Humane lever microfysiologisch systeem voor het beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde levertoxiciteit in vitro

Het protocol beschrijft hoe door geneesmiddelen geïnduceerde leverbeschadiging in vitro kan worden beoordeeld met behulp van een microfysiologisch systeem dat zeer functionele en metabolisch actieve levermicroweefsels tot vier weken kan behouden. Deze benadering is een menselijk specifiek celkweekmodel om door geneesmiddelen geïnduceerde leverbeschadigingsaansprakelijkheid voor nieuwe verbindingen nauwkeurig te detecteren, wat voorspellender is dan eenvoudigere 2D-culturen of zelfs complexere 3D-culturen. Deze techniek kan worden gebruikt als onderdeel van een reeks preklinische veiligheidstests om te bepalen of een verbinding veilig is om de klinische ontwikkeling te starten.

Een breed scala aan modaliteiten kan worden getest. Begin met het instellen van het levermicrofysiologisch systeem door de controller aan te sluiten op het dockingstationhuis in een celkweekincubator. Zorg ervoor dat vers droogmiddel wordt toegevoegd aan de droogmiddelpot aan de achterkant van de controller.

Nadat u de controller hebt ingeschakeld door op de tuimelschakelaar van de boot te drukken, wacht u vijf minuten totdat het systeem is gestabiliseerd en de druk heeft bereikt. Verwijder elke plaat uit de verpakking. Prime vervolgens elke put door 500 microliter voorverwarmd voorgewarmd DMEM-medium aan de reservoirzijde toe te voegen.

Plaats de driver op het dockingstation in de incubator. Als u klaar bent, selecteert u het hoofdprogramma op het controllerscherm totdat de vloeistof door de filtersteunen komt. Om het oppervlaktekanaal te bedekken, vult u alle putten met 1,1 milliliter zaai geavanceerd DMEM-medium.

Nadat u de drivers met platen in een incubator op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide hebt geplaatst, sluit u het dockingstation aan en voert u het incubeerprogramma uit. Ontdooi injectieflacons met PHHs en HHC's door de injectieflacons in een waterbad van 37 graden Celsius te houden totdat er slechts een klein stukje ijs overblijft. Eenmaal ontdooid, pipetteer voorzichtig maximaal twee injectieflacons PHHs rechtstreeks in een buis van voorverwarmd gecryopreserveerd hepatocytenherstelmedium, CHRM media.

Gebruik vervolgens een milliliter CHRM om de resterende cellen uit de cryobuis te wassen. Pipetteer de HKCs voorzichtig van de cryobuis in 10 milliliter ijskoud zaaiend geavanceerd DMEM-medium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Centrifugeer later beide celtypen afzonderlijk bij kamertemperatuur bij 100 maal G gedurende 10 minuten.

Verwijder na centrifugatie het supernatant en suspenseer de PHHs opnieuw in warm zaaien geavanceerd DMEM-medium en HKC's in ijskoud zaaien geavanceerd DMEM-medium met behulp van één milliliter per injectieflacon van de cellen die aan de buis zijn toegevoegd. Hang de cellen opnieuw op met een zachte schommelende actie en plaats ze vervolgens op ijs. Tel de cellen in ophanging en noteer de levensvatbaarheid.

De levensvatbaarheid van de cel moet hoger zijn dan 85%, koppel vervolgens de driver los van het dockingstation en plaats de driver in de microbiologische veiligheidskast of MBSC. Spoel vervolgens de media van boven het schavot naar het stoppunt, kanaal en reservoir, waardoor een dood volume van 0,2 milliliter in de kweekput achterblijft, net boven het schavot. Voeg 400 microliter geavanceerd DMEM-medium in de putkamer toe voordat u de bestuurder terugbrengt naar het dockingstation in de incubator en het mediawisselprogramma gedurende drie minuten uitvoert.

Koppel na drie minuten de driver los van het dockingstation en plaats de driver terug in de MBSC. Adem de media van de bovenstaande steiger naar beneden naar het stoppunt en aan het reservoireinde van elke put, gevolgd door de PHHs opnieuw op te hangen door de buis voorzichtig te wiegen en het vereiste volume van de celsuspensie aan elke kweekput toe te voegen. Pipetteer de celsuspensie voorzichtig, zodat de cellen gelijkmatig over de scaffold van de plaat kunnen worden verspreid.

Hang HKC's zorgvuldig opnieuw op en voeg de celsuspensies toe aan elke kweekput. Zodra alle putten beide celtypen bevatten, plaatst u het microfysiologische systeem of de MPS-driver op het dockingstation in de incubator zonder fysiek verbinding te maken om een uur te staan. Zodra een uur is verstreken, sluit u de driver aan op het dockingstation en voert u het seed-programma uit.

Wanneer het programma automatisch na twee minuten pauzeert, verwijdert u de driver uit de incubator en voegt u langzaam 1.000 microliter van het geavanceerde DMEM-medium aan het kanaal toe om een totaal volume van 1,4 milliliter te bereiken. Verplaats later de platen naar de incubator en voer de rest van het zaadprogramma acht uur uit. Pauzeer op dag vier het programma op de controller en koppel de driver en de plaat los van het dockingstation.

Breng ze over naar een MBSC. Gebruik een pipet om handmatig ongeveer een milliliter media uit elke put te verzamelen voor oplosbare biomarkeranalyse zonder de celcultuur te verstoren door de steiger aan te raken. Label de verzamelde media als monsters van dag vier en voer lactaatdehydrogenase en ureumtests uit als kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat het zaaien succesvol is geweest.

Doseer vervolgens elke put volgens het plaatplan door de mediaverandering uit te voeren. Eenmaal voltooid, brengt u de bestuurder terug naar het dockingstation in de incubator en voert u het incubeerprogramma uit. Koppel op dag zes de driver en de plaat los van het dockingstation en ga over op een MBSC.

Gebruik een pipet om ongeveer een milliliter media uit elke put te verzamelen en label als 48 uur na de dosis monsters en bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius voor latere testen. Verwijder op dag acht de steigers van de platen met een pincet en plaats de steigers in een plaat met 24 putten met 500 microliter DPBS zonder calcium en magnesium in elke put zonder het microweefsel te verstoren. Maak de snapshots van elke steiger onder een omgekeerde lichtmicroscoop met een vergroting van 10 keer.

Op dag vier, voorafgaand aan de dosering van het geneesmiddel, werd een kwaliteitscontrole van gevormde levermicroweefsels uitgevoerd met LDH-afgifte en ureumsynthese. Op dag acht werden meerdere gezondheids- en leverstatistieken zoals albumine, ureum, CYP drie A vier, ATP beoordeeld om hoge niveaus van leverfunctionaliteit en reproduceerbaarheid in de microtissues te bevestigen. Contrastfasemicroscopie en IF-kleuring in de levermicrotissues onthulden de gelijkmatige verdeling van HKCs in de PHH-microtissues.

De acute blootstelling van de levermicrotissues aan troglitazon veroorzaakte toxiciteit, die werd gedetecteerd door alanineaminotransferase of ALT, en LDH-afgifte en een snelle vermindering van de albumine- en ureumproductie. Het ATP-gehalte en de CYP drie A vier-activiteit bevestigden de toxiciteit veroorzaakt door troglitazon, en EC50-waarden waren zeer vergelijkbaar met andere eindpunten. De bright-field microscopiebeelden die na acht dagen kweek in de MPS zijn gemaakt, onthullen een gezonde levermicrotissue, gelijkmatig gezaaid over de steiger in de voertuigbesturing.

Weefseldood of -afbraak werd gezien in de replica's die werden behandeld met positieve controle en troglitazon. Bovendien werd ook de levertoxiciteit na blootstelling aan pioglitazon onderzocht. Er werd geen LDH- of ALT-afgifte gedetecteerd, maar na 48 uur werd een lichte vermindering van de albumine- en ureumproductie waargenomen.

Een lichte verlaging van het ATP-gehalte werd waargenomen bij hoge pioglitazonconcentraties. EC50-waarden werden gegenereerd uit de dosisresponscurven. Microscopie onthulde een lichte verandering in microtissue na 96 uur blootstelling aan pioglitazon bij de twee hoogste geteste concentraties.

In de studie is het gebruik van cellen met een goede kwaliteit en levensvatbaarheid van meer dan 85% essentieel voor het genereren van zeer functionele en gezonde 3D-microtissues in het microfysiologische systeem. Na deze procedure kunnen we adenine- en geneesmiddelinteracties en door geneesmiddelen geïnduceerde leverbeschadiging beoordelen op ziektemodellen zoals niet-alcoholische Delta-hepatitis of niet-alcoholische leververvettingsmodellen die drievoudige cultuur van leverparenchymale en niet-parenchymale cellen gebruiken.