Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje is de methode voor gestructureerde bepalingen van macromoleculen met een bijna atomaire resolutie. Er zijn meerdere softwarepakketten beschikbaar voor beeldverwerking en structuurberekeningen, maar het resultaat op 3D-kaarten varieert vaak in kwaliteit en resolutie vanwege de verschillen in algoritmen die tijdens berekeningen worden toegepast. Het gebruik van een combinatie van verschillende programma's is dus vaak gunstig om de optimale resultaten te bereiken.

Dit protocol begeleidt gebruikers bij het navigeren door de workflow op drie verschillende cryo-EM-verwerkingsplatforms: CryoSPARC, RELION en Scipion. We zullen demonstreren hoe we deze pijplijn kunnen gebruiken om een hoge resolutiestructuur van het adeno-geassocieerde virus te verkrijgen, een veelgebruikte vector voor gentherapie. Nadat u CryoSPARC v3 in een webbrowser hebt geopend en de werkruimte voor het project hebt gemaakt, navigeert u naar de nieuwe werkruimte en opent u de taakbouwer in het rechterdeelvenster.

Klik op films importeren en geef het filmpad op en het pad naar het referentiebestand. Stel vervolgens de acquisitieparameters in. Klik vervolgens op wachtrij, selecteer een rijstrook om de taak en een werkruimte uit te voeren en klik op maken.

Open de bewegingscorrectie van de patch en de taakkaart voor het importeren van films. Sleep vervolgens de imported_movies uitvoer naar de tijdelijke aanduiding voor films voor de nieuwe taak en zet de taak in de wachtrij. Om de contrastoverdrachtfunctie of CTF-schatting uit te voeren, opent u ctf-schatting van de patch.

Voer de gegenereerde micrografieën in en zet de taak in de wachtrij. Om de gemiddelde en CTF gecorrigeerde micrografieën te inspecteren en een subset te selecteren voor verdere verwerking, opent u curate exposures, voert u de belichtingen in die zijn verkregen uit de vorige stap en plaatst u de taak in de wachtrij. Nadat de taak in de wachtmodus is gegaan, klikt u op het interactieve tabblad op de taakkaart.

Pas de parameterdrempels aan en accepteer of verwerp individuele micrografieën voor verdere verwerking. Stel tijdens het verwerken van de huidige gegevens de bovengrens van astigmatisme in op 400 angstroms, CTF-pasvormresolutie op vijf angstroms en relatieve ijsdikte op twee. Klik vervolgens op gereed om de micrografieën voor downstream-verwerking te selecteren.

Voor handmatige picking opent u de handmatige kiezer. Voer de geaccepteerde belichtingen in en zet de taak in de wachtrij. Klik vervolgens op het interactieve tabblad, stel de doosgrootte in op 300 pixels en klik op een paar honderd deeltjes over meerdere micrografieën, waarbij overlappende deeltjes worden vermeden.

Zodra u klaar bent met de selectie, klikt u op klaar met het plukken van extractdeeltjes. Om vervolgens sjablonen voor geautomatiseerde deeltjesverzameling te genereren, klikt u op 2D-classificatie en voert u de gegenereerde deeltjesprikkels in. Wijzig vervolgens het aantal 2D-klassen in 10 en zet de taak in de wachtrij.

Open vervolgens 2D-klassen en voer de deeltjes en klassegemiddelden in die in de vorige stap zijn verkregen. Klik vervolgens op het interactieve tabblad, selecteer representatieve 2D-klassen met een goede signaal-ruisverhouding en klik op gereed. Voor op sjablonen gebaseerde deeltjesverzameling opent u de sjabloonkiezer en voert u de geselecteerde 2D-klassen en micrografieën in.

Stel vervolgens de deeltjesdiameter in op 220 angstroms en zet de taak in de wachtrij. Ten slotte opent u het extract van micrografieën en voert u de micrografieën en deeltjes in die zijn verkregen door het inspecteren van deeltjesprikkers. Stel vervolgens de grootte van de geëxtraheerde doos in op 300 pixels en zet de taak in de wachtrij.

Voor 2D-classificatie klikt u op 2D-classificatie en voert u de geëxtraheerde deeltjes in. Stel vervolgens het aantal 2D-klassen in op 50 en zet de taak in de wachtrij. Open vervolgens geselecteerde 2D-klassen en voer de verkregen deeltjes en klassegemiddelden in.

Klik op het interactieve tabblad. Kies 2D-klassen op basis van de resolutie en het aantal deeltjes in de klasse en klik op gereed. Om een initieel 3D-volume te genereren, opent u ab-initio reconstructie en voert u de deeltjes uit de uiteindelijke 2D-classificatie in.

Pas vervolgens de symmetrie aan op icosaëderaal en zet de taak in de wachtrij. Open vervolgens homogene verfijning, voer het volume van de vorige stap en deeltjes uit de uiteindelijke 2D-classificatie in. Wijzig vervolgens de symmetrie en zet de taak in de wachtrij.

Wanneer de taak is voltooid, inspecteert u de Fourier-shellcorrelatie of FSC-curve en downloadt u het volume om te onderzoeken in UCSF Chimera. Open in CryoSPARC v3 de taakkaart van de geselecteerde 2D-klassetaak uit de uiteindelijke 2D-classificatie. Klik vervolgens op het tabblad Details op taak exporteren.

Converteer de particles_exported met PyEM. cs-bestand naar sterformaat door het aangegeven commando uit te voeren. Nadat u op deeltjesextractie hebt geklikt, voert u op het tabblad I/O de ctf-gecorrigeerde micrografieën en coördinaten in.

Klik vervolgens op het tabblad Extract, wijzig de grootte van de deeltjesdoos in 300 pixels en voer de taak uit. Voor 3D-verfijning gebruikt u de kaart die is gegenereerd in CryoSPARC v3 als een eerste model in RELION-3. Selecteer de importmethode en stel de aangegeven parameters in op het tabblad I/O.

Selecteer vervolgens op het tabblad Anderen de CryoSPARC v3-kaart als invoerbestand, wijzig het knooppunttype in 3D-verwijzing en voer de taak uit. Selecteer vervolgens de automatische 3D-verfijning en stel op het tabblad I/O invoerafbeeldingen in als de deeltjes. sterbestand van de laatste selectietaak.

Gebruik de CryoSPARC v3 reconstructie als referentiekaart, klik op het referentietabblad en wijzig het initiële laagdoorlaatfilter naar 50 angstroms en symmetrie naar icosaëderaal. Wijzig vervolgens op het tabblad Optimalisatie de maskerdiameter in 280 angstroms en voer de taak uit. Voor nabewerking klikt u op nabewerking.

En voer op het tabblad I/O de gemaakte halve kaarten en masker in en stel de gekalibreerde pixelgrootte in op 1,045 angstroms. Dan op het tabblad verscherpen, voor schatting B-factor automatisch, voer ja in. Voor de laagste resolutie voor auto-B fit, voer 10 in.

En voor het gebruik van je eigen B-factor, voer nee in. Stel ten slotte op het filtertabblad FSC-weging overslaan in op nee en voer de taak uit. Voor polijsttraining, open Bayesian polijsten.

En voer op het tabblad I/O de bewegingsgecorrigeerde micrografieën, deeltjes en PostProcess in. sterbestand eerder verkregen. Klik op het tabblad training en stel de optimale parameters voor trainen in op ja, fractie van Fourier-pixels voor testen tot 0,5 en gebruik zoveel deeltjes tot 5.000.

Voer vervolgens de taak uit. Zodra de trainingstaak is voltooid, klikt u op Bayesiaans polijsten. Stel vervolgens op het tabblad Training optimale parameters trainen in op nee.

Selecteer het poolse tabblad en geef in het geoptimaliseerde parameterbestand het pad naar de opt_params_all_groups op. txt-bestand uit de vorige stap en klik op uitvoeren. Om aberraties van hogere orde te schatten, opent u CTF-verfijning.

En selecteer op het tabblad I/O onder deeltjes het pad naar het sterbestand met gepolijste deeltjes uit de recente verfijnde 3D-taak. Stel vervolgens onder STAR-bestand na verwerking het pad in naar de uitvoer van de nieuwste nabewerkingstaak. Selecteer vervolgens het tabblad Aanpassen en stel schatting anisotrope vergroting in op nee.

Voer CTF-parameteraanpassing uit op nee. Schat beamtilt op ja. Schat ook klaverblad op ja.

En schat vierde orde aberraties op ja. Voer vervolgens de taak uit. Om de RELION-3 kaart verder te verfijnen en te valideren, start u Scipion 3 en maakt u een nieuw project.

Selecteer in het linkerprotocollenpaneel de vervolgkeuzelijst importeren en klik op deeltjes importeren. Wijzig de parameters importeren van naar RELION-3 en star bestand naar postprocess.star. Geef vervolgens de acquisitieparameters op zoals eerder gedemonstreerd en klik op uitvoeren.

Klik vervolgens op de vervolgkeuzelijst importeren en selecteer importvolumes. Geef onder importeren van het pad naar de RELION-3-kaart, wijzig de bemonsteringsfrequentie van de pixelgrootte in 1,045 angstroms per pixel en voer uit. Als u een globale uitlijning wilt uitvoeren, selecteert u het vervolgkeuzemenu Verfijnen in het deelvenster Protocollen en klikt u op xmipp3-highres.

Voer de geïmporteerde deeltjes en volumes uit de vorige stappen in als respectievelijk afbeeldingen op ware grootte en initiële volumes en stel de symmetriegroep in op icosaëdraal. Kies vervolgens op het tabblad afbeeldingsuitlijning onder hoektoewijzing globaal, stel de maximale doelresolutie in op drie angstroms en voer de taak uit. Als u een lokale uitlijning wilt uitvoeren, selecteert u xmipp3-highres globaal, wijzigt u doorgaan van vorige uitvoering in ja en selecteert u de vorige taak.

Wijzig vervolgens op het tabblad Hoektoewijzing de afbeeldingsuitlijning in lokaal en stel de maximale doelresolutie in op 2,1 angstroms. Klik na het voltooien in het resultatenvenster xmipp3-highres op weergaveresolutieplots om te zien hoe de FSC is veranderd na de verfijning en klik op plot histogram met hoekige wijzigingen om te zien of de Euler-hoektoewijzingen zijn gewijzigd. Inspecteer het volume in UCSF Chimera.

Zoom in en zoek naar functies met een hoge resolutie. Microfoto's met een goede CTF-pasvorm en een laag astigmatisme werden geselecteerd voor verdere verwerking, terwijl die met een hoog astigmatisme en forfait werden weggegooid. 2D-klassegemiddelden met goed gedefinieerde klassen werden geselecteerd en die met lage resolutie, ruis en partiële deeltjes werden afgewezen.

Regio's van de cryo-elektronenmicroscopiekaart uitgerust met atoomcoördinaten van een adeno-geassocieerd virus worden hier weergegeven. Goed gedefinieerde EM-dichtheden maken het mogelijk om zijketens van individuele aminozuren, watermoleculen en magnesiumionen aan te passen. FSC-curven berekend met CryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion geven een toenemende resolutie aan in de workflow, resolutieschattingen op vier verschillende segmenten door de structuren en resolutiehistogrammen tonen de incrementele verbetering van de lokale resolutie tussen de kaarten in de workflow.

Het combineren van cryo-EM-verwerkingsalgoritmen van CryoSPARC, RELION-3, Scipion en Phoenix resulteerde in een resolutieverhoging van de adeno-geassocieerde virusstructuren van 2,9 naar 2,3 angstroms in de verwerkingspijplijn. Het is belangrijk om te onthouden dat de parameters die in elke stap worden gespecificeerd, afhankelijk zijn van monsters en microscoop. Bovendien hangt de mogelijkheid om een hoge resolutie te bereiken sterk af van de kwaliteit van het monster en van de onbewerkte gegevens.

In deze video presenteren we de robuuste SP-workflow voor de verwerking van cryo-EM-gegevens op verschillende softwareplatforms. Door deze aanpak te gebruiken, kan men algoritmen implementeren voor meerdere programma's om cryostructuren te verfijnen en te valideren. Deze workflow kan worden toegepast op structuurberekeningen van een breed scala aan macromoleculaire assemblages.