Aangepaste techniek voor het gebruik van neonatale muizenharten in het Langendorff-preparaat

Deze aanpak stelt op betrouwbare wijze retrograde perfusie van het neonatale ex vivo muizenhart vast in minder dan drie minuten. Zo wordt de jongst mogelijke studieleeftijd teruggebracht van enkele weken naar 10 postnatale dagen. Dit geïsoleerde retrograde doordrenkte model maakt de studie van het neonatale hart mogelijk tijdens een kritieke periode van cardiale ontwikkeling in een genetisch aanpasbare en goedkope soort.

Terwijl dit model zich leent voor de studie van fysiologische en farmacologische reacties op ischemie-reperfusie in het neonatale hart. Het kan ook worden gebruikt voor cardiomyocytenisolatie. Om de pasgeboren muis aorta canule te fabriceren, gebruikt u een scherpe schaar om de punt af te snijden en het uiteinde van een 26 gauge roestvrijstalen naald af te stompen, waarbij u ervoor zorgt dat u niet krimpt of de diameter van het naaldlumen beperkt.

Maak vervolgens de snijrand glad om eventuele bramen te verwijderen door het afgestompte uiteinde voorzichtig op het blad van de laboratoriumbank te schrapen met behulp van een heen-en-weerbeweging. Bevestig vervolgens de gefabriceerde canule aan het Langendorff-apparaat en beoordeel de stroming en weerstand. Meet de stroomsnelheden door de canule door de bufferhoeveelheid gedurende een interval van één minuut te verzamelen en te meten.

Om het drukverschil over de canule te kwantificeren terwijl de Krebs-Heneseleit-buffer stroomt, meet u de druk in het systeem met en zonder de canule bevestigd. Bereken vervolgens de canuleweerstand met behulp van de volgende formule. Verwijder vervolgens de 26 gauge canule uit het Langendorff-apparaat en bevestig een hogedrukslang aan de cannulatieplaats op het apparaat.

Bevestig vervolgens de aortacanule aan het distale uiteinde van de buis en ontlucht de slang en de canule met zuurstofrijke buffer, zodat alle bellen worden verwijderd. Om de vorming van coronaire microtrombi te voorkomen, dient u een intraperitoneale injectie van heparine toe aan een 10 dagen oude muisjong met behulp van een naald van 26 gauge op een spuit van één milliliter. Laat de heparine enkele minuten circuleren voordat u doorgaat met de injectie van een verdovingsmiddel.

Plaats vervolgens de verdoofde muis in rugligging en beveilig ledematen onmiddellijk na bewustzijnsverlies. Begin met oogsten zodra het dier niet reageert op teenknijpen terwijl het dier spontaan ademt tijdens de eerste dissectie. Maak met behulp van een rechte ontleedschaar een dwarse subxiefoïde incisie over de breedte van de dieren waardoor de buikholte wordt blootgesteld.

Vraag een assistent om het xiphoid-proces met een tang vast te pakken, snijd vervolgens de ribbenkast bilateraal langs de middelste oksellijn in cefaladrichting en reflecteer het borstbeen en de ribben craniaal om de thoracale organen bloot te stellen. Nadat u het diafragma superieur hebt geïdentificeerd, snijdt u het voorste gedeelte volledig in. Identificeer de infradiaphragmatische inferieure vena cava boven de lever en transect deze met een gebogen Iris-schaar met behoud van een lichte inwendige incefaalspanning op het proximale segment met Iristang.

Knip vervolgens posterieur langs het binnenoppervlak van de wervelkolom met een gebogen Iris-schaar terwijl u de inferieure vena cava omhoog en uit de thoracale holte trekt. Terwijl het hart wordt gemobiliseerd, richt u de schaar naar voren en breekt u de grote bloedvaten superieur af om het hart en de longen volledig te verwijderen. Dompel het exemplaar onmiddellijk onder in ijskoude Krebs-Henseleit-buffer of zoutoplossing.

Het hart moet binnen enkele seconden stoppen met kloppen. Plaats een stuk keukenpapier op de bodem van een ondiep petrischaaltje om wrijving te bieden om het hart tijdens de cannulatie te stabiliseren. Bevochtig het keukenpapier met ijskoude Krebs-Henseleit buffer om te voorkomen dat het hart zich eraan hecht.

Plaats de voorbereide petrischaal onder de ontleedmicroscoop en pas de focus aan. Plaats nu de aortacanule bevestigd aan de hogedrukverlengingsbuis onder de ontleedmicroscoop, samen met een 5-0 zijden hechting losjes rond de naaf gebonden. Nadat u de weggesneden thoracale organen in de petrischaal hebt geplaatst, identificeert u de thymus aan de hand van zijn witte glans en twee lobben en oriënteert u het monster zodanig dat de thymus voorste en superieur is.

Vervolgens scheidt u met behulp van een tang botweg de lobben van de thymus die de grote bloedvaten blootlegt. Identificeer vervolgens de aorta door onderscheidende vertakkende kenmerken van de aortaboog te lokaliseren en transect deze net proximaal aan de subclavia arterie die opstijgt met behulp van een fijne scherpe schaar. Pak nu voorzichtig de getranseceerde aorta vast met behulp van een fijne gebogen tang in juwelierstijl en kan de aorta voorzichtig versieren met een stompe naald van 26 gauge, waarbij u ervoor zorgt dat de aortaklep niet wordt beschadigd.

Gebruik een fijne gebogen tang, pak de aorta rond de canule en initieer retrograde perfusie om de ischemische tijd te beperken. Vraag de assistent om de uiteinden van de losgebonden hechting vast te pakken en de aorta voorzichtig rond de canule te verstrikken. Maak de hechting boven of onder de fijne gebogen tang vast, span vervolgens de hechting aan en bevestig de geschiktheid van de coronaire stroom.

Koppel de hogedrukbuis los van het Langendorff-apparaat, pak de naaf van de canule vast en koppel de stompe naald los van de hogedrukverlengingsbuis. Bevestig vervolgens snel de naaf van de canule aan het apparaat. Zodra het hart in de gebruikelijke positie aan het Langendorff-apparaat is gehangen, wordt een adequate perfusie bevestigd.

Snijd voorzichtig de longen, thymus en overtollig weefsel af. Snijd vervolgens het rechter atrium in om het effluent van de coronaire sinus vrij te laten druppelen. Maak een kleine knoop aan het einde van een 5-0 zijden hechting, prik vervolgens een klein stukje paraffinefilm door met de naald en schuif de paraffine naar het geknoopte uiteinde.

Laat de naald voorzichtig door de top van de ventrikel gaan en trek de hechting door het hart totdat de paraffinefilm goed tegen de laterale wand van de ventrikel zit. Steek de naald door de opening van de met water gevulde warmtemantel van het Langendorff-apparaat, zodat het hart kan worden omhuld en verwarmd. Bevestig vervolgens de naald aan de krachtomvormer om het infuus van de coronaire sinus te voorkomen.

Pas de hechting aan om één tot twee gram basale spanning toe te passen zoals aangegeven door de diastolische spanning of nadir intention tracing. Plaats vervolgens oppervlakte-elektroden op de superieure en inferieure polen van het hart om het elektrocardiogram op te nemen. Bemonster ten slotte het effluent van de coronaire sinus voor analyse met behulp van een 24 gauge intraveneuze katheter.

Oppervlakte-elektroden werden gebruikt om een continu elektrocardiogram op te nemen, waarmee de intrinsieke snelheid en het ritme konden worden bepaald. Alle voldoende doordrenkte harten kloppen spontaan in sinusritme. Deze perfusiestrategie voldeed aan de metabole behoeften van het pasgeboren muizenhart, gezien de verwaarloosbare lactaatproductie en het lage percentage zuurstofextractie en glucoseverbruik.

Fysiologische variabele middelen, zoals de gemiddelde gedenervateerde intrinsieke hartslag en het gemiddelde waargenomen aortaperfusiedruk, werden ook geregistreerd en berekend. Sommige uitsluitingscriteria, zoals de tijd die nodig is om reperfusie te starten, de duur van aritmie en de aorta-perfusiedruk, moeten in aanmerking worden genomen om de consistentie van het neonatale preparaat te waarborgen. Na vaststelling van perfusie kan interventie optreden zoals medicijnafgifte, inductie van ischemie-reperfusieletsel, veranderingen van metabolieten of toediening van enzymatische middelen voor cardiomyocytenisolatie.