therapeutische potentieel van deze IPC's verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel (Ad-MSC's) bieden een hernieuwbare, ethisch onbetwistbare bron voor het genereren van insuline-producerende cellen (IPC's) in diabetesonderzoek. Het protocol biedt een eenvoudige, reproduceerbare methode voor het isoleren en karakteriseren van Ad-MSC's uit epididymaal vet van ratten, gevolgd door differentiatie tot IPC's met behulp van gedefinieerde biochemische signalen. Deze aanpak ondersteunt doelvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege fase van therapeutische ontdekking voor metabole ziekten.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de multipotentie van MSC's en de lineage-committment richting het lot van pancreatische bètacellen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde bron van Ad-MSC's met bevestigde expressie van CD90, CD73 en CD105 voor reproduceerbare experimenten.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de functionele validatie van IPC's via glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) en dithizonkleuring, waarmee de bètacel-achtige functionaliteit wordt bevestigd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert IPC's die belangrijke transcriptiefactoren voor bètacellen (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1) tot expressie brengen voor gebruik in screeningsassays van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare productie van IPC's uit Ad-MSC's mogelijk voor high-throughput beoordeling van insulinesecretiedynamiek.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert assay-standaardisatie door consistente differentiatieprotocollen met gebruik van HG-DMEM, β-mercaptoethanol, nicotinamide en exendin-4.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Toont translationele relevantie aan door de productie van IPC's die reageren op glucosestress met een verhoogde inslinesectie.
- Operationele waarde: Ondersteunt preklinische continuïteit door een hernieuwbare cellenbron te bieden voor dosis-respons- en effectiviteitstests in diabetesmodellen.
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert biologische risico's door multipotentie te bevestigen via osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie voorafgaand aan de IPC-inductie.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor diabetestherapieën die gericht zijn op de vervanging of functie van bètacellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-toetsing met betrekking tot de plasticiteit van MSC's en lijnspecificatie met behulp van gedefinieerde differentiatieprikkels.
- Screening: Maakt de productie van assay-klare IPC's mogelijk met kwantificeerbare resultaten, zoals insulinesecretieniveaus en markerexpressie.
- Analytica: Biedt meetbare eindpunten, waaronder GSIS, dithizonkleuring en qPCR voor bètacelmarkers, om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro IPC-generatie met preklinische validatie via functionele insulinerelease-assays.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van IPC's uit vetweefselbronnen over meerdere projecten en cellijnen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij de generatie van IPC's door middel van karakterisering van meerdere lineages en functionele validatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid van de isolatie en differentiatie van Ad-MSC's tussen verschillende laboratoria.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen bij de vroege ontwikkeling van diabetestherapieën door het valideren van cellulaire modellen van bètacelfunctie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van stamcelgebaseerde benaderingen voor interventies bij metabole ziekten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, differentiatietechnieken en flowcytometrie voor immunofenotypering.
- Necessiteert toegang tot centrifuges, veiligheidskasten, incubatoren en apparatuur voor assays voor glucose-gestimuleerde insulinesecretie.
- Vereist standaardisatie van de digestie-, was- en plaatprocedures om een consistent rendement van de stromale vasculaire fractie te garanderen.
- Vereist aanpassing van de differentiatietiming en reagensconcentraties bij toepassing op verschillende adipose depots of soorten.
- Beperkt door de noodzaak van cellen in passage 3-5 om homogeniteit en multipotentie voor de inductie van differentiatie te waarborgen.
