Een zwaartekracht-gevoede transcardiale perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis

Dit protocol biedt een eenvoudige methode van fixatieve perfusie bij muizen die de histologische studie van CZS-weefsels mogelijk maakt zonder aanzienlijke investeringen. Het belangrijkste voordeel van de hier gepresenteerde zwaartekrachtperfusiemethode is dat het profusieapparaat kan worden gebouwd met gemakkelijk beschikbare componenten. De procedure wordt gedemonstreerd door Arnav Rana, een MD-PhD-student van het laboratorium van Dr.Xin Jie Chen.

Om te beginnen, met behulp van een scherp scheermesje, snijdt u de binnenste rietjes van twee wasflessen van 500 milliliter door ze gelijk aan de binnenkant van de schroef op de dop te snijden. Snijd een vierkant gat van vier bij vier centimeter in de bodem van elke bufferfles en snijd vervolgens nog een klein gaatje in de bodem van elke fles om de doorgang van een gebogen roestvrijstalen microspatel mogelijk te maken. Maak vervolgens een S-vormige bocht in de spatels van de micro's, zodat ze kunnen worden gebruikt als haken voor het ophangen van de bufferflessen.

Steek de gebogen microspatels in de juiste openingen in de bufferflessen. Verbind vervolgens twee buizen van 25 centimeter lang met de buitenste flessenstrouitlaten en verbind de uiteinden van deze buizen samen met de Y-connector en verbind vervolgens de 2 meter lange buis met het vrije uiteinde van de Y-connector. Nadat u de zuiger uit een spuit van 1 milliliter hebt verwijderd, snijdt u de spuit ongeveer 6 centimeter van de punt af door het plastic eerst met een scheermesje te scoren en vervolgens het spuitplastic scherp te breken.

Steek het gesneden vlak van de spuit in het vrije uiteinde van de plastic slang tot een voldoende diepte en zorg voor een strakke afdichting. Label vervolgens een bufferfles als PFA en de andere als PBS. Meet ongeveer 1/3 van de lengte van de flesopening en trek op dit punt een lijn rond de flesomtrek om het juiste vulniveau van de perfusaatoplossingen aan te geven.

Maak na het rechtzetten van een grote paperclip een lus die rond de omtrek van de buis past en plaats deze lus rond de buis, net proximaal bij de spuit, plaats vervolgens een piepschuimblok van de juiste grootte in de glazen lade, plaats de uiteinden van de paperclip in het piepschuimblok om de slang aan te brengen en gebruik een papieren handdoek, verhoog de voorkant van de glazen bak met ongeveer 2 centimeter. Na het spoelen van een bekerglas van 1 liter met gedestilleerd water, vult u het met ongeveer 800 milliliter water van 18 milliohms moleculair-biologisch niveau. Verwarm het bekerglas in een magnetron gedurende drie minuten of totdat de watertemperatuur 65 graden Celsius bereikt en plaats het vervolgens op een verwarming of een roerplaat in een zuurkast.

Spoel vervolgens een roerstaaf af met gedestilleerd water en plaats deze in het bekerglas. Start de roerder en zet de hete plaat op middelhoog vuur, zodat de watertemperatuur niet boven de 70 graden Celsius komt. Na het dragen van een chirurgisch masker, handschoenen en laboratoriumjas, meet 40 gram PFA-poeder en voeg het toe aan het verwarmde water en gebruik vervolgens een transferpipet en voeg een paar druppels 5-molair natriumhydroxide toe aan de oplossing.

Laat het poeder volledig oplossen. Als het poeder niet volledig is opgelost, voeg dan indien nodig meer natriumhydroxide toe. Zodra alle PFA bijna is opgelost, stop dan met roeren en verwarmen en voeg onmiddellijk 100 milliliter 10x PBS toe en gebruik vervolgens het 18 milliohms water van moleculair-biologische kwaliteit om het bekerglas bij te vullen tot de 1-liter markering.

Dek het bekerglas af met plasticfolie en plaats het in een vriezer van min 20 graden Celsius totdat de oplossing kamertemperatuur heeft bereikt. Na het kalibreren van een pH-meter met behulp van de juiste normen, meet u de pH van de oplossing terwijl het bekerglas op een roerplaat ligt. Voeg zoutzuur toe tot de pH 7,4 bereikt.

Als de pH te laag is, voeg dan 5-molair natriumhydroxide toe om de pH te verhogen. Sluit vervolgens een vacuümfles aan op stofzuigen en plaats een schone keramische Buchner-trechter met filterpapier in de kolf. Nadat u het vacuüm hebt ingeschakeld, maakt u het filterpapier nat met een transferpipet gevuld met de 4% PFA-oplossing en giet u de oplossing langzaam op het filterpapier totdat alle oplossing is gefilterd.

Bewaar de oplossing na het filteren in een lichtbeveiligde container bij 4 graden Celsius tot gebruik. Plaats in de zuurkast een piepschuimontleffingsblok in een glazen bakje. Zorg ervoor dat het ontleedblok vijf tot zes korte naalden heeft om de muis tijdens de operatie in bedwang te houden en twee lange naalden om de perfusieslang te ondersteunen.

Spoel vervolgens het perfusieapparaat af met gedestilleerd water. Nadat al het water is afgevoerd, hangt u de profusieflessen een meter boven het dier dat moet worden toegediend en bereidt u vervolgens niet-steriele 1x PBS met behulp van 10x PBS verdund met water van moleculaire biologiekwaliteit. Klem de hoofdlijn van het perfusieapparaat met behulp van een hemostat en klem vervolgens de PFA-lijn met een andere hemostat.

Nadat u de buffercontainer met PBS hebt gevuld, plaatst u het spuituiteinde van het perfusieapparaat in een bekerglas om de afvalbuffer te verzamelen en verwijdert u de hemostaat die de hoofdlijn afsluit. Terwijl de PBS door de lijn stroomt, tikt u krachtig op de wanden van de buis om opgesloten lucht te verwijderen. Zodra alle lucht uit de buffer- en hoofdleidingen is verwijderd, sluit u de stroom af door een hemostat op de hoofdlijn te plaatsen.

Verwijder vervolgens de hemostaat uit de PFA-lijn, zodat de PBS op een retrograde manier naar de PFA-fles kan stromen terwijl u eventuele bubbels in de PFA-lijn uittikt. Blijf de PBS in de PFA-lijn toelaten totdat deze net boven de opening van de fles te zien is en sluit vervolgens de PFA-lijn af met een hemostaat om de stroom van PBS in de PFA-fles te stoppen. Sluit vervolgens de vlinderinfuusnaald aan op de perfusiespuit en open de hoofdlijnhemostaat om PBS door de lijn te spoelen en belletjes uit de perfusiespuit te verwijderen.

Nadat de bubbels zijn verwijderd, sluit u de hoofdlijnhemostaat. Zorg ervoor dat de PBS-fles nu ongeveer 1/3 vol pbs zit. Spoel pbs indien nodig door de hoofdlijn of vul meer PBS in de bufferfles tot 1/3 van de volledige capaciteit.

Zodra alle bubbels uit de PBS, PFA en hoofdlijnen zijn verwijderd, vult u de PFA-fles met 4% PFA-oplossing bij kamertemperatuur tot aan de zwarte markering op de fles. Bereid je vervolgens voor op een niet-overlevingsoperatie door de benodigde instrumenten eerst met water en vervolgens met 70% ethanol te reinigen. Nadat u een verdoofde C57 zwarte 6J-muis aan het piepschuimblok hebt vastgezet, begint u de operatie door de buikhuid op te tillen met een huidtang en met een grote schaar door de buikwand te snijden.

Ga door met de buiksnede superieur naar de lever, maak vervolgens de lever los van de voorste buikwand en zet de initiële incisie superieur voort in de richting van het diafragma. Wanneer de incisie het diafragma bereikt, maak dan met behulp van een fijn ontleedbare schaar een gat in het diafragma en snijd door de ribben aan de rechterkant van de muis ongeveer halverwege naar de rechter oksel, maak dan een vergelijkbare, maar langere incisie door de linkerkant van het diafragma bijna helemaal naar de linker oksel. Reflecteer de borstwand en speld deze vast aan het piepschuimblok.

Na het identificeren van de linker ventrikel, met behulp van een fijngebogen tang, houdt u het hart stabiel met lichte druk, opent u vervolgens de hoofdlijnhemostaat om de PBS door de naald te laten stromen en doorboort u onmiddellijk de linker ventrikel met de naald. Zorg ervoor dat de naald niet meer dan 0,5 centimeter in de ventrikel wordt ingebracht. Laat vervolgens de vlinderbuis rusten op een X gemaakt in het piepschuim met twee grote naalden van 18 gauge.

Identificeer de inferieure vena cava als deze de lever verlaat en transect het met behulp van een fijnontledende schaar. Ga door met PBS-perfusie totdat de vloeistof die uit de inferieure vena cava stroomt bloedvrij is, werk dan snel, sluit de PBS-lijn af met een hemostat en open de PFA-lijn. Laat de PFA een paar minuten doordringen totdat de staart begint te krullen.

Zodra de staart begint te krullen, begint u met een timer van 50 minuten. Sluit na 50 minuten de hoofdlijn af met een hemostat en trek de naald uit de linker ventrikel. Plaats vervolgens de muis in een gelabelde container met PFA-oplossing bij 4 graden Celsius 's nachts.

Hoogwaardige perfusie wordt aangegeven door de afwezigheid van bloed in de lever, het ruggenmerg en de diepe structuren van het centrale zenuwstelsel. Het bloed dat in de hersenen wordt waargenomen, bevindt zich tussen de schedel en de dura mater en is daarom niet problematisch of suggestief voor perfusie van slechte kwaliteit. Detectie van alfa-synucleïne volgens deze perfusiemethode toont aan dat gefosforyleerd alfa-synucleïne zich significant hoger ophoopt bij 15,5 maanden oude symptomatische muizen in vergelijking met zeven maanden oude asymptomatische muizen die menselijk A53T alfa-synucleïne tot expressie brengen.

Dit resultaat komt overeen met rapporten die een verrijking van cytopathologie beschrijven in de voorste hoorns van het ruggenmerg en de middenhersenen van deze muizen. Het is belangrijk dat er geen buikorganen worden doorgesneden bij het betreden van de thoracale holte. Bovendien mag de perfusienaald niet te diep in de linker ventrikel worden geplaatst.