Kwantificeren van ijzertransport over de placenta van de muis in vivo met behulp van niet-radioactieve ijzerisotopen

Dit protocol is belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om de ijzerdistributie in vivo te volgen en te kwantificeren zonder dat er radioactiviteit nodig is. Omdat meerdere stabiele ijzerisotopen gelijktijdig binnen hetzelfde monster kunnen worden gedetecteerd, kan deze techniek worden gebruikt om de opname, regulatie en distributie van ijzer uit verschillende bronnen te begrijpen. Voeg om te beginnen 12 normaal zoutzuur toe aan de ijzer-58 in de glazen injectieflacon die door de verkoper wordt geleverd en vervang de dop losjes.

Om het ijzer op te lossen, verwarmt u de oplossing gedurende een uur op 60 graden Celsius. Als het nog steeds niet is opgelost, laat de oplossing dan een nacht op kamertemperatuur in de zuurkast om op te lossen. Om vervolgens de ijzerchlorideoplossing te genereren, oxideert u het resterende ijzerchloride door de oplossing op te warmen tot 60 graden Celsius met de dop eraf om oxidatie te vergemakkelijken.

Voeg één microliter van 35% waterstofperoxide per 50 microliter van de oplossing toe om oxidatie verder te vergemakkelijken. Laat de ijzerchlorideoplossing in de kap op 60 graden Celsius met de dop eraf om het monster te verdampen. Reconstitueer vervolgens het ijzerchloride tot 100 millimol met ultrapuur water.

Bereken de benodigde hoeveelheid water op basis van het initiële metaalgewicht. Bereid vervolgens een milliliter ijzernitronitraat door de bereide ijzerchlorideoplossing met nitrilotriacetaat te incuberen in een verhouding van één tot vijf molair in aanwezigheid van 20 millimolair natriumbicarbonaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Los vervolgens 500 milligram apotransferrine op in vier milliliter transfer- en laadbuffer en voeg vier milliliter van deze apotransferrine-oplossing toe aan de bereide ijzernitronitraatractaatoplossing in de buis van 15 milliliter.

Om een maximale belasting van ijzernitrienitrillacetaat op apotransferrine mogelijk te maken, controleert u of de oplossing een pH van 7,5 heeft en past u de pH indien nodig aan met natriumbicarbonaat of zoutzuur. Incubeer het mengsel gedurende 2 1/2 uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het overtollige ongebonden ijzernitriecetaat en vrijgegeven nitrilotriacetaat door de ijzer-58 transferrine-oplossing over te brengen naar een moleculaire gewichtsafsnijdingskolom en de kolom te centrificeren.

Was de kolom na centrifugeren tweemaal door 10 milliliter transferrine-laadbuffer toe te voegen en de kolom te centrifgeren. Was vervolgens de kolom met 10 milliliter zoutoplossing en centrifugeer opnieuw. Steriliseer ten slotte de ijzer-58 transferrine-oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 micron en bewaar bij vier graden Celsius totdat het klaar is voor gebruik.

Bereid een 35 milligram per milliliter ijzer-58 transferrine oplossing in zoutoplossing. Plaats vervolgens een verdoofde zwangere muis op een verwarmingskussen en injecteer langzaam en voorzichtig de ijzer-58 transferrine-oplossing in de retro-orbitale sinus. Zes uur na de injectie euthanaseer de muis en verwijder de baarmoeder voorzichtig met een steriele tang en dissectieschaar.

Snijd een foetale placenta-eenheid af bestaande uit een enkele foetus en placenta in de vruchtzak omringd door een deel van de baarmoeder. Snijd vervolgens voorzichtig door de baarmoeder en vruchtzak zonder de foetus en placenta te verstoren. Pel vervolgens de vruchtzak af en verwijder de foetus en placenta.

Nadat u de navelstreng hebt doorgesneden, dep u de foetus en de placenta op een schoon taakdoekje om overtollig vruchtwater te verwijderen en het gewicht van de hele placenta vast te leggen. Snijd elke placenta doormidden met een scheermesje. Plaats elke helft in een buis van twee milliliter en vries in vloeibare stikstof.

Om de embryolevers te verzamelen, offert u het embryo op en pint u het embryo vast voor stabilisatie, waardoor de buik bloot komt te liggen. Maak met behulp van een dissectieschaar een kleine incisie waar de navelstreng aan vast zat. Steek het ene uiteinde van de dissectieschaar in de incisie en voer een 1/4-inch mediaanvlak uit dat naar het coronale vlak wordt gesneden.

Voer vervolgens dwarsvlaksneden uit om de foetale lever bloot te leggen. Verwijder met behulp van een tang de foetale lever en noteer het gewicht van de hele embryolever. Plaats de hele embryolever in een buisje van twee milliliter en vries het in vloeibare stikstof.

Bewaar de weefsels voor onbepaalde tijd bij min 80 graden Celsius. Om het niet-heemijzer in de placenta en foetale levers te kwantificeren, ontdooit u de placentahelften en hele foetale levers. Weeg vervolgens de placentahelften.

Voeg 400 microliter eiwitprecipitatieoplossing toe aan de weefselmonsters en homogeniseer het weefsel met behulp van een elektrische homogenisator. Incubeer de monsters bij 100 graden Celsius gedurende een uur. Koel ze vervolgens twee minuten af op water op kamertemperatuur.

Open de doppen om druk los te laten. Sluit vervolgens de buizen weer. Nadat u het monster hebt gecentrifugeerd om het weefselafval te pelleteren, brengt u het supernatant voorzichtig over naar een nieuwe gelabelde buis voor ICP-MS-analyse.

Naast het kwantificeren van het heemijzer, registreert u het gewicht van de pellet verkregen na centrifugatie. Verwerk vervolgens de pellets in 10 milliliter geconcentreerd 70% salpeterzuur, aangevuld met één milliliter 30% waterstofperoxide. Verwarm de monsters gedurende 15 minuten tot 200 graden Celsius voordat u ze verzendt voor ICP-MS-analyse.

ICP-MS-meting maakte de detectie van twee verschillende ijzerisotopen mogelijk. De meest voorkomende ijzerisotoop, ijzer-56, weerspiegelt chronische ionenveranderingen in weefsels. Een andere isotoop, ijzer-58, weerspiegelt acute veranderingen in de verdeling van het geïnjecteerde ijzer.

IJzer-56-meting bevestigde dat embryolevers van ijzerdeficiënte zwangerschappen verminderde ijzervoorraden hadden in vergelijking met die bij ijzerrijke zwangerschappen. Iron-58-meting bevestigde dat bij ijzerdeficiënte zwangerschappen gedurende zes uur minder ijzer werd overgebracht naar de embryolever dan bij ijzerrijke zwangerschappen. Vergeet tijdens het uitvoeren van de procedure niet om het gewicht van de weefsels te registreren.

Deze gewichten zijn nodig om ijzerconcentraties te berekenen. Aangezien ijzer-58 geen speciale voorzorgsmaatregelen voor hantering en verwijdering vereist, kan onbewerkt weefsel worden gebruikt voor andere analyses, waaronder, maar niet beperkt tot western blotting, of qPCR.