Name: Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Leer hoe u bacteriële zwermmotiliteit kwantificeert op gradiëntplaten met inductoren. Deze kosteneffectieve high-throughput methode volgt chemotactische reacties voor microbiologisch onderzoek en drugsscreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De ontwikkeling van deze techniek werd ondersteund door de fondsen van het National Key R & D-plan van het ministerie van Wetenschap en Technologie (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) en Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). We willen graag onze oprechte dank uitspreken aan Miss Chen Xinyi voor haar hulp bij het proeflezen van het document en laboratoriumbeheer.

1. Bereiding van gradiënt zwermplaten
<ol><li>Bereiding van zwermmedium OPMERKING: Zie de discussiesectie voor een korte vergelijking van verschillende mediumviscositeiten; In dit protocol werd 0,7% (w/v) agarconcentratie van zwermmedium gebruikt.<ol>
<li>Bereid Lysogeny bouillon (LB) poeder met agar in twee conische kolven; elke kolf bevat 2 g trypton, 2 g natriumchloride, 1 g gistextract en 1,4 g agar. Voeg dubbel gedestilleerd water (ddH2O) toe en roer de suspensie met een magnetische roerstaaf. Pas het uiteindelijke volume aan op 200 ml door extra ddH2O toe te voegen.</li>
		<li>Autoclaaf de oplossing bij 121 °C gedurende 20 minuten. Gebruik een luchtdoorlatende dop of flesafdichtingsfolie met een ventilatieopening. OPMERKING: Agar zal oplossen wanneer het in de autoclaaf wordt verwarmd.</li>
		<li>Wanneer de temperatuur daalt tot 65 °C, mengt u de oplossing om homogeniteit te garanderen en brengt u het medium over naar een incubator of waterbad van 65 °C voor kortdurend gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van bodemlaag zwerm medium OPMERKING: Het medium van de onderste laag is het mengsel van zwermmedium en inductorvoorraadoplossingen. De formulering van inductorgradiënt zwermplaten is weergegeven in tabel 1.<ol>
<li>Bereid een 100 mM resveratrol stockoplossing door 114,12 mg gelyofiliseerd resveratrolpoeder op te lossen in 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaar de oplossing bij -20 °C.</li>
		<li>Bereid een 20% (w / v) arabinose stockoplossing door 6 g arabinosepoeder op te lossen in 30 ml ddH2O; wacht 10-15 minuten om de arabinose te laten oplossen; en bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Haal het medium uit de incubator van 65 °C en plaats het op kamertemperatuur; laat het zwermmedium afkoelen totdat de Erlenmeyer koel genoeg is om vast te houden (~50 °C). Plaats het zwermmedium niet gedurende lange perioden op kamertemperatuur, omdat dit de stolling van agar zal veroorzaken.</li>
		<li>Voeg het vereiste volume van de inductorvoorraadoplossing toe aan het zwermmedium bij 50 °C (tabel 1). Gebruik een pipet om de inductoroplossing af te geven in plaats van deze te gieten. Draai zachtjes om de inductor te mengen met het zwermmedium. OPMERKING: Deze stap is voor inductoren die niet kunnen worden geautoclaveerd. Pas op dat u geen bubbels in het medium introduceert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van dubbellaagse gradiënt zwermplaten OPMERKING: Het medium van de bovenste laag is LB-medium met 0,7% (w / v) agar.<ol>
<li>Etiketteer 13 vierkante petrischalen van 13 x 13 cm met inductornaam en spanningen en plaats de schalen over de rand van de deksels (figuur 1B).</li>
		<li>Voeg 40 ml warm medium op de bodemlaag (50 °C) toe met behulp van een pipet van 50 ml of een centrifugebuis van 50 ml. OPMERKING: Als alternatief is voor vierkante petrischalen van 13 x 13 cm 40 ml onderlaag en medium van de bovenste laag geschikt; voor vierkante petrischalen van 10 x 10 cm is een onderlaag van 25 ml en medium in de bovenste laag geschikt.</li>
		<li>Laat het medium van de onderste laag 1 uur onbedekt uitharden in een laminaire stromingskap. Verstoor vierkante petrischalen niet terwijl het medium stolt. OPMERKING: Tijdens het uitharden van de onderste laag moet zwermmedium zonder inductoren worden bewaard in een incubator of waterbad van 65 °C.</li>
		<li>Zodra de onderste laag volledig is gestold, verwijdert u de deksels en legt u de vierkante petrischalen in een laminaire stroomkap.</li>
		<li>Voeg 40 ml warm medium van de bovenste laag (50 °C) toe met een pipet van 50 ml of een centrifugebuis van 50 ml. OPMERKING: Het medium van de bovenste laag bevat geen inductoren.</li>
		<li>Laat de dubbellaagse platen op het tafelblad afgedekt en ongestoord gedurende 1 uur uitharden. Bewaar de bereide borden bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur. OPMERKING: Langere uithardingstijden zouden het vochtgehalte verminderen en de zwermmotiliteit beperken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Groei van E. coli K12 en P. aeruginosa PAO1
<ol><li>Bereid 500 ml LB-medium door 5 g trypton, 5 g NaCl en 2,5 g gistextract toe te voegen aan ddH2O en vul de oplossing aan tot 500 ml. Autoclaaf de oplossing gedurende 20 minuten in vloeibare cyclus bij 121 °C en bewaar deze bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid 100 ml 1,5% (w/v) LB-agar medium door 1 g trypton, 1 g NaCl, 0,5 g gistextract en 1,5 g agar toe te voegen aan ddH2O en vul de oplossing aan tot 100 ml. Autoclaaf de oplossing gedurende 20 minuten op vloeistofcyclus bij 121 °C. Breng het medium over in een waterbad van 50 °C om te voorkomen dat de agar stolt.</li>
	<li>Wanneer de LB-agar medium kolf comfortabel vast te houden is, voeg dan 20 ml LB-agar medium toe aan een petrischaaltje (10 cm in diameter) met behulp van een pipet van 25 ml. Laat de plaat een nacht op kamertemperatuur staan en bewaar de LB-agarplaat bij 4 °C.</li>
	<li>Inventariseer culturen die zijn opgeslagen bij -80 °C, streak E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 en P. aeruginosa PAO1-YdeH-stammen op LB-agar Petrischalen met behulp van wegwerpinentingslussen. Incubeer de petrischaaltjes 's nachts omgekeerd bij 37 °C.</li>
	<li>Kies enkele kolonies voor verschillende stammen uit de petrischalen, ent elke kolonie in 5 ml LB-medium en incubeer de cultuur bij 37 ° C in een laboratorium orbitale shaker ingesteld op 220 tpm.</li>
	<li>Wanneer de kweekdichtheid OD600nm ~ 1.0 bereikt, verwijdert u de cultuur uit de shaker en plaatst u deze op kamertemperatuur. Pas de cultuurdichtheid aan op OD600nm = 1.0, zoals beschreven in stap 3.2.1.</li>
</ol>3. Inenting en incubatie van gradiënt zwermplaten
<ol><li>Voorbereiding van inentingsputten OPMERKING: 3D-printdekselmodellen die in staat zijn om putten te genereren die door een standaardafstand worden gescheiden, kunnen worden gebruikt in plaats van de hieronder beschreven methode (aanvullende figuur S1).<ol>
<li>Markeer de putposities op A4-papier in figuur 1C. Stel drie testconcentraties in één vierkante petrischaal met twee of drie replicaties.</li>
		<li>Plaats het gemarkeerde A4-papier onder een gestolde verloopplaat. Duw de bredere zijde van een pipetpunt van 100 μL in het halfvaste mediumoppervlak op de gemarkeerde positie. Druk op de pipetpunt totdat deze de onderkant van het medium van de bovenste laag bereikt.</li>
		<li>Wanneer de punt de onderkant raakt, oefent u geen verticale kracht uit op de punt; draai de punt voorzichtig om de inhoud van de cilindrische put te isoleren.</li>
		<li>Beweeg de pipetpunten horizontaal over een zeer kleine afstand om luchtstroom in de smalle plaats mogelijk te maken. Druk met de wijsvinger op de punt om de gasstroom in de punt te blokkeren terwijl u de pipet vasthoudt met de duim en middelvinger.</li>
		<li>Trek de punt verticaal naar buiten, houd de put in de punt terwijl je hem eruit trekt. OPMERKING: Als de inhoud van de put wegglijdt, oefen dan iets meer druk uit met de wijsvinger om de punt volledig af te sluiten.</li>
		<li>Herhaal stap 3.1.2 tot en met 3.1.5 in elke gemarkeerde positie. Dek de zwermplaat af voor inenting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gradiëntplaatinenting en incubatie<ol>
<li>Pas de nachtelijke groeicultuurdichtheid aan op OD600nm = 1,0.</li>
		<li>Pipetteer 80 μL van de nachtelijke groeicultuur in elke put. Mors de bacteriecultuur niet buiten de putten.</li>
		<li>Wikkel de platen in met afdichtfolie. Voor langdurige observatie (3-5 dagen), wikkel de platen met steriele laboratoriumrubbertape. OPMERKING: Rubbertape zal minder snel breken.</li>
		<li>Plaats een bekerglas gevuld met ddH2O in de incubator om de luchtvochtigheid in de incubator te behouden. Incubeer de gradiënt zwermplaten bij 37 °C. OPMERKING: Incubeer de zwermplaten niet ondersteboven; hierdoor zal de bacteriekweek uit de putten lekken.</li>
		<li>Stel je de zwermplaat direct na inenting voor en noteer dit als het 0 uur-tijdspunt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Beeldvorming bacteriële oppervlakte zwermen
<ol><li>Haal de zwermplaten elke 12 uur één voor één uit de couveuse, houd de plaat horizontaal vast en plaats ze in het gelbeeldvormingssysteem (zie de tabel met materialen). OPMERKING: Laat geen vingerafdrukken achter op het oppervlak van platen; houd de zijkant van de zwermplaat met schone handschoenen vast.</li>
	<li>Selecteer de gelbeeldvormingsmodus ; stel de zwermplaat bloot aan wit licht; en pas de brandpuntsafstand aan om het duidelijkste zicht op zwermen te geven. OPMERKING: Gebruik dezelfde brandpuntsafstand voor alle platen in een bepaalde batch.</li>
	<li>Verbeter de helderheid van de zwermen voor duidelijke waarneming door de belichtingstijd aan te passen tot 300 ms. Pas de drempel aan om interferentie van het achtergrondlicht tot een minimum te beperken. OPMERKING: De drempel wordt aangepast op de bedieningsinterface van het gelbeeldvormingssysteem. Verhoog de waarden aan de linkerkant om interferentie van achtergrondlicht te minimaliseren; verlaag de waarden aan de rechterkant om de helderheid van de zwermen te verbeteren. In dit protocol ligt de regio meestal tussen de 6.000 en 50.000.</li>
	<li>Sla het afbeeldingsbestand op voor verdere analyse. Noteer de beeldtijd, het type inductor, de gradiëntoriëntatie en de spanningen in een .txt bestand.</li>
</ol>5. Kwantificeer het zwermgebied met behulp van ImageJ-software
<ol><li>Importeer het afbeeldingsbestand dat is verkregen met behulp van het gelbeeldvormingssysteem.</li>
	<li>Stel de schaalbalk in met behulp van ImageJ-software en pas deze toe op alle afbeeldingen.<ol>
<li>Maak een lijnsegment dat de lengte van het bord markeert door op het lijngereedschap te klikken.</li>
		<li>Klik op | analyseren Stel Schaal in om het venster Schaal instellen te openen.</li>
		<li>Typ de werkelijke lengte in Bekende afstand en Lengte-eenheid. OPMERKING: Omdat in dit werk vierkante petrischalen van 13 x 13 cm werden gebruikt, is de werkelijke lengte '130' en de lengte-eenheid 'mm'.</li>
		<li>Vink het vakje Algemeen aan.</li>
		<li>Voeg een schaalbalk in door te klikken op | analyseren Gereedschap | Schaalbalk, typ Breedte in mm, Hoogte in pixels, Tekengrootte en selecteer Kleur, Achtergrond en Locatie in het vervolgkeuzemenu. U kunt ook Vetgedrukte tekst, Tekst verbergen, Schreeflettertype en Overlay kiezen door de selectievakjes aan te vinken. OPMERKING: De keuze van deze parameters wordt bepaald door gebruikers en de eigenschappen van de afbeeldingen. In dit protocol werd Breedte in mm ingesteld op 25, Hoogte in pixels op 20, Lettergrootte op 80 en de schaalbalk werd in de rechterbenedenhoek geplaatst door Locatie | Rechtsonder. Andere parameters kunnen door de gebruiker worden gekozen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klik op | Schaduwen om de scherpte van het beeld te verbeteren, met name de grenzen (aanvullende figuur S2A). Klik op | Verwerken Batch om afbeeldingen te verwerken. OPMERKING: Het doel van deze stap is om een nauwkeurigere grensafbakening te bieden.<ol>
<li>Verwerk een afbeelding als referentie door te klikken op Proces | Schaduwen | Zuid.</li>
		<li>Klik op | Batch | Macro om het venster Batchproces te openen. Zoek naar de volgende opdrachten die in het venster worden weergegeven: run("Zuid"); run("Opslaan"); sluiten();</li>
		<li>Typ het mapadres van de oorspronkelijke afbeeldingen en het adres van het uitvoerbestand door te klikken op Verwerken in het venster Batchproces . OPMERKING: Het wordt aanbevolen om afbeeldingen met schaduwen naar een andere map te exporteren en een kopie van de originele afbeeldingen te behouden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik het gereedschap Toverstaf (overtrekken) om zwermen afzonderlijk te selecteren en de tolerantie aan te passen (dubbelklik op het gereedschap Staaf (overtrekken) totdat de gegenereerde lijn correct op de zwermgrens past (aanvullende afbeelding S2B). OPMERKING: Klik eerst op Wand (overtrek) gereedschap en selecteer een zwerm op één afbeelding. Als de grenzen niet correct zijn weergegeven, dubbelklikt u op het gereedschap Toverstaf (overtrekken) om de vensters van het gereedschap Staaf te openen, waar de tolerantie kan worden aangepast.</li>
	<li>Klik op | analyseren Meting om de oppervlaktewaarde te exporteren.</li>
	<li>Herhaal stap 5.1.1-5.1.5 totdat alle zwermen zijn gemeten, sla de resultaten op in een .csv bestand voor verdere analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).</li>
<li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+swarming%3A+a+re-examination+of+cell-movement+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li>
<li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847(2018).</li>
<li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Hellenic+Plant+Protection+Journal%22%5BJournal%5D)">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li>
<li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li>
<li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710(2018).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae%2C+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840(2018).</li>
<li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li>
<li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type%3A+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li>
<li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36(2008).</li>
<li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physical+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li>
<li>Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrahmachari%2C+PV+%22Implication+of+quorum+sensing+system+in+biofilm+formation+and+virulence%22">Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence</a>. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).</li>
<li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li>
<li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).</li>
<li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li>
<li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842(2017).</li>
<li>Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915(2020).</li>
<li>Hölscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752(2016).</li>
<li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators%2C+including+MetR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li>
<li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102(2001).</li>
<li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+behavior%2C+growth%2C+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480(2020).</li>
<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li>
<li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+swarming+motility%2C+biosurfactant+synthesis%2C+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Onderzoek naar bacteriële zwermmotiliteit op semisolide gradiëntplaten kan een uitdagende taak zijn18,19,20, omdat het meerdere factoren omvat, zoals substraatviscositeit, vochtigheid en mediumcomponenten. Onder deze factoren speelt de agarconcentratie een beslissende rol bij het bepalen van microbiële terugkeer naar zwemmende of zwermmotiliteit. Naarmate de agarconcentratie toeneemt van 0,3% (w/v) naar 1% (w/v), zal de bacterië...

Bacteriële zwermmotiliteit verwijst naar de collectieve migratie van bacteriële cellen over het oppervlak van een stof. Naast semisolide agarplaten die speciaal in het laboratorium zijn bereid1, wordt dit fenotype ook waargenomen op sommige zachte substraten zoals dierlijke weefsels2, gehydrateerde oppervlakken3 en plantenwortels4. Hoewel een halfvast oppervlak wordt beschouwd als een van de fundamentele voorwaarden voor bacteriële zwermen, hebben sommige soorten ook een energierijk medium nodig om hun zwermmotiliteit te ondersteunen5. Flagellarotatie drijft zowel zwemmende als zwermende motiliteit-zwemmen beschrijft de eencellige motiliteit in een vloeibare omgeving, terwijl zwermen de synchrone beweging is van een microbiële populatie over semisolide oppervlakken.
Substraatviscositeit beïnvloedt bacteriële motiliteit; studies van pathogene microben, zoals Helicobacter pylori, hebben aangetoond dat de beweeglijkheid van de ziekteverwekker verandert afhankelijk van de viscositeit van de mucinelaag, die wordt beïnvloed door omgevingsverzuring in de menselijke gastheer6. Om deze omgevingen te repliceren, beperken eerdere studies met een agarconcentratie van meer dan 0,3% (w / v) de bacteriële zwemmotiliteit om een geleidelijke verschuiving naar oppervlaktezwermen te bewerkstelligen. Het gebruik van een agarconcentratie van meer dan 1% (w/v) voorkomt de zwermmotiliteit van veel soorten7. De koloniepatronen die op het oppervlak worden gevormd, zijn divers, waaronder featureless mat8, bull's eye9, dendrieten10 en vortex11.
Hoewel de relevantie van dergelijke patronen onduidelijk blijft, lijken die patronen afhankelijk te zijn van omgevings- en chemische signalen12. Omgevingssignalen hebben betrekking op verschillende aspecten, waaronder temperatuur, zoutgehalte, licht en pH, terwijl chemische signalen de aanwezigheid van microbiële quorumdetectiemoleculen, biochemische bijproducten en voedingsstoffen omvatten. Auto-induceer quorum sensing signaling molecules zoals AHL (N-hexanoyl-L homoserine lacton) kunnen oppervlaktezwermen beïnvloeden door de productie van oppervlakteactieve stof13,14 te reguleren. Resveratrol, een fytoalexineverbinding, zou bacteriële zwermmotiliteit kunnen beperken15.
In het huidige werk onderzoeken we het effect van gradiëntconcentraties van resveratrol op de wild-type Escherichia coli K12-stam en onderzoeken we arabinose-induceerbare zwermmotiliteit van gemanipuleerde E. coli K12-YdeH- en Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-soorten. De productie van het YdeH-enzym wordt geïnduceerd door arabinose via de araBAD-promotor, wat resulteert in cellulaire c-di-GMP-verstoring en de bacteriële zwermmotiliteit beïnvloedt16,17. Dit induceerbare zwermgedrag wordt bestudeerd met behulp van arabinose gradiënt zwermplaten met E. coli K12-YdeH en P. aeruginosa PAO1-YdeH stammen.
De gradiëntzwermplaten worden bereid door achtereenvolgens dubbellaags medium te stollen (figuur 1B). De onderste laag bestaat uit het medium dat met de inductor is toegevoegd en aan één kant van een gestut petrischaaltje wordt gegoten. Na de stolling van de onderste laag wordt de petrischaal teruggebracht naar een plat oppervlak, waar de bovenste laag met het medium zonder de inductor vanaf de andere kant van de plaat wordt toegevoegd. Nadat de zwermplaten volledig zijn gestold, worden isometrisch gerangschikte houderputten geproduceerd door gaten op de zwermplaten te boren volgens een vaste lay-out (figuur 1C) of door de putten te bedrukken met behulp van een 3D-geprint model van het plaatdeksel met haringen tijdens het medium uithardingsproces (aanvullende figuur S1). Een gelbeeldvormingssysteem wordt gebruikt om de zwermende morfologieën op verschillende tijdstippen vast te leggen (figuur 2). Analyse van oppervlaktezwermen met behulp van ImageJ-software (aanvullende figuur S2) levert kwantitatieve resultaten op van het oppervlaktezwermproces (figuur 3).
Daarom stellen we een eenvoudige methode voor om de oppervlaktezwermmotiliteit te testen binnen een concentratiebereik van inductoren. Deze methode kan worden gebruikt om meerdere concentratieresponsen van andere inductoren te testen door de inductor in het medium van de onderste laag te mengen en kan worden toegepast op andere beweeglijke soorten (bijv. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Deze aanpak zou betrouwbare kwalitatieve en kwantitatieve resultaten kunnen opleveren voor het screenen van een enkele chemische inductor, en afzonderlijke platen kunnen worden gebruikt om meer chemische inductoren te evalueren.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td>25 g, &ge; 85% (GC)</td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Cryogenic vial</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Aladdin</td><td>D103272</td><td>AR, > 99% (GC)</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose</td><td>Aladdin</td><td>A106195</td><td>98% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM90-15</td><td>Kunststof petrischalen,rond,90 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Aladdin</td><td>R107315</td><td>99% (GC), 25 g</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Macklin</td><td>S805275</td><td>AR, 99,5% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Vierkante petrischalen</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM130F</td><td>Kunststof petrischalen, vierkant, 13 mm x 13 mm</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0042</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0021</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Uitrustingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biochemische incubator</td><td>Blue pard</td><td>LRH-70</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 5200multi beeldvormingssysteem</td><td>Tanon</td><td>5200CE</td><td></td></tr><tr><td>Thermostaat waterbad</td><td>Jinghong</td><td>DK-S28</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacteriële zwermmotiliteit is een veel voorkomend microbiologisch fenotype dat bacteriële gemeenschappen gebruiken om over semisolide oppervlakken te migreren. Bij onderzoeken naar geïnduceerde zwermmotiliteit kan de specifieke concentratie van een inductor mogelijk geen gebeurtenissen melden die zich voordoen binnen het optimale concentratiebereik om de gewenste reacties van een soort uit te lokken. Semisolide platen met meerdere concentraties worden vaak gebruikt om de respons binnen een inductorconcentratiebereik te onderzoeken. Afzonderlijke halfvaste platen verhogen echter de variaties in de gemiddelde viscositeit en het vochtgehalte in elke plaat als gevolg van de niet-uniforme stollingstijd.
Dit artikel beschrijft een eenstapsmethode om tegelijkertijd de zwermmotiliteit van het oppervlak te testen op een enkele gradiëntplaat, waarbij de isometrisch gerangschikte testputten de gelijktijdige verwerving van multiconcentratieresponsen mogelijk maken. In het huidige werk werd de oppervlaktezwerm van Escherichia coli K12 en Pseudomonas aeruginosa PAO1 geëvalueerd als reactie op een concentratiegradiënt van inductoren zoals resveratrol en arabinose. Periodiek werden de zwermmorfologieën in beeld gebracht met behulp van een beeldvormingssysteem om het hele oppervlaktezwermproces vast te leggen.
De kwantitatieve meting van de zwermmorfologieën werd verkregen met behulp van ImageJ-software, die analyseerbare informatie van het zwermgebied verschafte. Dit artikel presenteert een eenvoudige gradiënt zwermplaatmethode die kwalitatieve en kwantitatieve informatie biedt over de effecten van de inductoren op oppervlaktezwermen, die kan worden uitgebreid om de effecten van andere inductoren op een breder scala van beweeglijke bacteriesoorten te bestuderen.

De workflow bestaande uit de voorbereiding van gradiëntzwermplaten, inenting en incubatie wordt weergegeven in figuur 1B. Om gradiëntgezwommen platen te genereren, wordt het medium van de onderste laag in gestutte schotels gegoten op ~ 4,3 ° van het horizontale vlak (aanvullende figuur S3), gevolgd door het gieten van het medium van de bovenste laag nadat de onderste laag volledig is gestold. De samenstelling van het dubbellaagse medium is weergegeven in tabel 1</str...

Hier beschrijven we het gebruik van inducergradiëntplaten om bacteriële zwermmotiliteit te evalueren en tegelijkertijd meerdere concentratieresponsen te verkrijgen.

Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Het protocol volgt tegelijkertijd bacteriële zwermreacties op verschillende inductorconcentraties op een semisolide agar. Dit wordt op een kosteneffectieve manier bereikt. Deze screeningstechniek met hoge doorvoer ontkracht de behoefte van agar met verschillende inductorconcentraties om de microchemotactische reacties te observeren.De techniek is ontworpen voor medicijnscreening en ook om de micropathogene SD-responsen te observeren. Ook kan het worden gebruikt om microresponsen op verschillende biochemische signalen in de menselijke gastheer te bestuderen. Deze methode kan inzicht geven in bacteriële chemotaxis.Bacteriën zullen reageren op verschillende concentraties van chemische lokstoffen die bekend staan als positieve chemotaxis of chemische insectenwerende middelen die bekend staan als negatieve chemotaxis. Een zorgvuldig voorbereide opstelling is essentieel om variaties tussen de gelhoek van de onderste laag te voorkomen om het reproduceerbaarheidsprobleem te voorkomen. Label om te beginnen vierkante petrischalen van 13 bij 13 centimeter met vlekken en inductornamen.Zet vervolgens de gerechten omhoog over de rand van de deksels. Voeg arabinose-oplossing toe aan het medium va

quantifying-bacterial-surface-swarming-motility-on-inducer-gradient

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Source: Heering, J., et al. Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the induction of swarmer cell differentiation in Vibrio parahaemolyticus using a specially prepared agar medium. By manipulating environmental cues such as iron depletion, calcium supplementation, and surface contact, the bacteria are stimulated to transition from their swimmer form into elongated swarmer cells...

Induction of Differentiation of Vibrio parahaemolyticus into Swarmer Cells

Source: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a swarming assay using bacteria that express green fluorescent protein to observe surface motility on soft agar. Time-lapse imaging captures coordinated expansion and tendril formation, highlighting bacterial surface motility.

Swarming Assay for Visualizing Bacterial Surface Motility

Source: Guo, S., et al. Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the use of a double-layer gradient swarm plate to study bacterial swarming behavior under varying inhibitor concentrations. A plate with a gradient-forming inhibitor in the bottom layer is inoculated with bacteria and incubated. Images are captured at regular intervals to analyze the effect of inhibitor concentration on bacterial swarming.

Assessing Bacterial Swarming Using a Gradient Inhibitor Plate

Source: Scheidweiler, D., et al. Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the use of a microfluidic device to quantify bacterial motility through a porous matrix composed of randomly arranged pillars. Fluorescently labeled bacteria are introduced into the device, imaged via microscopy as they move through the porous matrix into the observation channel, and analyzed...

Assessing Bacterial Motility Using a Microfluidic Device

Zwermen motiliteit wordt beïnvloed door fysische en omgevingsfactoren. We beschrijven een tweefasenprotocol en richtlijnen om de uitdagingen die gewoonlijk worden geassocieerd met zwermtestvoorbereiding en gegevensverzameling te omzeilen. Een macroscopische beeldtechniek wordt gebruikt om gedetailleerde informatie over zwermgedrag te verkrijgen die niet wordt geleverd door huidige analysetechnieken.

Voorbereiding, Imaging, en kwantificeren van Bacteriële Surface Motility Testen

De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Dit protocol maakt het mogelijk om de celcellen van een enkele cel te onderscheiden van de differentieel onderscheidende Vibrio parahaemolyticus zwemmer en zwermcellen. De methode produceert een populatie van zwermcellen die gemakkelijk beschikbaar zijn voor enkelvoudige celanalyse en behandelt de bereiding van celculturen, inductie van zwarmerdifferentiatie, monsterbereiding en beeldanalyse.

Inductie van Cellulaire Differentiatie en Single Cell Imaging van<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Zwemmer en zwermcellen

We detaileen eenvoudige methode om hoge resolutie time-lapse films van Pseudomonas aeruginosa zwermen die reageren op bacteriofaag (faag) en antibiotica stress met behulp van een flatbed document scanner te produceren. Deze procedure is een snelle en eenvoudige methode voor het monitoren van zwermdynamiek en kan worden aangepast aan de beweeglijkheid en groei van andere bacteriesoorten.

Time-lapse Beeldvorming van bacteriële zwermen en de Collectieve Stress Response

Veel bacteriën gebruiken flagella-gedreven beweeglijkheid om door hun omgeving te navigeren en gunstige omgevingen te koloniseren, zowel individueel als als collectief. Hier wordt het gebruik aangetoond van drie gevestigde methoden die motiliteit als selectietool gebruiken om componenten / paden te identificeren die bijdragen aan zwem- en zwermmotiliteit.

Onderzoek naar flagella-gedreven beweeglijkheid in Escherichia coli door drie gevestigde technieken in een serie toe te passen

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode voor het identificeren van genetische factoren die betrokken zijn bij verschillende soorten motiliteiten in Pseudomonas aeruginosa.

High-throughput methode voor het observeren van motiliteitsfenotypes in Pseudomonas aeruginosa

Leer hoe u bacteriële zwermmotiliteit kwantificeert op gradiëntplaten met inductoren. Deze kosteneffectieve high-throughput methode volgt chemotactische reacties voor microbiologisch onderzoek en drugsscreening.

Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren

Meer video's verkennen