Bepaling van de glucaanketenlengteverdeling van glycogeen met behulp van de fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE) -methode

Deze methode geeft een beter begrip van de structurele organisaties van glycogeendeeltjes. Het is een belangrijke kwestie omdat de populatie van de glucaanketens, de zogenaamde ketenlengteverdeling, de fysisch-chemische eigenschappen van de glycogeendeeltjes bepaalt. Zoals oplosbaarheid in water.

Een groot voordeel van deze techniek is dat fluorescentie constant is, ongeacht de lengte van de glucaanketen. Er is slechts één APTS-molecuul gebonden door glucaan. De fluorescentie-intensiteit is dus recht evenredig met het aantal glucaanketens.

Het veld voor geassisteerde capillaire elektroforese is geschikt voor het oplossen van het medische mechanisme van glycogeen metaboliserende enzymen. We kunnen bijvoorbeeld de mate van polymerisatie van glucaanketens bepalen die wordt overgedragen door enzymen te vertakken naar geaccepteerd glucaan. De reactie moet worden uitgevoerd in omstandigheden.

Daarom moeten regio's worden beschermd tegen vocht. Meng 200 microliter van 0,5-2 milligram per milliliter gezuiverd glycogeen met 200 microliter van 100 acetaatbuffer van pH 4,8. Voeg 2 microliter isoamylase en 1,5 microliter pullulanase toe.

Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer vervolgens bij 42 graden Celsius gedurende 16 uur in een buis van 1,5 milliliter. Stop de reacties door gedurende 5 minuten te broeden bij 95 graden Celsius.

Centrifugeer op 16, 100 keer G'gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om te pelleteren en verwijder onoplosbaar materiaal. Verwijder het superonderhoud met een pipet en breng ze over in nieuwe geannoteerde buizen. Na het toevoegen van harsparels in lege micro-fugebuis, ontzout de supernatanten door het equivalent van 100 microliter van een anion kationenuitwisseling harsparels toe te voegen en te roeren.

Verzamel de monsters door te pipetteren en plaats ze in nieuwe geannoteerde buizen. Vries de monsters droog. Bewaar gedroogde monsters bij kamertemperatuur of 20 graden Celsius.

Meng de gedroogde monsters met 2 microliter 1 molair natriumcyanoboorhydride en tetrahydrofuraan, en 2 microliter 8 amino 1-3-6 pyreentrisulfonzuur. Incubeer bij 42 graden Celsius gedurende 16 uur in het donker. Voeg 46 microliter ultrazuiver water toe aan elk monster.

Om de monsters 50 keer te verdunnen, voegt u één microliter van het monster toe aan 49 microliter ultrazuiver water in 100 microliter microvials. In vortex om grondig te mengen. Plaats de monsters gedurende 5 tot 10 minuten in het donker terwijl u het gezicht instelt.

Om omgekeerde polariteit elektroforese uit te voeren, stelt u de methode in, stelt u de injectiedruk in op 0,5 pond kracht per vierkante inch. Stel vervolgens de polariteit in op de omgekeerde modus voor scheiding. Verdun de N-gebonden koolhydraatscheidingsbuffer tot een derde in ultrazuiver water.

Voer de APTS-gelabelde Glucans-scheiding uit in de verdunde buffer op 30 kilovolt in een kaal gesmolten silicacapillair. Stel vervolgens de injectietijd in en start de analyse. Exporteer de ASC- en CDF-bestanden met respectievelijk het elektroferogramprofiel en de integratiegegevens.

Open het ASC-bestand en teken de relatieve fluorescentie-eenheid volgens de tijdgrafiek. Open het CDF-bestand. Ga verder met een eerste automatische integratie en pas de volgende parameters aan met vallei tot vallei integratie en minimale oppervlakte.

Controleer en corrigeer eventuele onjuiste integratiegebeurtenissen handmatig. De waargenomen fluorescentiesignalen tussen 4,13 en 4,67 minuten waren afkomstig van de niet-gereageerde APTS. De Aleoetentijd van het label Maltohexaose DP 6 werd geschat op 8,49 minuten.

De APTS-gelabelde glucanen van runderglycogeen werden geïdentificeerd op basis van de Aleoetentijd van DP 6. Er werd geen spoor van vrije Maltooligosaccharide gedetecteerd in het controlemonster waarin glycogeen niet was geïncubeerd met debranching enzymen. Het inzetpaneel toont een scheiding van glucaanketens tot 44 DP. De ketenlengteverdeling wordt weergegeven als het percentage DP voor elke DP. De gemiddelde ketenlengte werd berekend door elk percentage keten maal de overeenkomstige mate van polymerisatie op te tellen.

Gezichtsanalyse toonde aan dat de meest voorkomende glucanen Maltose en konijnenlever, Maltohexaose in de oester en Maltoheptaose in de runderlever zijn. De ketenlengteverdelingen van glycogeen gezuiverd uit wildtype en gemuteerde cyanobacteriële bacteriestammen werden bepaald met behulp van gezichtsanalyse. Subtractieve analyses werden uitgevoerd door het percentage van elk DP van wild type af te trekken van het percentage van elke DP van mutanten.

De gemiddelde ketenlengteverdelingen van glycogeen van wildtype en mutanten van Synechocystis werden genormaliseerd volgens de maximale piek die voor elke CLD werd waargenomen. Deze techniek maakt een beter begrip mogelijk van menselijke ziekten geassocieerd met een defect in het glycogeenmetabolisme, met name de ziekte van Andersen, rijke resultaten van de accumulatie van abnormale glycogeendeeltjes in cellen.