Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Ons protocol helpt bij het in beeld brengen van oxygenatie van meercellige sferoïden met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop. Met behulp van deze methode kan men duizenden zuurstofsonde-gekleurde sferoïde microtissues produceren en deze vervolgens gebruiken in 3D-printtoepassingen. Bijvoorbeeld gevasculariseerde botweefseltransplantaten.

nabij-infrarode zuurstofsonde is compatibel met het gebruik van andere kleurstoffen zoals groene fluorescentiekleuring van Uiteindelijk maakt dit een live en multiparameter langetermijnanalyse mogelijk. Breng pdms-stempels met micropatronen over van een opslagflacon naar een steriele petrischaal en droog het gladde oppervlak gedurende 10 minuten aan de lucht onder de steriele laminaire luchtstroomomstandigheden. Plaats elke stempel in het midden van de put van een 12-well steriele weefselkweekplaat.

Droog één tot twee minuten aan de lucht met een open deksel. Bereid 50 milliliter 3% homogene agarose-oplossing en voeg onmiddellijk ongeveer twee milliliter hete agarose-oplossing toe aan elke put van de 12-putplaten om de ingevoegde PDMS-stempel te bedekken. Stolt de agarose gedurende 20 minuten door deze onder steriele luchtstroom te incuberen.

Gebruik een steriele spatel om de agarose met de ingebouwde PDMS-stempel ondersteboven in elke put. Voeg ongeveer 200 microliter steriel water toe aan de gladde bovenzijde van de stempel. Maak het los van de agarose met een spatel en verwijder het uit de put.

Voeg een milliliter overeenkomstige steriele celkweekmedia toe aan de agarosestempels voor direct gebruik. Bedek de plaat met het deksel en incubeer een nacht bij vier graden Celsius. Verwarm voor gebruik de agarose micro-patroonplaten gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator.

Spoel 70% tot 90% confluentiecelkweek met voorverwarmd PBS. Voeg dissociërende enzymoplossing toe en incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Neutraliseer later trypsine met volledige celkweekmedia die 10% FBS bevatten.

Om een suspensie met één cel te verkrijgen, dissocieert u celaggregaten met behulp van een pipetpunt van 1.000 microliter aan de bovenkant van de serologische pipet. Tel met behulp van een telkamer het aantal cellen per milliliter van de celsuspensie. Verdun de celsuspensie tot 500.000 cellen per milliliter en voeg er geconcentreerde zuurstofsondeoplossing aan toe.

Verwijder oude media uit micro-patroonputten van de 12-well agarose-gecoate celkweekplaat en voeg een milliliter van de voorbereide celsuspensie toe aan de putten. Kweek de sferoïden in een koolstofdioxide-incubator gedurende twee tot vijf dagen in de continue aanwezigheid van de zuurstofsonde om ervoor te zorgen dat deze wordt geladen tijdens sferoïdevorming en verdichting. Sluit het uiteinde van een steriele patroon van drie kubieke centimeter met een tipdop en vul met bio-inkt door te pipetteren.

Steek een zuiger in de cartridge en houd deze ondersteboven. Verwijder de dop en duw de zuiger in de richting van de bio-inkt totdat alle lucht uit de patroon is verwijderd. Koel de bio-inkt in de verwarmingsmantel van de bioprinter op 23 graden Celsius.

Spuit de bioprinter in met 70%ethanol en droog hem met absorberend papier. Schroef een drukadapter aan de bovenkant van de cartridge. Monteer een conische polyethyleennaald van 22 gauge op de patroon.

Installeer de cartridge in de verwarmingsmantel op de printkop op basis van extrusie. Sluit de drukinlaat aan en open de clip op de inlaat. Laad het G-code bestand van uw ontwerp in de afdruksoftware.

Start naaldlengtemeting. Regel de drukdruk door een beetje bio-inkt in een steriel petrischaaltje te doseren. Installeer een plaat met zes putten, open de putplaat, sluit de kap en druk af.

Laat na het printen de steigers gedurende 10 minuten bij vijf graden Celsius fysiek worden verknoopt. Bestraal de bedrukte steigers gedurende 60 seconden met een ultraviolette LED-lamp. Voeg onmiddellijk de overeenkomstige groeimedia met dubbele antibioticumoplossing toe aan alle putten met biogeprinte roosters.

Kweek de steigers bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator. Voor microscopie-observatie brengt u een geprint wafelraster over in een microscopieschaaldeksel met beeldmedia. Gebruik een pipet van één milliliter om de zuurstofsonde voorgekleurde sferoïden voorzichtig uit de agarose microputten te wassen en over te brengen in een conische onderbuis van 15 milliliter.

Om ervoor te zorgen dat alle sferoïden uit een put met micropatronen worden verzameld, spoelt u de put één tot drie keer met de extra één milliliter kweekmedia en combineert u alle sferoïde suspensies in één injectieflacon. Laat de injectieflacon maximaal 10 minuten verticaal staan om de sferoïden op de bodem te laten bezinken. Verwijder voorzichtig de media uit de buis en laat de sferoïden ongestoord.

Voeg een vers kweekmedium toe dat voldoende is voor ten minste 20 sferoïden per monsterschotel en suspens de sferoïden voorzichtig opnieuw op door te pipetteren. Voeg onmiddellijk een gelijk volume sferoïde suspensie toe aan elke voorgecoate microscopieput. Laat de sferoïden een uur bij 37 graden Celsius staan om zich goed aan het oppervlak van de microscopie te hechten.

Verwijder het medium uit de microscopieput en spoel eenmaal af met beeldvormende media. Voeg de exacte hoeveelheid beeldmedia toe aan het monster. Stel de microscopie goed in met gekleurde sferoïden op het microscopiestadium.

Gebruik het vergrotingsobjectief 10X om het monster in transmissielicht te bekijken. Stel vooraf scherp op sferoïden, plaats ze in het midden van het beeld en breng het objectief met de vereiste hoge vergroting naar de werkpositie. Focus op transmissielichtmodus in de equatoriale doorsnede van de sferoïde.

Pas de instellingen aan voor het verzamelen van fluorescentie- of fosforescentiesignalen van referentie en gevoelige spectrale kanalen van de zuurstofsonde en start het beeldvormingsproces. Open het vsi-bestand met zuurstofsonde-intensiteitsgegevens van referentie- en gevoelige spectrale kanalen in samengevoegde modus. Open het functievenster voor verhoudingsanalyse vanuit het meetmenu.

Kies de intensiteit van het referentiekanaal als teller en de intensiteit van het gevoelige kanaal als noemer voor R-berekening. Pas in het venster voor verhoudingsanalyse de overeenkomstige intensiteitsdrempelinstellingen toe op elk spectraal kanaal om de achtergrond af te trekken van de samengevoegde intensiteitsafbeelding. ROI-maskers die worden toegepast op sferoïde afbeeldingen bepalen sferoïde randen.

Verhoog de drempelwaarden totdat de achtergrond van de afbeelding uniform zwart is. Pas in het venster voor de verhoudingsanalyse de schaalfactor aan op de verhoudingsafbeelding totdat de voorbeeldafbeelding de gewenste resolutie van het R-verloop biedt. De afbeelding van de verdeling van de intensiteitsverhouding wordt als laag toegevoegd aan de oorspronkelijke meerkanaalsafbeelding.

Activeer in het venster van de meerkanaalsafbeelding de laag met een valse kleurenbalk. Bepaal handmatig de koppelings- en ontkoppelingslimieten van een histogram voor ratioverdeling met behulp van de vaste schaaloptie in het weergavevenster aanpassen. Open het bijbehorende transmissielichtbeeld van sferoïden.

Kies de lineaire liniaalfunctie en meet de diameter van sferoïden. Exporteer gegevens als een spreadsheettabelbestand. Kies de ROI van de vereiste grootte en vorm en pas deze toe op de periferie en hypoxische kern van de sferoïde.

Transformeer de ROI naar het meetobject om de gemiddelde R binnen de gekozen ROI te analyseren. Exporteer gegevens in een tabelindeling die compatibel is met spreadsheets. Pas metingen toe op elke microscopiesectie van sferoïden om de dataset van sferoïdediameters RC en RP te verkrijgen om verdere berekeningen en statistische vergelijkingen uit te voeren.

Combineer alle gegevens in één spreadsheetbestand. MMIR1-sonde heeft een lage fotobleaching en is geschikt voor real-time studie van snelle respiratoire respons in hDPSC-sferoïden op verschillende mitochondriale stimuli. FCCP vertoonde slechts een licht ontkoppelend effect in sommige gebieden en vervolgens licht verminderde celademhaling.

Aan de andere kant remde rotenon de ademhaling sterk, wat leidde tot sferoïde reoxygenatie en dissipatie van de periferie-naar-kern zuurstofgradiënten binnen ongeveer 80 seconden na stimulatie. Met behulp van het geautomatiseerde protocol van pixel-voor-pixel intensiteitsverhoudingsberekeningen die door de beeldvormingssoftware worden geleverd, worden real-time gedetecteerde periferie-naar-kern zuurstofgradiënten in alle sferoïde typen gevisualiseerd met de zuurstofrijke periferie en hypoxische niches in het midden. De grafieken hierin tonen verhoudingsprofielen van de equatoriale sferoïde doorsneden voor verschillende sferoïde types.

Vergeleken met homocellulaire hDPSC-sferoïden hadden heterocellulaire hDPSC- tot HUVEC-sferoïden significant steilere gradiënten. De periferie-naar-kern zuurstofgradiënt in heterocellulaire sferoïden wordt waarschijnlijk gegenereerd door hDPSC in hun samenstelling volgens hDPSC sferoïden oxygenatie met sterke ademhalingsactiviteit. De grafieken laten zien dat biogeprinte hDPSC-sferoïden een significant zuurstofrijke periferie hadden dan sferoïden gemeten vóór bioprinting, terwijl hun kernoxygenatie vergelijkbare waarden had.

Als incidentele sondeprecipitatie de uniforme sferoïdevorming verstoort, filtert of centrifueert u de sondeoplossing vóór gebruik met hoge snelheid. Het corrigeren van naaldlengtemeting en drukregeling zijn essentiële stappen om de bioprintsnelheid en veerpootdiameter en bioprintmicroaggregaten in een poreuze steiger te matchen. Kies de microscopie-instellingen voor zuurstofgevoelige sondebeeldvorming, rekening houdend met hun effect op de fotostabiliteit van de sonde.

Zuurstofbeeldvorming is compatibel met vele soorten live microscopiemetingen. Na beeldvorming kan men ook immunofluorescentie uitvoeren, eiwitten extraheren voor Western blotting of genexpressieanalyse uitvoeren.