Name: Bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) -methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Leer de FACE-methode voor het analyseren van glucaanketenlengteverdeling in glycogeen. Deze techniek helpt bij het begrijpen van structurele eigenschappen en metabole ziekten zoals Andersen's disease.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de CNRS, de Université de Lille CNRS en de ANR-beurzen "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).

1. Incubatie met ontbraakenzymen
<ol><li>Meng 200 μL gezuiverd glycogeen bij 0,5-2 mg/ml met 200 μL 100 mM acetaatbuffer (pH 4,8). Voeg 2 μl isoamylase (180 E/mg eiwit) en 1,5 μL pullulanase (30 E/mg eiwit) toe (zie Tabel met materialen), meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en incubeer bij 42 °C gedurende 16 uur in een buis van 1,5 ml. OPMERKING: Afbraak of amylasebesmetting kan optreden tijdens het glycogeenzuiveringsproces. Om de aanwezigheid van vrije malto-oligosacchariden te waarderen, kunnen monsters parallel worden geïncubeerd zonder de debranching enzymcocktail. Een standaard (bijvoorbeeld maltoheptaose) is opgenomen in de analyse om de relatie tussen de elutietijd en de mate van polymerisatie te bepalen.</li>
	<li>Stop de reacties door gedurende 5 minuten te broeden bij 95 °C.</li>
	<li>Centrifugeer bij 16.100 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om te pelleteren en verwijder onoplosbaar materiaal.</li>
	<li>Verwijder de bovennatuurlijke stoffen met een pipet en breng ze over in nieuwe geannoteerde buizen. Ontzout de supernatanten door het equivalent van 100 μL anion/kationenwisselingsharsparels (AG-501-X8, zie Materialentabel) toe te voegen en te roeren.<ol>
<li>Roer de kralen regelmatig gedurende 5 min. Verzamel de monsters door te pipetteren en plaats ze in nieuwe geannoteerde buizen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vriesdroog of gebruik een vacuümverdamper die is ingesteld (zie Materiaaltabel) bij 30 °C om de monsters te drogen.</li>
	<li>Bewaar gedroogde monsters bij kamertemperatuur of bij -20 °C. OPMERKING: De monsters kunnen 1 maand worden bewaard.</li>
</ol>2. Reductieve aminatie
<ol><li>Meng de gedroogde monsters met 2 μL 1 M natriumcyanoboorhydride in tetrahydrofuraan (THF) en 2 μL APTS (5 mg APTS geresuspendeerd in 48 μL 15% azijnzuur) (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Incubeer bij 42 °C gedurende 16 uur in het donker. LET OP: Natriumcyanoborohydride wordt behandeld met aangepaste persoonlijke beschermingsmiddelen en onder een chemische kap. Inademing en contact met de huid zijn zeer giftig en kunnen fataal zijn, waardoor ernstige brandwonden en oogbeschadiging ontstaan. Zeer giftige gassen kunnen worden gegenereerd bij het mengen van natriumcyanoboorhydride met azijnzuur. In contact met water geeft natriumcyanoboorhydride brandbare gassen af, die spontaan kunnen ontbranden. Geconcentreerde monsters worden behandeld onder een chemische kap en met behulp van aangepaste persoonlijke beschermingsmiddelen vanaf deze stap.</li>
</ol>3. FACE-analyse
<ol><li>Voeg 46 μL ultrapuur water toe aan elk monster.</li>
	<li>Verdun de monsters rechtstreeks tot 1/50 in microflacons van 100 μL door 1 μL van het monster toe te voegen aan 49 μL ultrapuur water. Bewaar de monsters in het donker tijdens het instellen van de FACE (5-10 min).</li>
	<li>Voer omgekeerde polariteit elektroforese uit met een capillair elektroforese-instrument met een lasergeïnduceerde fluorescentie (LIF) detector (zie Tabel met materialen). Stel de polariteit in op "omgekeerde modus" voor scheiding, stel de LIF in op 488 nm emissiegolflengte en de detector op 512 nm.</li>
	<li>Stel de injectietijd in op 10 s en de injectiedruk op 0,5 psi.</li>
	<li>Voer de APTS-gelabelde glucanenscheiding uit bij 30 kV in een kaal gesmolten silicacapillair van 60,2 cm lang met een binnendiameter van 50 μm (375 μm buitendiameter) in de N-gebonden koolhydraatscheidingsbuffer verdund tot 1/3 in ultrapuur water (zie Materialentabel). OPMERKING: De N-gebonden koolhydraatscheidingsbuffer wordt elke 20 runs vervangen.</li>
</ol>4. GEGEVENSVERWERKING
<ol><li>Exporteer de ". ASC "en ". CDF "bestanden met respectievelijk het elektroferogramprofiel en integratiegegevens.</li>
	<li>Open het . ASC-bestand en teken de relatieve fluorescentie-eenheid volgens de tijdgrafiek.</li>
	<li>Open het . CDF-bestand , ga verder met een eerste automatische integratie en pas de volgende parameters aan: breedte; vallei tot dal integratie; minimale oppervlakte.</li>
	<li>Controleer en corrigeer eventuele onjuiste integratiegebeurtenissen handmatig.</li>
</ol>

<ol><li>Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+randomly+hyperbranched+polymers%3A+Theory+and+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation.</a> The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901(2008).</li>
<li>Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers%2C+exemplified+by+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li>
<li>Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BioMacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in escherichia coli.</a> BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li>
<li>Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+glycogen+and+starch+metabolism+in+eukaryotes+gives+molecular+clues+to+understand+the+establishment+of+plastid+endosymbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis.</a> Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).</li>
<li>Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+glycogen+biosynthesis+through+Monte+Carlo+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).</li>
<li>Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+molecular+design+in+the+evolution+of+metabolism%3A+The+glycogen+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule.</a> Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).</li>
<li>Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+did+glycogen+structure+evolve+to+satisfy+the+requirement+for+rapid+mobilization+of+glucose%3F+A+problem+of+physical+constraints+in+structure+building%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building.</a> Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).</li>
<li>Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractal+structure+of+glycogen%3A+A+clever+solution+to+optimize+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism.</a> Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).</li>
<li>Wang, L., Wise, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+with+short+average+chain+length+enhances+bacterial+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability.</a> Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).</li>
<li>Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+and+glycogen+storage+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism and glycogen storage disorders.</a> Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474(2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+of+glycogen+serving+as+a+durable+energy+reserve+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+situ+progressive+N-terminal+is+still+controversial+truncation+of+glycogen+branching+enzyme+in+Escherichia+coli+DH5%CE%B1+on+glycogen+structure%2C+accumulation%2C+and+bacterial+viability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).</li>
<li>Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+physiological+mechanism+of+sugar+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">On the physiological mechanism of sugar formation in the liver.</a> Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).</li>
<li>Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+prokaryotes+to+eukaryotes%3A+Insights+into+the+molecular+structure+of+glycogen+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315(2021).</li>
<li>Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1+H+NMR+visibility+of+mammalian+glycogen+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678(1990).</li>
<li>O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore-assisted+carbohydrate+electrophoresis+%28FACE%29+of+oligosaccharides%3A+Efficiency+of+labelling+and+high-resolution+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation.</a> Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).</li>
<li>Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+distributions+of+chain+length+of+amylopectins+by+high-performance+liquid+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection.</a> Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).</li>
<li>Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+starch+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of starch structure.</a> Electrophoresis. 19, 2603-2611 (1998).</li>
<li>Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+capillary+gel+electrophoresis+of+reducing+oligosaccharides+labeled+with+1-Aminopyrene-3%2C6%2C8-trisulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate.</a> Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).</li>
<li>Kadouche, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+function+of+the+GlgA2+glycogen%2Fstarch+synthase+in+cyanobacterium+sp.+clg1+highlights+convergent+evolution+of+glycogen+metabolism+into+starch+granule+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).</li>
<li>Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bound+substrate+in+the+structure+of+cyanobacterial+branching+enzyme+supports+a+new+mechanistic+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model.</a> The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).</li>
<li>Sawada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+reaction+characteristics+of+glucan+branching+enzymes+and+the+fine+structure+of+%CE%B1-glucan+from+various+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).</li>
<li>Wong, K. S., Jane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+debranched+amylopectin+by+HPAEC-PAD+with+a+post-column+enzyme+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).</li>
<li>Colleoni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+the+chlamydomonas+reinhardtii+a-1%2C4+glucanotransferase+supports+a+direct+function+in+amylopectin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis.</a> Plant Physiology. 120, 9(1999).</li>
<li>Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+MALDI-TOF+mass+spectrometry+and+HPAEC-PAD+analysis+of+debranched+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch.</a> Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).</li>
<li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glycogen+serves+as+a+critical+glucosamine+cache+required+for+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation.</a> Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten in verband met dit werk.

De fysisch-chemische eigenschappen van glycogeendeeltjes (bijv. Grootte, morfologie, oplosbaarheid) zijn direct geassocieerd met de lengte van glucanen waaruit de deeltjes bestaan. Elke onbalans tussen biosynthetische en katabole enzymen resulteert in de verandering van de ketenlengteverdeling en, per se, de accumulatie van abnormaal glycogeen dat gevaarlijk kan zijn voor de cel11. De FACE-analyse is een methode bij uitstek om de ketenlengteverdeling (CLD) van glycogeen te bepalen. Zoals afgebeeld in figuur 2, maakt de bepaling van CLD de gevolgtrekking mogelijk van de gemiddelde ketenlengtewaarde van glycogeen (ACL), die de structuur van glycogeendeeltjes weerspiegelt. Dierlijke glycogenen met hoge ACL-waarden worden geassocieerd met het verschijnen van abnormale deeltjes. De subtractieve analyse is een nuttige methode voor het vergelijken van twee glycogeenmonsters met verschillende genetische achtergronden (mutant versus wildtype). Door op een logaritmische schaal te plotten, heeft CLDs genormaliseerd tot de maximale piek daarentegen het voordeel dat CLD onafhankelijk van een referentie wordt vergeleken en ons informatie geeft over het groeiende glycogeenmechanisme.
Bovendien is FACE-analyse een krachtige techniek voor het karakteriseren van de katalytische eigenschappen van glycogeen metaboliserende enzymen. Alle glycogeenvertakkende enzymen splitsen bijvoorbeeld (1 → 4)-α verbanden en brengen oligomaltosylgroepen over op een (1 → 6)-α positie of vertakkingspunten. Vertakkende enzymen zijn te onderscheiden door hun affiniteit voor polysacchariden (bijv. Amylopectine, glycogeen) en de lengte van overgedragen glucanen ondanks het vergelijkbare katalytische mechanisme22. Zo kunnen verschillende bronnen van vertakkende enzymen (mens, plant, bacterie) worden gekarakteriseerd en geclassificeerd door middel van een reeks incubatie-experimenten en CLD-vergelijkingen met behulp van FACE-analyse23.
Zoals vermeld in de inleiding, is HPAEC-PAD ook een alternatieve methode voor het bepalen van de ketenlengteverdeling18. Beide technieken vereisen de volledige hydrolyse van (1 → 6)-α koppelingen of vertakkingspunten door isoamylase-type debranching enzymen voordat de pool van lineaire glucanen wordt gescheiden op basis van hun mate van polymerisatie (DP). De HPAEC-PAD-methode heeft echter twee nadelen ten opzichte van FACE: (1) de amperometrische pulsrespons neemt af naarmate de glucaanketens toenemen, wat geen kwantitatieve informatie oplevert. Dit probleem van massabias kan worden omzeild met behulp van HPAEC-ENZ-PAD waarbij een postkolomenzymreactor tussen de anionenuitwisselingskolom en PAD24 betrokken is. De kolomenzymreactor hydrolyseert malto-oligosacchariden tot glucoseresiduen waardoor een constante pulsamperometrische respons mogelijk is. (2) De HPAEC-PAD maakt de scheiding van glucaanketens mogelijk met een mate van polymerisatie tot 70. Hoewel de resolutie voldoende is voor het bepalen van de CLD van glycogeenmonsters, scheidt FACE ketens met DP's tot 150, geschikt voor zetmeelmonsters17. Het is essentieel om in gedachten te houden dat zowel HPAEC-PAD als FACE-analyse voor- en nadelen hebben. De aminatiereactie vereist bijvoorbeeld een vrije hemiacetale groep om te reageren met de primaire aminefunctie van de APTS. Dit impliceert dat APTS-etikettering niet kan worden gebruikt voor glucaanketens zonder reducerende uiteinden (bijv. Inuline). De HPAEC-PAD-methode vereist geen reducerende uiteinden. Een tweede interessant aspect van de HPAEC-PAD-methode is dat de anionenuitwisselingskolom kan worden geladen met enkele milligram lineaire glucanen, waardoor malto-oligosaccharide kan worden gezuiverd met een specifiek DP of 14C-radioactief gelabelde malto-oligosaccharide voor enzymatische assay18,25. Ten slotte, hoewel massaspectrometrie (bijv. MALDI-TOF) een snelle en gevoelige techniek is om de verdeling van de ketenlengte te bepalen, lijkt deze techniek minder reproduceerbaar te zijn. Het overschat de hoeveelheid lange glucaanketens26. Niettemin kan de laatste worden gebruikt voor een specifieke toepassing zoals MALDI-beeldvorming om de aanwezigheid van glycogeen in cellulair weefsel in kaart tebrengen 27.

Glycogeen, gebruikt als koolstof- en energieopslag, is een homopolymeer van glucose dat bestaat uit lineaire ketens van glucosyleenheden verbonden door (1 → 4)-α bindingen en bevestigd door (1 → 6)-α glycosidische bindingen of vertakkingspunten. Ze verschijnen als β- en α deeltjes in het cytosol van een breed scala aan organismen. β-deeltjes zijn kleine in water oplosbare deeltjes die voornamelijk worden waargenomen in prokaryoten. Hun diameter varieert van 20-40 nm, waarschijnlijk gedicteerd door de glycogeen metaboliserende enzymen en sterische belemmering 1,2.
Voor het eerst beschreven in dierlijke cellen, vertonen de grotere α deeltjes een diameter tot 300 nm met een bloemkoolachtige vorm. Deze specifieke organisatie kan voortkomen uit de aggregatie van verschillende β-deeltjes of kan ontstaan door ontluikend uit een enkele β-deeltje3. Interessant is dat een recente studie de aanwezigheid van α-deeltjes in Escherichia coli4 heeft gemeld. In tegenstelling tot α deeltjes uit dierlijke cellen valt deze laatste echter snel uit elkaar tijdens het extractieproces, wat het gebrek aan gegevens in de literatuur kan verklaren4. Het verschijnen van α-deeltjes in eukaryoten en prokaryoten omvat fylogenetisch niet-gerelateerde glycogeen metaboliserende enzymen5. Dit roept vragen op over de functie van dergelijke deeltjes en de aard van potentiële cross-linker agenten tussen β-deeltjes5.
Hoewel twee tegengestelde wiskundige modellen werden voorgesteld voor de vorming van glycogeenmoleculen 6,7,8,9, wordt algemeen aangenomen dat β deeltjes zijn geëvolueerd als reactie op hun metabolische functie als een zeer efficiënte brandstofreserve voor de snelle afgifte van grote hoeveelheden glucose. Een grote hoeveelheid bewijsmateriaal geeft aan dat glycogeeneigenschappen zoals verteerbaarheid en oplosbaarheid in water gecorreleerd zijn met de gemiddelde ketenlengte (ACL), die vervolgens het percentage vertakkingspunten en de deeltjesgrootte 2,6,7,8,10,11 zal dicteren . ACL wordt gedefinieerd door de verhouding tussen het totale aantal glucoseresiduen en het aantal vertakkingspunten. Doorgaans variëren de ACL-waarden van 11-14 en 7-23 glucoseresiduen in eukaryoten en prokaryoten, respectievelijk10. Bij mensen zijn verschillende glycogeenziekteziekten te wijten aan abnormale glycogeenaccumulatie. De ziekte van Andersen wordt bijvoorbeeld geassocieerd met de gebrekkige activiteit van een glycogeenvertakkend enzym, wat resulteert in de accumulatie van abnormaal glycogeen11. In prokaryoten suggereren cumulatieve studies dat ACL een kritische factor is die van invloed is op de afbraaksnelheid van glycogeen en bacteriële overlevingscapaciteit12,13. Er is gemeld dat bacteriën die β deeltjes met een lage ACL-waarde synthetiseren, langzamer afbreken en daarom langer bestand zijn tegen uithongeringsomstandigheden. Kennis van de architectuur van β-deeltjes is dus essentieel voor het begrijpen van de vorming van abnormale glycogeendeeltjes in menselijke glycogeenstapelingsziekten en prokaryotenoverleving in een voedingsarme omgeving.
Sinds de eerste isolatie van glycogeen uit hondenlever door de Franse fysioloog Claude Bernard in de late negentiende eeuw14, werden veel technieken ontwikkeld om glycogeendeeltjes in detail te karakteriseren. Bijvoorbeeld transmissie-elektronenmicroscopie voor glycogeenmorfologie (α- of β-deeltjes)15, proton-NMR-spectrometrie voor het bepalen van het percentage α-1,6-koppelingen16, maatuitsluitingschromatografie met multidetectoren voor het afleiden van het molecuulgewicht, Fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE)17 of high-performance anionenuitwisselingschromatografie met Pulsed Amperometric Detection (HPAEC-PAD) voor zowel ketenlengteverdeling (CLD) als ACL bepaling18.
Dit werk richt zich op de fluorofoor-geassisteerde koolhydraat-elektroforesemethode, die afhankelijk is van de reductieve aminatie van de hemiacetale groep door primaire aminefunctie. Historisch gezien werd 8-amino-1,3,6-naftaleen trisulfonzuur (ANTS) voor het eerst gebruikt voor etikettering. Later werd het vervangen door het meer gevoelige fluorofoor, 8-amino 1,3,6 pyreen trisulfonzuur (APTS)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig01.jpg"> Figuur 1: De reductieve aminatiereactie met 8-amino 1,3,6 pyreentrisulfonzuur (APTS). Reductieve aminatiereactie van de hemiacetale groep door primaire aminefunctie van 8-amino 1,3,6 pyreentrisulfonzuur (APTS) onder reductieve omstandigheden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Zoals afgebeeld in figuur 1, interageert de hemiacetale functie van het reducerende uiteinde van een glucaanketen met het primaire amine van APTS onder reducerende omstandigheden. De sulfonische groepen van APTS dragen negatieve ladingen die de scheiding van glucaanketens mogelijk maken op basis van hun mate van polymerisatie (DP). De reductieve aminereactie is zeer reproduceerbaar en efficiënt. Een gemiddelde efficiëntie-etikettering van 80% wordt verkregen voor DP3 tot DP135 en tot 88% en 97% voor maltose (DP2) en glucose, respectievelijk17,20. Omdat één molecuul APTS reageert met het reducerende uiteinde van elke glucaanketen, kunnen individuele ketens worden gekwantificeerd en op molaire basis met elkaar worden vergeleken.

<table><tbody><tr><td>AG-501-X8 Resin</td><td>BioRad</td><td>#1436424</td><td>Opslag Temperatuur op kamertemperatuur</td></tr><tr><td>100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,8</td><td></td><td></td><td>Los 0,82 g natriumacetaat op in 80 mL water. Pas de pH aan tot 4,8 met azijnzuur en vul het volume aan tot 100 mL met water&mdash;opslag op kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>APTS-stockoplossing</td><td>Merck</td><td>09341-5MG</td><td>Los 5 mg APT op in 48 mL azijnzuur 0,2 M. Bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Capillair</td><td>Sciex Separations, Les Ulis, Frankrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>select :Bestand>importeren/herstellen>ANDI/chromatografie in het geopende venster: selecteer "toevoegen" selecteer cdf&nbsp; bestand > importeren > volgende Kies de map waarin uw bestand wordt gedownload in Chromeleon software> afmaken klik op QNT-Editor> parameter "Min Area" selecteer "Bereik" 0,05 [Signaal]*min.</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Open Excel> Nieuw bestand> sla het bestand op > Bestandmenu klik op Importeren > Kies in het geopende venster "csv." als bestandstype > selecteer uw asc bestand > Er verschijnt een nieuw venster Stap 1: kies Macintosh of&nbsp; Windows en gebruik vervolgens de standaardinstellingen voor de stappen 2 en 3. > Y-waarden verschijnen in kolom A> Voeg handmatig een Tijd kolom toe door 0,25 seconde toe te voegen aan elke cel die overeenkomt met de frequentie (4Hz) voor acquisitiegegevens. Plot vervolgens de grafiek.</td></tr><tr><td>Free-Dry apparaat</td><td>Christ</td><td>alpha 2-4 LO plus</td><td>Voor het vriesdroogproces worden monsters 1 uur bewaard bij -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Isoamylase</td><td>Megazyme</td><td>E-ISAMY</td><td>180 U/mg eiwit</td></tr><tr><td>Maltoheptaose</td><td>Merck</td><td>M7753</td><td></td></tr><tr><td>N-gekoppelde koolhydraatscheidingsbuffer</td><td>Sciex Separations, Les Ulis, Frankrijk</td><td>477623</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Pullulanase</td><td>Megazyme</td><td>E-PULKP</td><td>30 U/mg eiwit</td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296813-100ML</td><td>1 M natriumcyanoborohydride in THF</td></tr><tr><td>Vacuum-verdamper</td><td>Eppendorf</td><td>Concentrator 5301</td><td>Stel de temperatuur in op 30 &deg;C. Centrifugeer tot de monsters zijn gedroogd</td></tr></tbody></table>

bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (face) -methode

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogeendeeltjes zijn vertakte polysacchariden die bestaan uit lineaire ketens van glucosyleenheden verbonden door α-1,4 glucosidebindingen. Deze laatste zijn aan elkaar bevestigd door α-1,6 glucoside-verbindingen, aangeduid als vertakkingspunten. Onder de verschillende vormen van koolstofopslag (d.w.z. zetmeel, β-glucaan), is glycogeen waarschijnlijk een van de oudste en meest succesvolle opslagpolysacchariden die in de levende wereld worden aangetroffen. Glucaanketens zijn zo georganiseerd dat een grote hoeveelheid glucose snel kan worden opgeslagen of gevoed in een cel wanneer dat nodig is. In de afgelopen decennia zijn tal van complementaire technieken ontwikkeld om de fijne structuur van glycogeendeeltjes op te lossen. Dit artikel beschrijft Fluorofoor-geassisteerde koolhydraat elektroforese (FACE). Deze methode kwantificeert de populatie van glucaanketens waaruit een glycogeendeeltje bestaat. Deze parameter, ook bekend als chain length distribution (CLD), weerspiegelt de deeltjesgrootte en het percentage vertakkingen. Het is ook een essentiële vereiste voor de wiskundige modellering van glycogeenbiosynthese.

Bepaling van de gemiddelde ketenlengte van glycogeen Figuur 2 geeft de workflow weer die nodig is om de ketenlengteverdeling en de gemiddelde ketenlengte (ACL) van glycogeen af te leiden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig02.jpg"> Figuur 2: Workflow om de ketenlengteverdeling (CLD) en gemiddelde ketenlengte te bepalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Figuur 3 toont de elektroferogrammen van commerciële maltohexaose en onttakt runderleverglycogeen. De fluorescentiesignalen waargenomen tussen 4,13-4,67 min in alle experimenten waren afkomstig van de niet-gereageerde APTS. De elutietijd van gelabeld maltohexaose (DP6) werd geschat op 8,49 min (figuur 3A). De met APTS gelabelde glucanen van runderglycogeen werden geïdentificeerd op basis van de elutietijd van DP6 (figuur 3B). In het controlemonster werd geen spoor van vrije malto-oligosacharide aangetroffen (glycogeen niet geïncubeerd met debranching-enzymen) (figuur 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig03.jpg"> Figuur 3: Elektroferogrammen van een standaard en runderleverglycogeen. (A) De tijdselutie (8,49 min) van een glucaanstandaard, maltohexaose (DP6), werd als referentie gebruikt om de mate van polymerisatie (DP) te bepalen van apts-gelabelde glucanen die vrijkomen uit runderleverglycogeen na de werking van debranching-enzymactiviteiten (B ). Het inzetpaneel toont een scheiding van glucaanketens tot 44 DP. Tegelijkertijd werd onbehandeld runderglycogeen gelabeld met APTS om mogelijke sporen van vrije malto-oligosacchariden in monster (C) te detecteren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Er kan worden geconcludeerd dat het vrijkomen van APTS-gelabeld glucaan te wijten is aan de splitsing van vertakkingspunten door zowel isoamylase- als pullulanase-activiteiten. Opgemerkt moet worden dat het capillaire elektroforeseprofiel kan worden hertekend in een geschikter formaat om een mozaïekfiguur met verschillende profielen te creëren. Om dit te doen, worden DATA-bestanden met fluorescentiewaarden gegenereerd met de extensie "asc" en geopend in het spreadsheetprogramma door csv-indeling (door komma's gescheiden waarde) te kiezen. Helaas zijn de geëxporteerde fluorescentiewaarden niet gekoppeld aan de overeenkomstige elutietijd. Daarom moeten ze handmatig worden toegevoegd volgens de opstelling van de acquisitiefrequentie op het FACE-apparaat (4 Hz betekent één waardeverwerving per 0,25 s).
Piekgebieden werden vervolgens afgeleid met behulp van de native applicatie van het FACE-instrument of geëxporteerd als een DATA-bestand met een "cdf" -extensie om een andere applicatie te gebruiken. De oppervlaktewaarden worden geëxporteerd in een spreadsheetprogramma en genormaliseerd door de DP uit te drukken als een percentage van de totale oppervlakte (figuur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig04.jpg"> Figuur 4: Gegevensnormalisatie, ketenlengteverdeling en gemiddelde ketenlengtewaarde. Fluorescentiepiekgebieden werden geïmporteerd en genormaliseerd in een spreadsheet. De ketenlengteverdeling wordt weergegeven als het percentage DP voor elke DP. De gemiddelde ketenlengte (ACL) wordt berekend door elk percentage keten maal de overeenkomstige mate van polymerisatie op te tellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Ten slotte wordt de gemiddelde ketenlengte (ACL) afgeleid door de som van elk percentage keten maal de overeenkomstige mate van polymerisatie te berekenen. Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd in drievoud op konijnenleverglycogeen (figuur 5A), op runderleverglycogeen (figuur 5B) en oesterglycogeen (figuur 5C).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig05.jpg"> Figuur 5: Ketenlengteverdeling van commercieel glycogeen. De konijnenlever (A), runderlever (B) en oesterglycogeen (C) werden geïncubeerd in aanwezigheid van debranching enzymen (isoamylase en pullulanase). De APTS-gelabelde glucanen werden vervolgens gescheiden op basis van hun mate van polymerisatie (DP) met behulp van FACE-analyse. Maltose (DP2), maltohexaose (DP6) maltoheptaose (DP7) vertegenwoordigen de meest voorkomende glucanen in respectievelijk konijnenlever, oester en runderleverglycogeen. De Standard Error of Mean (SEM) werd afgeleid uit drie onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
De ketenlengteverdeling van konijnenleverglycogeen toonde duidelijk een hoger gehalte aan korte malto-oligosacharide (DP2) dan runderleverglycogeen (DP 7) of oesterglycogeen (DP6). Hierdoor bezit het konijnenleverglycogeen de laagste gemiddelde ketenlengte (ACL = 9,8) in vergelijking met runderleverglycogeen (ACL = 11,9) en oesterglycogeen (ACL = 12,6). Opgemerkt moet worden dat die commerciële glycogenen meestal worden gebruikt voor het testen van de glycogeenfosforylase- of glycogeensynthase-activiteit. Dit suggereert dat de bepaling van kinetische parameters (Vmax en Km) van glycogeen metaboliserende enzymactiviteiten zal variëren afhankelijk van de bron van glycogeen.
Subtractieve analyses De subtractieve analyse is een eenvoudige methode om de verdeling van de glucaanketens van twee monsters te vergelijken. Bijvoorbeeld, CLD's van glycogeen geproduceerd door de wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 stam en enkele isogene glgA1 en glgA2 mutante stammen werden bepaald (figuur 6A).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig06.jpg"> Figuur 6: Vergelijking van ketenlengteverdelingen met behulp van subtractieve analyse. (A) De ketenlengteverdelingen van glycogeen gezuiverd uit cyanobacteriële stammen: wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 en enkelvoudige isogene glgA1 - en glgA2-mutante stammen werden bepaald met behulp van FACE-analyse. De Standard Error of Mean (SEM) werd afgeleid uit drie onafhankelijke experimenten. B) Subtractieve analyses werden uitgevoerd door het % van elk DP WT af te trekken van het % van elk DP van ΔglgA1 en het % van elk DP van WT af te trekken tot het % van elk DP van DP ΔglgA2. Deze eenvoudige wiskundige manipulatie toont de verandering van glucaanketens in mutante stammen (zwarte lijnen). (C) De gemiddelde ketenlengteverdelingen van glycogeen van wildtype en mutanten van Synechocystis werden genormaliseerd volgens de maximale piek die voor elke CLD (DP6 voor alle monsters) werd waargenomen. Twee componenten worden aangetoond door de genormaliseerde CLD op een logaritmische schaal (Nde (DP)) uit te zetten. Elke component duidt op een ander mechanisme van groeistop (voor meer informatie, zie referentie2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Ter herinnering, de meeste cyanobacteriënstammen bezitten twee genen die coderen voor glycogeensynthase-activiteiten: GlgA1 en GlgA221. Beide enzymen brengen het residu glucose van ADP-glucose over op de niet-reducerende uiteinden van lineaire glucaanketens. Zoals weergegeven in figuur 6A, is het een uitdaging om monsters te vergelijken door alleen naar de distributieprofielen van de ketenlengte te kijken. De subtractieve analyse bestaat uit het aftrekken van het percentage van elke DP tussen de monsters (figuur 6B). De subtractieve analyse van %DP van WT minus % DP ΔglgA1-mutant onthult een overmaat aan DP3, 4 en 5 (negatieve waarden) en een verlaagd gehalte aan DP 10-20. De subtractieve analyse tussen %DP van WT en % van DP ΔglgA2-mutant wijst daarentegen op een tegengesteld effect. Omdat de subtractieve analyseprofielen verschillen tussen GlgA1 en GlgA2, suggereert dit een specifieke functie van elke glycogeensynthase-isovorm in glycogeenbiosynthese21.
Het is belangrijk op te merken dat subtractieve analyse alleen van toepassing is op experimenten waarbij een referentiemonster wordt uitgevoerd dat parallel met de monsters wordt uitgevoerd. Anders kan subtractieve analyse empirisch zijn, omdat het op de genormaliseerde CLD van de referentie ligt. In 2015 stelden Deng en medewerkers, die de stopmechanismen van glycogeengroei bij muizen en mensen onderzochten, een alternatieve plotting en interpretatie van glycogeen-CLD's voor om dit probleem aan te pakken. Deze plot gebruikt het maximale piekgebied om elke CLD te normaliseren. De gegevens worden vervolgens uitgezet op een logaritmische schaal die twee componenten benadrukt. Deze laatste illustreren twee verschillende mechanismen voor kettingverlenging diestoppen 2. Door lijnen te tekenen die passen bij de hogere DP-component, kunnen absolute parameters (d.w.z. hellingen en onderscheppingen van de lijnen) worden gebruikt voor CLD-vergelijking zonder normalisatie naar een referentieprofiel. CLD's van de wildtype (WT) Synechocystis PCC6803 stam en de enkele isogene glgA1 en glgA2 mutanten werden uitgezet op een logschaal, en passende lijnen werden bepaald voor elk profiel (Figuur 6C). De eerste component was zeer vergelijkbaar tussen de monsters, met een piek met een maximum bij DP 6. Dit illustreert dat het vertakkende enzym expliciet een maximum aan dergelijke ketens produceert. De tweede component verscheen als een brede schouder, die al werd beschreven voor muizen en menselijke glycogenen2. De helling van de tweede component ontstond bij een hogere DP in ΔglgA1 en de helling van de overeenkomstige fittinglijn (rode lijn) was lager dan het wildtypeprofiel. Het ontbreken van GlgA1 vertraagt dus de arrestatie van ketenverlenging tijdens biosynthese die werd voorgesteld om op te treden door sterische belemmering voor muizen en menselijk glycogeen2. Deze gegevens suggereren dat het resterende langwerpige enzym (d.w.z. GlgA2) langere ketens produceert voordat de keten wordt verdrongen. In ΔglgA2 werd het tegenovergestelde effect waargenomen met een meer dramatische daling van de fittinglijn, wat bevestigt dat de ketens geproduceerd door de resterende GlgA1 over het algemeen korter zijn dan die gesynthetiseerd door GlgA2 alleen vóór sterische belemmering. Deze analyse suggereert dat beide isovormen een verschillende kinetiek bezitten en/of dat hun respectieve afstemming met vertakkende enzymactiviteit verschilt.

In het huidige protocol wordt de Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) techniek gebruikt om de ketenlengteverdeling (CLD) en de gemiddelde ketenlengte (ACL) van glycogeen te bepalen.

Bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) -methode

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Deze methode geeft een beter begrip van de structurele organisaties van glycogeendeeltjes. Het is een belangrijke kwestie omdat de populatie van de glucaanketens, de zogenaamde ketenlengteverdeling, de fysisch-chemische eigenschappen van de glycogeendeeltjes bepaalt. Zoals oplosbaarheid in water.Een groot voordeel van deze techniek is dat fluorescentie constant is, ongeacht de lengte van de glucaanketen. Er is slechts één APTS-molecuul gebonden door glucaan. De fluorescentie-intensiteit is dus recht evenredig met het aantal glucaanketens.Het veld voor geassisteerde capillaire elektroforese is geschikt voor het oplossen van het medische mechanisme van glycogeen metaboliserende enzymen. We kunnen bijvoorbeeld de mate van polymerisatie van glucaanketens bepalen die wordt overgedragen door enzymen te vertakken naar geaccepteerd glucaan. De reactie moet worden uitgevoerd in omstandigheden.Daarom moeten regio's worden beschermd tegen vocht. Meng 200 microliter van 0,5-2 milligram per milliliter gezuiverd glycogeen met 200 microliter van 100 acetaatbuffer van pH 4,8. Voeg 2 microliter isoamylase en 1,5 microliter pullulanase toe.Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer vervolgens bij 42 graden Celsius gedurende 16 uur in een buis van 1,5 milliliter. Stop de reacties door gedurende 5 minuten te broeden bij 95 graden Celsius.Centrifugeer op 16, 100 keer G'gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om te pelleteren en verwijder onoplosbaar materiaal. Verwijder het superonderhoud met een pipet en breng ze over in nieuwe geannoteerde buizen. Na het toevoegen van harsparels in lege micro-fugebuis, ontzout de supernatanten door het equivalent van 100 microliter van een anion kationenuitwisseling harsparels toe te voegen en te roeren.Verzamel de monsters door te pipetteren en plaats ze in nieuwe geannoteerde buizen. Vries de monsters droog. Bewaar gedroogde monsters bij kamertemperatuur of 20 graden Celsius.Meng de gedroogde monsters met 2 microliter 1 molair natriumcyanoboorhydride en tetrahydrofuraan, en 2 microliter 8 amino 1-3-6 pyreentrisulfonzuur. Incubeer bij 42 graden Celsius gedurende 16 uur in het donker. Voeg 46 microliter ultrazuiver water toe aan elk monster.Om de monsters 50 keer te verdunnen, voegt u één microliter van het monster toe aan 49 microliter ultrazuiver water in 100 microliter microvials. In vortex om grondig te mengen. Plaats de monsters gedurende 5 tot 10 minuten in het donker terwijl u het gezicht instelt.Om omgekeerde polariteit elektroforese uit te voeren, stelt u de methode in, stelt u de injectiedruk in op 0,5 pond kracht per vierkante inch. Stel vervolgens de polariteit in op de omgekeerde modus voor scheiding. Verdun de N-gebonden koolhydraatscheidingsbuffer tot een derde in ultrazuiver water.Voer de APTS-gelabelde Glucans-scheiding uit in de verdunde buffer op 30 kilovolt in een kaal gesmolten silicacapillair. Stel vervolgens de injectietijd in en start de analyse. Exporteer de ASC- en CDF-bestanden met respectievelijk het elektroferogramprofiel en de integratiegegevens.Open het ASC-bestand en teken de relatieve fluorescentie-eenheid volgens de tijdgrafiek. Open het CDF-bestand. Ga verder met een eerste automatische integratie en pas de volgende parameters aan met vallei tot vallei integratie en minimale oppervlakte.Controleer en corrigeer eventuele onjuiste integratiegebeurtenissen handmatig. De waargenomen fluorescentiesignalen tussen 4,13 en 4,67 minuten waren afkomstig van de niet-gereageerde APTS. De Aleoetentijd van het label Maltohexaose DP 6 werd geschat op 8,49 minuten.De APTS-gelabelde glucanen van runderglycogeen werden geïdentificeerd op basis van de Aleoetentijd van DP 6. Er werd geen spoor van vrije Maltooligosaccharide gedetecteerd in het controlemonster waarin glycogeen niet was geïncubeerd met debranching enzymen. Het inzetpaneel toont een scheiding van glucaanketens tot 44 DP. De ketenlengteverdeling wordt weergegeven als het percentage DP voor elke DP. De gemiddelde ketenlengte werd berekend door elk percentage keten maal de overeenkomstige mate van polymerisatie op te tellen.Gezichtsanalyse toonde aan dat de meest voorkomende glucanen Maltose en konijnenlever, Maltohexaose in de oester en Maltoheptaose in de runderlever zijn. De ketenlengteverdelingen van glycogeen gezuiverd uit wildtype en gemuteerde cyanobacteriële bacteriestammen werden bepaald met behulp van gezichtsanalyse. Subtractieve analyses werden uitgevoerd door het percentage van elk DP van wild type af te trekken van het percentage van elke DP van mutanten.De gemiddelde ketenlengteverdelingen van glycogeen van wildtype en mutanten van Synechocystis werden genormaliseerd volgens de maximale piek die voor elke CLD werd waargenomen. Deze techniek maakt een beter begrip mogelijk van menselijke ziekten geassocieerd met een defect in het glycogeenmetabolisme, met name de ziekte van Andersen, rijke resultaten van de accumulatie van abnormale glycogeendeeltjes in cellen.

determination-glucan-chain-length-distribution-glycogen-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven een methode voor de analyse van de verandering van N-gekoppelde glycanen door het vroege leven van glycoproteïnen na hun biosynthese in zoogdiercellen. Dit wordt bereikt door pulse-chase analyse van metabolisch gelabeld glycanen, enzymatische vrijlating uit glycoproteïnen en onderzoek door HPLC.

Pulse-chase analyse van N-gebonden suikerketens van glycoproteïnen in zoogdiercellen

In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische methode voor titratie van glycogeen in vitro. Deze techniek gebruikt de Abcam Glycogen testkit en is gebaseerd op opeenvolgende hydrolyse van glycogeen tot glucose en glucose titratie van fluorescentie.

Biochemische Titratie van glycogeen<em&gt; In vitro</em

We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Hier presenteren we een betrouwbare en gemakkelijke analyse om het glycogeengehalte in cyanobacteriële cellen te meten. De procedure omvat precipitatie, selecteerbare depolymerisatie en de detectie van glucose residuen. Deze methode is geschikt voor zowel wildtype als genetisch gemanipuleerde stammen en kan de metabolische techniek van cyanobacteriën vergemakkelijken.

Bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën

Een protocol voor de structurele analyse van polysacchariden door elektroforese van het gel (PACE), met behulp van mannan als voorbeeld is beschreven.

Structurele karakterisering van Mannan celwand polysacchariden in installaties die gebruikmaken van tempo

Technieken om de activiteit van belangrijke enzymen van glycogeenmetabolisme te meten, worden gepresenteerd, met behulp van een eenvoudige spectrofotometer die in het zichtbare bereik werkt.

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Voor de extractie van leverglycogeen werd een optimale sucroseconcentratie bepaald met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. De toevoeging van een kookstap van 10 minuten om glycogeenafbrekende enzymen te remmen, bleek gunstig.

De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

Het huidige protocol beschrijft de zuiveringsstappen en daaropvolgende studies van vier verschillende schimmel-β-glucanen als potentiële immunomodulerende moleculen die de anti-tumorale eigenschappen van microglia tegen glioblastoomcellen verbeteren.

Isolatie en zuivering van schimmel β-glucaan als immunotherapiestrategie voor glioblastoom

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Leer de FACE-methode voor het analyseren van glucaanketenlengteverdeling in glycogeen. Deze techniek helpt bij het begrijpen van structurele eigenschappen en metabole ziekten zoals Andersen's disease.

Bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) -methode (Video) | JoVE Journal

Bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) -methode

Meer video's verkennen