Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

In dit JoVE-protocol gebruiken we druppelgebaseerde single-nucleus RNA-sequencing om de biologische architectuur van cardiale sympathische neuronen in gezondheid en ziekte te karakteriseren. Deze methode maakt de sequencing van een grote verzameling neuronale monsters over een bepaalde periode mogelijk. Door kernen met hashtag-oligo's te trekken, maakt deze methode het multiplexen van de monsters mogelijk.

Deze methode heeft het potentieel om te worden uitgebreid naar sequencing neuronen van de menselijke ganglia, wat een uitdaging is geweest vanwege de grote celgrootte en de moeilijke gelijktijdige verzameling van monsters. Conny van Munsteren, onderzoekstechnicus, en Lieke van Roon, promovendi van ons lab, demonstreren de procedure Door alle materialen te verzamelen die nodig zijn voor dissectie, worden vervolgens de muis op het dissectiebord bevestigd. Maak de muis nat met 70% ethanol om de verspreiding van de vacht te minimaliseren.

Open de huid van het nekgebied door een middellijnsnede te maken met een schaar. Beweeg onder een stereomicroscoop de sub-mandibulaire klieren opzij en verwijder de sternale mastoïde spier om de gemeenschappelijke halsslagader en de bifurcatie ervan bloot te leggen, evenals de superieure cervicale ganglia en verwijder het weefsel dat eraan vastzit. Ontleed de rechter en linker halsslagader bifurcatie en het weefsel dat eraan vastzit.

Breng elk ontleed stukje weefsel over naar een apart petrischaaltje van 3,5 centimeter met koude PBS. Lokaliseer de superieure cervicale ganglia die aan de carotisbiafurcatie is bevestigd. Reinig de superieure cervicale ganglia door de slagader en het aangehechte weefsel te verwijderen.

Om de stellate ganglia te ontleden, maak je een middellijnsnede in de buik, gevolgd door het openen van het diafragma en de ventrale thoracale wand. Verwijder de longen, gevolgd door het hart, om de dorsale thorax bloot te leggen. Zoek ter hoogte van de eerste rib de linker en rechter stellaat ganglia anterolateraal naar de musculus colli longus.

Ontleed beide stellate ganglia met een tang door het omliggende weefsel te verwijderen. Breng ze over in petrischalen van 3,5 centimeter met koude PBS. Breng met behulp van een tang de superieure cervicale ganglia en stellate ganglia over om microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter te scheiden en voeg vervolgens 500 microliter van 0,25% Trypsine-EDTA-oplossing toe aan elke buis en incubeer in een schuddend waterbad.

Laat de ganglia bezinken op de bodem van de microcentrifugebuizen. Breng het supernatant over in een buis van 15 milliliter met vijf milliliter ganglionmedium. Voeg aan de microcentrifugebuizen 500 microliter collagenase type 2-oplossing toe en incubeer in een schuddend waterbad.

Resuspend de ganglia na incubatie in collagenase-oplossing door pipetteren totdat weefselklonten niet langer worden gedetecteerd. Breng de celsuspensie over op de eerder gebruikte buis van 15 milliliter met het gangliacultuurmedium met Trypsine-EDTA-suspensie. Centrifugeer de celsuspensie en gooi het celsupernatant weg.

Resuspend de pellet in 270 microliter foetaal runderserum en breng het over naar een cryoviaal van 1 milliliter. Om de cellen te tellen, mengt u 5 microliter van de ganglionaire celsuspensie met vijf microliter van 0,4% trypan blauwe kleurstof. Laad het mengsel in een hemocytometer en tel de totale en levende celaantallen onder een microscoop.

Voeg vervolgens 30 microliter dimethylsulfoxide toe aan elke cryovial en meng goed. Breng de cryovialen over in een celbevriezingscontainer en plaats deze 's nachts op min 80 graden Celsius. Bereid buizen van 15 milliliter voor met een zeef van 30 micrometer erop.

Spoel de zeef voor met 1 milliliter ganglion medium. Haal de cryovialen uit vloeibare stikstof en ontdooi ze onmiddellijk in een waterbad bij 37 graden Celsius tot er een kleine pellet ijs in het cryoviaal achterblijft. Voeg 1 milliliter van het ganglionmedium toe aan elk cryoviaal terwijl u de injectieflacon voorzichtig schudt om de ganglionaire cellen te herstellen.

Laad de ganglionaire celsuspensie op de zeef en spoel af met 4 tot 5 milliliter ganglionmedium. Centrifugeer de gespannen celsuspensie. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in 50 microliter celwasbuffer.

Breng de celsuspensie over in een laagbindende microcentrifugebuis van 0,5 milliliter. Centrifugeer de celsuspensie. Een centrifuge met een zwenkbakrotor is vanaf nu essentieel.

Verwijder na centrifugeren 45 microliter van het supernatant zonder de celkorrel te ontwrichten. Voeg 45 microliter gekoelde lysisbuffer toe, voorzichtig gemengd door pipetteren, en incubeer de cellen gedurende 8 minuten op ijs en voeg vervolgens 50 microliter koude kernenwasbuffer toe aan elke buis. Centrifugeer de kernsuspensie en verwijder 95 microliter van het supernatant zonder de kernkorrel te verstoren.

Voeg 45 microliter gekoelde kernenwasbuffer toe aan de pellet, herhaal de centrifugering en verwijder het supernatant. Voeg aan de kernpellet 50 microliter ST-SB toe en pipetteer voorzichtig totdat de kernen volledig zijn geresuspendeerd, voeg vervolgens 5 microliter FC-blokkerend reagens toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Voeg vervolgens 1 microliter single-nucleus hashtag-antilichaam toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.

Voeg na incubatie 100 microliter ST-SB toe aan elke buis. Centrifugeer de suspensie en verwijder 145 microliter van het supernatant zonder de kernpellet te verstoren. Herhaal de centrifugering en verwijder het supernatant.

Resuspend de kernkorrel in 50 microliter ST-SB en meng voorzichtig. Neem 5 microliter van de kernensuspensie en meng het met 5 microliter van 0,4% trypan blauw om de kernen onder een microscoop te tellen. Nogmaals, centrifugeer de kernsuspensie en resuspend de kernkorrel in ST-SB om een doelkernconcentratie van 1.000 tot 3.000 kernen per microliter te bereiken.

Trek de monsters om het gewenste aantal cellen te bereiken. Kwaliteitsanalyse voor bibliotheekvoorbereiding toonde hashtag-oligo-afgeleide cDNA's kleiner dan 180 basenparen. Een brede piek van 300 tot 1.000 basenparen vertegenwoordigde een hoogwaardige genexpressiebibliotheek, terwijl een specifieke piek van 194 basenparen de hashtag oligo-bibliotheek liet zien.

Single-nucleus RNA sequencing analyse onthulde 12 clusters die werden gevisualiseerd door UMAP en hashtag antilichamen waren verdeeld over alle clusters. Specifieke etikettering door hashtag oligos werd bevestigd door de uitdrukking van Xist. Hashtags 1 tot 4 gelabeld vrouwelijk, terwijl 5 tot 8 gelabelde mannelijke monsters.

De kwaliteit en resolutie van de sequencinggegevens werden geverifieerd door belangrijke transcripties zoals TH, DBH en SNAP25 in clusters 5 en 7 voor sympathische neuronen, S100B in clusters 0 tot 3 voor satellietgliacellen, PECAM 1 in cluster 4 voor endotheelcellen en ACTA2 in cluster 8 voor stromale cellen. Bij het proberen van deze methode is het belangrijk om te onthouden dat de juiste voorbereiding en adequate apparatuur zoals fijne dissectieschaar, scherp pincet en een centrifuge met een zwaaiende emmerrotor essentieel zijn. De stapsgewijze benadering voor single-nucleus RNA-sequencing van sympathische extrinsieke cardiale ganglia heeft het potentieel voor brede toepassing bij het karakteriseren van de ganglia die andere gerelateerde organen en weefsels innerveert in gezondheid en ziekte.