Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren

Het protocol volgt tegelijkertijd bacteriële zwermreacties op verschillende inductorconcentraties op een semisolide agar. Dit wordt op een kosteneffectieve manier bereikt. Deze screeningstechniek met hoge doorvoer ontkracht de behoefte van agar met verschillende inductorconcentraties om de microchemotactische reacties te observeren.

De techniek is ontworpen voor medicijnscreening en ook om de micropathogene SD-responsen te observeren. Ook kan het worden gebruikt om microresponsen op verschillende biochemische signalen in de menselijke gastheer te bestuderen. Deze methode kan inzicht geven in bacteriële chemotaxis.

Bacteriën zullen reageren op verschillende concentraties van chemische lokstoffen die bekend staan als positieve chemotaxis of chemische insectenwerende middelen die bekend staan als negatieve chemotaxis. Een zorgvuldig voorbereide opstelling is essentieel om variaties tussen de gelhoek van de onderste laag te voorkomen om het reproduceerbaarheidsprobleem te voorkomen. Label om te beginnen vierkante petrischalen van 13 bij 13 centimeter met vlekken en inductornamen.

Zet vervolgens de gerechten omhoog over de rand van de deksels. Voeg arabinose-oplossing toe aan het medium van de onderste laag. Voeg 40 milliliter warm bodemlaagmedium toe.

Laat het medium van de onderste laag een uur onbedekt uitharden in een laminaire stromingskap ongestoord. Zodra de onderste laag volledig is gestold, verwijdert u de deksels en legt u de petrischalen in een laminaire stroomkap. Voeg 40 milliliter warm medium van de bovenste laag toe met behulp van een gemotoriseerd pipetfilter.

Laat de dubbellaagse platen een uur lang afgedekt en ongestoord uitharden en bewaar ze vervolgens 24 uur bij vier graden Celsius. Leg het gemarkeerde A4-papier onder een goed gestold verloopplaat. Duw de bredere zijde van een pipetpunt van 100 microliter op de gemarkeerde positie in het halfvaste mediumoppervlak en druk op de pipetpunt totdat deze de bodem van het medium van de bovenste laag bereikt.

Wanneer de punt de onderkant raakt, stop dan met het uitoefenen van verticale kracht op de punt en draai de punt voorzichtig om de inhoud van de cilindrische put te isoleren. Beweeg de pipetpunt horizontaal over een kleine afstand om luchtstroom in de smalle plaats mogelijk te maken. Druk met de wijsvinger op de punt om de gasstroom in de punt te blokkeren.

Trek de punt verticaal naar buiten, houd de put in de punt terwijl je hem eruit trekt. Voeg 80 microliter van de nachtelijke groeicultuur toe aan elke put. Haal de zwermplaten elke 12 uur één voor één uit de couveuse en plaats ze in het gelbeeldvormingssysteem.

Selecteer de gelbeeldvormingsmodus, stel de zwermplaat bloot aan wit licht en pas de brandpuntsafstand aan om een duidelijk beeld van zwermen te krijgen. Verbeter de helderheid van de zwermen voor nauwkeurige observatie door de belichtingstijd aan te passen tot 300 milliseconden. Pas de drempel aan om interferentie van het achtergrondlicht tot een minimum te beperken.

Sla het afbeeldingsbestand op voor verdere analyse. Noteer de beeldtijd, het type inductor, de gradiëntoriëntatie en de spanningen in een txt-bestand. Klik op Verwerken en vervolgens op Schaduwen om de scherpte van de afbeelding te verbeteren.

Klik op Verwerken gevolgd door Batch om de afbeelding te verwerken. Verwerk vervolgens een afbeelding als referentie door op Proces, Schaduwen en Zuid te klikken. Klik op Proces, Batch, Macro om het venster Batchproces te openen.

Zoek naar de opdrachten die in het venster worden weergegeven. Typ het mapadres van de oorspronkelijke afbeeldingen in het adres van het uitvoerbestand door te klikken op Verwerken in het venster Batchproces. Gebruik het gereedschap voor het traceren van de toverstaf om zwermen afzonderlijk te selecteren en dubbelklik op het gereedschap voor het traceren van de toverstaf om de tolerantie aan te passen totdat de gegenereerde lijn correct op de zwermgrens past.

Klik op Analyseren en vervolgens op Meten om de gebiedswaarde te exporteren. E.coli K12 YdeH werd getest op arabinose gradiëntplaten die werden gebruikt om het oppervlaktezwermproces aan te tonen met overlap tussen aangrenzende putten. Een plaat met drie testputten maakte de vorming van niet-overlappende grenzen mogelijk.

P.aeruginosa PAO1 YdeH zwermmotiliteit werd bevorderd met verhoogde arabinoseconcentratie vanaf de laagste concentratie, maar geleidelijk beperkt met hogere concentraties arabinoseconcentraties. E.coli K12 wildtype stammen getest op resveratrol gradiëntplaten binnen het nul tot 400 microliter concentratiebereik vertoonden een bescheiden beperking van de zwermmotiliteit met toenemende resveratrolconcentratie. Zwermgebieden werden gekwantificeerd door ImageJ-software.

De zwermcurve vertoonde de meervoudige concentratiereacties. Het meest cruciale onderdeel van deze procedure is het vervaardigen van een dubbellaagse zwermplaat met een specifiek concentratiebereik van inductoren. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de geïnduceerde oppervlaktezwerm binnen een specifiek concentratiebereik te onderzoeken en de effecten van andere inductoren en componenten op zwermen te kwantificeren.