Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters
6 januari 2022
Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).
De isolatie van entomopathogene schimmels is belangrijk voor de ontwikkeling van een biopesticide en kan nuttig zijn om de diversiteit, verspreiding en ecologie van deze specifieke groep te bestuderen. Het gebruik van insectenaas om entomopathogene schimmels te isoleren wordt beschouwd als een goedkope en zeer efficiënte methode. chlooramfenicol, thiabendazool, cycloheximide, kunstmatige media gebruiken geen dodine en vereisen minder ruimte in het bodemmonsterproces.
Kritieke stappen omvatten het onderzoeken van CTC-platen na één en twee weken om te voorkomen dat andere schimmels vernauwen en entomopathogene schimmels in ontwikkeling zijn, en vervolgens het identificeren van entomopathogene schimmelkolonies op basis van hun macromorfologie en micromorfologie. Begin met het verzamelen van 800 gram grond tot een diepte van 10 centimeter met behulp van een kleine schop. Bewaar de monsters in polypropyleen zakken bij kamertemperatuur tot het begin van het experiment.
Kleine wortels kunnen ook worden verzameld, omdat bekend is dat entomopathogene schimmels rhizosfeercompetentie hebben. Voor isolatie van schimmels met chlooramfenicol, thiabendazool, cycloheximide of CTC selectief kunstmatig medium, weeg 0,35 gram van het bodemmonster met of zonder wortels. Plaats dit monster in een microbuisje van 1,5 milliliter.
Voeg tijdens het werken in een bioveiligheidskast een milliliter steriele 0,01 volumeprocent polyoxyethyleensorbutaanmonooleaat waterige suspensie toe aan de microbuis die aarde bevat en vortex de buis gedurende 30 seconden. Verwijder en pipetteer 50 microliter van het supernatant op het midden van petriplaten met CTC-medium. Gebruik vervolgens een steriele Drigalski-spatel met een diameter van zes millimeter om de suspensies homogeen over het oppervlak van het medium te verspreiden.
Incubeer de platen in klimaatkamers bij 25 graden Celsius en minimaal 80% relatieve vochtigheid in het donker. Na zeven, 14 en 21 dagen incubatie, observeer de platen voor de groei van schimmelkolonies. Om de schimmels te isoleren met behulp van oppervlakte gedesinfecteerde Galleria mellonella en Tenebrio molitor late stage larven als insectenaas.
Dompel de larve gedurende één minuut onder in 0,5% natriumhypochloriet voor sterilisatie. Was de larven vervolgens twee keer met steriel water. Monteer het aas in plastic potten met 10 kleine gaatjes van 10 millimeter diameter in het deksel met 250 gram van de verzamelde grond.
Homogeniseer de grond om de andere dag om maximaal contact van larven met aarde mogelijk te maken en analyseer de potten dagelijks, op zoek naar dode insecten. Na het verwijderen van dode insecten uit de pot, steriliseer insecten oppervlakkig met 0,5% natriumhypochloriet gedurende één minuut. Om de mycose te bevorderen, plaatst u de steriele insecten zeven dagen in een vochtige kamer met een relatieve vochtigheid van 80% en 25 graden Celsius.
Oogst bij mycose de conidia van het insectenoppervlak en plaats met behulp van de microbiologische lus de conidia op aardappel dextrose agar medium met 0,05% chlooramfenicol of PDAC-medium onder een stereoscopische microscoop. Plaats als alternatief de hele geïnfecteerde larven op het PDAC-medium. En incubeer de kweekplaten in een klimaatkamer zoals eerder uitgelegd.
Identificeer na 14 dagen incubatie de EPF-soorten door de macromorfologische kenmerken van de schimmelculturen op de platen te analyseren zoals beschreven in het manuscript. Breng vervolgens de luchtconidia gedurende drie dagen over naar schuifculturen bij 80% relatieve vochtigheid en 25 graden Celsius. Na drie dagen kleurt de dia met lactofenolblauw om de microscopische kenmerken te observeren.
Observeer onder een optische microscoop de schimmelstructuren zoals rangschikking, conidioforen, vorm en grootte van conidia op 400 keer en bevestig de EPF-identificatie. In de studie werden 51 EPF-stammen van Metarhizium- en Beaveria-soorten geïsoleerd uit 524 bodemmonsters. De representatieve analyse toont de micromorfologische kenmerken van enkele isolaten van Metarhizium-soorten en Beaveria-soorten.
Het voorkomen van EPF in de 24 bodemmonsters werd bestudeerd met behulp van drie verschillende isolatiemethoden. Galleria mellonella aas bleek efficiënter in de isolatie, gevolgd door Tenebrio molitor aas en CTC medium. Dezelfde 24 bodemmonsters toonden geen herstel van Beaveria-soorten, maar alleen Metarhizium.
De belangrijkste dingen om te onthouden zijn het overbrengen van de luchtconidia naar diacoat waarbij de microscoopkenmerken worden geobserveerd en de identificatie van entomopathogene schimmels wordt bevestigd met behulp van morfologische sleutels. Aanvullende methoden omvatten het gebruik van andere selectieve kunstmatige media met een specifieke chemische stof om de groei van verontreinigingen zoals dodine te verminderen. Het zoeken naar nieuwe schimmelisolaten met uitstekende biocontrolekenmerken is cruciaal voor het verhogen van de effectiviteit van schimmels bij de bestrijding van geleedpotigen en het verkennen van verdere vragen op het gebied van ongewervelde pathologie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de isolatie van entomopathogene schimmels uit tropische bodems met behulp van insectenaas, waarbij de efficiëntie van verschillende methoden wordt belicht. De isolatie is erop gericht het begrip van de schimmeldiversiteit te vergroten en bij te dragen aan de ontwikkeling van biopesticiden.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Entomopathogene schimmels
- Bodemmicrobiologie
- Ontwikkeling van biopesticiden
Achtergrond
- Kosteneffectieve methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels.
- Het belang van het analyseren van bodemmonsters voor ecologische studies.
- Het gebruik van selectieve media voor effectieve isolatie van schimmels.
Gebruikte methoden
- Isolatie van schimmels met behulp van insectenlokmiddelen (Galleria mellonella en Tenebrio molitor).
- Gebruik van selectieve kunstmedia (CTC-medium, aardappel-dextrose-agar).
- Microscopische observatie voor de identificatie van schimmelsoorten.
Belangrijkste resultaten
- 51 stammen van Metarhizium- en Beauveria-soorten geïsoleerd uit 524 bodemmonsters.
- Galleria mellonella-aas vertoonde de hoogste efficiëntie voor schimmelisolatie.
- Geen herstel van Beauveria-soorten uit de geteste monsters.
Conclusies
- De studie demonstreert effectief methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels.
- De bevindingen dragen bij aan onderzoek naar biologische bestrijding en potentiële landbouwkundige toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het isoleren van entomopathogene schimmels uit de bodem is een fundamentele stap bij de ontdekking van biopesticiden, waarbij de efficiëntie van de methode een directe impact heeft op de validatie van targets en de identificatie van lead-verbindingen. Door insectenlokmiddelen te vergelijken met selectieve media kan het risico bij de screening van antifungale kandidaten in een vroeg stadium worden verminderd, door de isolatieopbrengst te verhogen en het aantal fout-negatieven te reduceren. Dit vergroot de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van targets voor programma's ter bestrijding van arthropodenplagen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de schimmelbiodiversiteit in bodemecosystemen te onderzoeken om nieuwe Metarhizium- en Beauveria-stammen met potentiële bioactiviteit te identificeren.
- Operationele waarde: Methoden met insectenlokmiddelen (Galleria mellonella, Tenebrio molitor) bieden een hogere isolatie-efficiëntie dan CTC-medium, waardoor de toegang tot doelorganismen voor verdere karakterisering wordt vergroot.
- Translationele waarde: Geïsoleerde stammen ondersteunen het mechanistisch verminderen van risico's door fenotypische virulentie te koppelen aan genetische identiteit via morfologische en moleculaire identificatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gevalideerde schimmelisolaten voor de ontwikkeling van assays gericht op arthropodenpathogeniteit en gastheerbereikspecificiteit.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde isolatieprotocollen met behulp van insectenlokstoffen verbeteren de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van het herstel van schimmels over verschillende batches bodemmonsters.
- Klaar voor assay: Maakt de bereiding van zuivere culturen mogelijk voor de oogst van conidiën en morfologische bevestiging via preparaten, wat zorgt voor consistente inputs voor fenotypische screening.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Ziekterelevant systeem: Geïsoleerde EPF-stammen dienen als preklinische modellen voor het evalueren van virulentie tegen insectenplagen, wat aansluit bij de ontwikkeling van biologische bestrijdingsproducten.
- Voorspellend vertrouwen: Moleculaire identificatie van isolaten op soortniveau versterkt het vertrouwen in het doelwit en ondersteunt de selectie van stammen voor formulatiestudies.
- Continuïteit: Gevestigde isolatieworkflows maken longitudinale monitoring van de aanwezigheid van schimmels in landbouwgronden mogelijk, wat bijdraagt aan resistentiebeheer en strategieën voor stamrotatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De isolatiemethode past binnen vroege discovery-workflows, waarbij de teruggewonnen EPF-stammen worden onderworpen aan fenotypische screening op virulentie en gastheerspecificiteit, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-candidates in biopesticiden-pipelines.
- Discoverybiologie: Ondersteunt hypothese-testen over schimmelecologie en pathogeniteit door het mogelijk maken van het terugwinnen van EPF uit complexe bodemmatrices.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde schimmelpreparaten voor high-throughput virulentie-assays met insectgastheren.
- Analytiek: Resultaten van morfologische en moleculaire identificatie leveren kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor stamvergelijking en -selectie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt omgevingsisolatie met preklinische evaluatie via geconserveerde virulentiemechanismen in Metarhizium en Beauveria.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Het isolatieprotocol met insectenlokmiddelen kan worden gestandaardiseerd over verschillende locaties en bodemtypen, wat schaalbare banken van schimmelstammen mogelijk maakt voor toekomstige screeningscampagnes.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de diversiteit van doelwitorganismen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de selectie van EPF-doelwitten voor de ontwikkeling van biopesticiden.
- Operationele waarde: Methoden met insectenlokmiddelen bieden een hogere opbrengst en een lagere technische variabiliteit dan selectieve media, wat de succespercentages van isolatie verbetert.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk bij de prioritering van stammen door de toegang tot virulente isolaten uit milieu monsters te vergroten.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde voortgang door de pool van gekarakteriseerde EPF-stammen met bevestigde morfologie en identiteit uit te breiden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met insecten, schimmelmorfologie en aseptische technieken voor de bereiding van lokmiddelen en het oogsten van conidiën.
- Klimaatgecontroleerde incubatiekamers zijn nodig om 25°C en 80% luchtvochtigheid te handhaven voor schimmelgroei en de inductie van mycose.
- Standaardisatie tussen teams vereist consistente sterilisatie van lokmiddelen, homogenisatie van de bodem en consistente tijdlijnen voor de verwerking na de mycose.
- Aanpassing aan verschillende bodemtypen kan aanpassingen vereisen in de blootstellingstijd aan het lokmiddel en het bodemvolume, afhankelijk van de prevalentie van inheemse EPF.
- Beperkingen omvatten de afhankelijkheid van de levensvatbaarheid van de larven en omgevingsfactoren die het succes van de mycose beïnvloeden, zoals blijkt uit de afhankelijkheid van het protocol van vochtige kamers en sterilisatiestappen van het oppervlak.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
