Dynamische monitoring van seroconversie met behulp van een multianalyt immunokraaltest voor Covid-19

De methode die we vandaag zullen demonstreren, biedt een high-throughput oplossing voor het evalueren van de sero-conversie van antilichamen geassocieerd met COVID-19-infecties of vaccinatie voor routineanalyses. Interessant is dat deze benadering ons in staat stelt om meerdere epitopen op dezelfde analyt te evalueren. Dit heeft tal van toepassingen in de biologische wetenschappen, waaronder celsignaleringsstudies en het monitoren van immuunresponsen.

Dr. Imad Tarhoni demonstreert deze techniek vandaag voor u, een postdoctorale fellow in mijn laboratorium. Selecteer om te beginnen drie verschillende injectieflacons van de magnetische microsferen met unieke kraalgebieden en noteer de kraal-ID en partij-informatie voor elke gebruikte injectieflacon. Vortex vervolgens de geselecteerde microsfeervoorraad gedurende 60 seconden en soniceer gedurende vijf minuten.

Breng 1,0 maal 10 keer 10 over op de zes kralen in een 1,5 milliliter laag eiwit bindende microcentrifugebuis en plaats de buis in een magnetische separator. om de scheiding gedurende 60 seconden toe te staan. Met de buis nog in de magnetische separator, verwijdert u voorzichtig het supernatant zonder de kraalkorrel te verstoren.

Verwijder de buis uit de magnetische afscheider en resuspenseer de kralen vervolgens met 100 microliter HPLC-water en vortex gedurende 30 seconden. Plaats de buis opnieuw gedurende 60 seconden terug in de magnetische separator en verwijder vervolgens het supernatant. Herhaal het wasprotocol twee keer.

Verwijder na de laatste wasbeurt de buis uit de magnetische separator en resuspenseer de gewassen microsferen in 90 microliter activeringsbuffer, pH 6,2, door vortex gedurende 30 seconden. Behandel vervolgens achtereenvolgens de microsferen met 10 microliter 50 milligram per milliliter anhydroxy-sulfosuccinamide en 10 microliter 50 milligram per milliliter EDC-oplossing per vortex gedurende 10 seconden. Incubeer later de microsferen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met elke 10 minuten een zachte vortex.

Was na incubatie de microsferen tweemaal met 50-millimolair MES of koppelingsbuffer, pH 5,0, zoals eerder beschreven. Herhaal het wassen twee keer. Als u klaar bent, verwijdert u de buis uit de magnetische separator en resuspenseert u de kralen met 100 microliter koppelingsbuffer per vortex gedurende 30 seconden, onmiddellijk gevolgd door het toevoegen van de gewenste hoeveelheid eiwit aan de buis.

Breng het totale volume op 150 microliter met koppelingsbuffer en meng de reactie per vortex gedurende 30 seconden. Incubeer vervolgens de buis gedurende twee uur door rotatie bij kamertemperatuur. Was na incubatie de microsferen tweemaal met PBS blusbuffer en resuspenseer de gewassen microsferen in 100 microliter blusbuffer met 0,05% natriumazide door vortex gedurende 30 seconden.

Tel het aantal herstelde microsferen met behulp van een geautomatiseerde celteller en noteer de waargenomen kraalconcentratie. Voor testprestaties resuspenseert u de gekoppelde microsferen gedurende 30 seconden door vortex en soniceert u gedurende 60 tot 90 seconden. Verwijder vervolgens de vereiste hoeveelheid van elk kraalcolloïde uit de respectieve buis en combineer de kralencolloïden in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Steek vervolgens de buis in een magnetische separator en laat scheiding gedurende 60 seconden toe. Met de buis nog in de magnetische afscheider, verwijdert u het supernatant zonder de kraalkorrel te verstoren. Nadat u de kralen uit de separator hebt verwijderd, resuspenseert u de kralen in 100 microliter testbuffer.

Vortex gedurende 30 seconden voordat u de buis gedurende 60 seconden in een magnetische separator plaatst om de kralen te scheiden. Herhaal het wassen twee keer. Pas vervolgens de concentratie van het drie-plex werkende microsfeermengsel aan door een geschikt volume testbuffer toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van 100 microsfeer per microliter voor elk doelwit te genereren.

Aliquot 25 microliter van het microsfeermengsel in elke put van een 96-well plaat. Verdun plasma- of serummonsters 500-voudig in testbuffer en bereid standaardmonsters volgens de gewenste titratie. Voeg 25 microliter testbuffer toe als blanco monster en voeg elk van de verdunde monsters of standaard toe aan elk aangewezen putje van een monsterplaat met 96 putten.

Als u klaar bent, bedekt u de plaat met een aluminium afdichting of folie om gedurende een uur bij kamertemperatuur te incuberen op een platenschudder die is ingesteld op 700 rotaties per minuut. Bereid een oplossing van anti-humane detectieantistoffen of secundaire antilichaamoplossingen op vier microgram per microliter met testbuffer zoals beschreven in het manuscript. Plaats de plaat op een magnetische afscheider om snel te wassen en keer de plaat vervolgens krachtig om over een biohazard-container om vloeistof uit de putten te verwijderen.

Met de plaat nog steeds omgekeerd, tik je de plaat krachtig tegen een dikke wad papier. Was vervolgens elke put met 100 microliter testbuffer en verwijder de vloeistof door krachtige inversie over een biohazard-container. Herhaal de was twee keer.

Gooi na de laatste wasbeurt alle gebruikte klodders papier weg in een biohazard-container. Voeg vervolgens 25 microliter secundaire antilichaamwerkoplossing toe aan elke put van een 96-wellsplaat en bedek de plaat met aluminiumfolie om te incuberen op een platenschudder met 700 rotaties per minuut. Was na 30 minuten incubatie de putjes van de plaat tweemaal met testbuffer zoals eerder aangetoond.

Voeg vervolgens 100 microliter testbuffer toe aan elk putje van de 96-wellplaat. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer gedurende vijf minuten op een platenschudder bij kamertemperatuur. Analyseer een monster van 60 microliter via de instrumentanalysator volgens de systeemhandleiding.

Voor optimalisatie van de incubatietijd van het monstervangst, incubeer de platen voor een duur van 30, 60 en 120 minuten. Analyseer na incubatie 60 microliter van het testmengsel op de analysator. Een zevenpunts standaardcurve op basis van een 1:5 seriële verdunningsreeks werd geëvalueerd voor de spike S1, de membraanantistoffen en de nucleocapside.

De intra-assay precisietest werd uitgevoerd op de plaat om de assayprecisie te evalueren, berekend als procentuele variatiecoëfficiënt, standaarddeviatie en gemiddelde. Voor inter-assay precisie werden drie verschillende batches van de kralensets voorbereid voor elke assay. Precisievariabelen van de test met de standaard en de menselijke plasmamonsters werden berekend.

De gemiddelde mediane fluorescentie-intensiteitswaarden na 120 minuten van de incubatie waren optimaal voor IgG-titers voor de spike S1, het membraan en de nucleocapside-antilichamen, wat wijst op een snelle primaire antilichaambindingkinetiek. Secundaire antilichaamconcentratie-optimalisaties in dual channel-prestaties toonden een breed scala aan signalen in lineaire meting voor alle concentraties. De waargenomen signalen van verschillende tijdincubaties van de secundaire antilichamen en de details over de signaalveranderingen voor alle incubatietijden worden hier weergegeven.

In de specificiteitsbeoordelingen voor dual-channel assays werd een verwaarloosbare kruissignaalverontreiniging waargenomen tussen het lege en het enkele reporterkanaal. In de illustratie van seroconversiegebeurtenissen na de COVID 19-vaccinatie waren de waargenomen piek S1 IgA- en IgM-waarden ongeveer 40 keer lager dan de IgG-isotypetiters. Deze methode heeft belangrijke implicaties voor het monitoren van de respons op vaccins bij immuungecompromitteerde personen.

Het zal ons in staat stellen om te bepalen of deze patiënten echt beschermd worden door die vaccinaties.