Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex
3 december 2021
Het protocol beschrijft een wijziging van de snelle Golgi-methode, die kan worden aangepast aan elk deel van het zenuwstelsel, voor het kleuren van neuronen in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van de rat.
Hoewel relatief eenvoudig, heeft de Golgi-impregnatietechniek enkele lastige stappen en als ze niet goed worden uitgevoerd, resulteert dit in cellen die ongeschikt zijn voor analyse. Deze techniek zorgt voor een snelle, reproduceerbare labeling van Golgi geïmpregneerde neuronen. En bovendien maakt de kleine standaardfout van het gemiddelde vergelijking tussen experimenten mogelijk.
Het meest uitdagende deel van deze techniek is het snijden van de cryostaatsecties, omdat er een ongewone consistentie en fixatie zijn, en daarom is het een beetje een uitdaging om ze op de dia plat te krijgen. Plaats eerst een kleine hoeveelheid weefselmedium op een pre-cool cryostaat chuck. Monteer de hersenblokken op cryostaat chucks door een kant van het blok iets te ontdooien in een gehandschoende hand en deze op het weefselmedium te plaatsen.
Gebruik een vriesspray op het mes en het blok. Gebruik de antirolplaat of borstel om het gedeelte vlak te houden tijdens het snijden. Knip 100 micrometer secties op een cryostaat bij min 22 graden Celsius.
Ontdooi de montage, indien mogelijk, met behulp van een schuif op kamertemperatuur en zet deze snel af tegen het gedeelte. U kunt ook dia's in de cryostaat bewaren, zodat ze bevriezen. Breng het gedeelte over met een koude tang of een koude verfkwast en ontdooi de montage.
Monteer drie tot vier coronale secties op verzakkingen. Maak het mes schoon met papieren doekjes tussen de plakjes. Als het mes verder moet worden gereinigd, gebruik dan 100% ethanol en droog voordat u de volgende plak snijdt.
Plaats dia's in rekken, ver genoeg uit elkaar geplaatst om de oplossing toegang te geven tot secties. Plaats secties twee keer gedurende vier minuten in gedestilleerd water voordat u ze gedurende 10 minuten in de Golgi-impregnatieoplossing plaatst. Scheid de afdekstroken om ervoor te zorgen dat er slechts één afdekslip op de secties wordt geplaatst.
Bedek de glazen platen met een royale hoeveelheid bevestigingsmedium voordat u een glazen afdekslip op de dia plaatst. Zodra de hoes was afgegleden, werden droge dia's gedurende drie tot vijf dagen op niet-poreus papier gemarkeerd en enigszins verplaatst, vooral na de eerste dag om plakken te voorkomen. Breng de dia's later over naar diahouders en idealiter droog dia's gedurende ten minste drie weken voordat u ze onderzoekt.
Om de dendritische wervelkolomdichtheid in piramidale neuronen van zowel de mediale prefrontale cortex als het CA1-gebied van de hippocampus te analyseren, meet u de dendritische lengte met behulp van een beeldanalyseprogramma. Tel de stekels op de dendrieten met behulp van een handteller en noteer zowel de lengte als het aantal stekels. Kies voor analyse neuronen met cellichamen en dendrieten terwijl ze geïmpregneerd zijn, en dendrieten die continu en te onderscheiden zijn van de aangrenzende cellen.
De figuur toont voorbeelden van Golgi geïmpregneerde cellen in het CA1-gebied van de hippocampus wordt getoond bij laag en hoog vermogen. De figuur illustreert een experiment waarbij de basale dendritische wervelkolomdichtheid werd verhoogd op piramidale cellen bij adolescente mannelijke en vrouwelijke ratten na omgevingsverrijking in CA1 en de mediale prefrontale cortex. Het is een uitdaging om de secties koud genoeg te houden tijdens het snijden en we gebruiken veel vriesspray om dat te doen.
En dan is het vervolgens moeilijk om de secties op de dia's te krijgen en ze plat te laten drogen. Deze techniek wordt gebruikt om neuroanatomische kenmerken te onderzoeken. Het kan alleen of in combinatie met andere neuroanatomische traceringsmethoden worden gebruikt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een gemodificeerde snelle Golgi-methode voor het kleuren van neuronen specifiek in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van ratten. De techniek maakt een effectieve labeling van neuronen mogelijk, wat analyse van neuroanatomische kenmerken faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neuroanatomie
- Celbiologie
Achtergrond
- De Golgi-impregneertechniek is een gevestigde methode voor het kleuren van neuronen.
- Toepassing hiervan maakt onderzoek naar de dendritische structuur en spinedichtheid mogelijk.
- De methode kan worden aangepast aan diverse regio's binnen het zenuwstelsel.
- Vanwege de weefselconsistentie zijn er uitdagingen bij het snijden van coupes op cryostaten.
Doel van de studie
- Om de bestaande Golgi-methode te verbeteren voor een betere neuronale labeling.
- Om de dichtheid van dendritische stekels in specifieke hersengebieden te onderzoeken.
- Om de effecten van omgevingsfactoren op de neuronale morfologie te verkennen.
Gebruikte methoden
- Snelle Golgi-impregnatietechniek in hersenweefsels van ratten.
- Hoge precisie bij het snijden van cryostaatsecties van 100 micrometer.
- Ontdooitechnieken voor het correct monteren van secties op objectglazen.
- Incubatie in Golgi-oplossing voor effectieve neuronale kleuring.
- De analyse omvatte het meten van de dendrietlengte en het tellen van spines met behulp van software voor beeldanalyse.
Belangrijkste resultaten
- De techniek resulteerde in een reproduceerbare labeling van neuronen die geschikt was voor analyse.
- Bewijzen toonden een verhoogde spine-dichtheid in piramidale neuronen aan na omgevingsverrijking.
- Er werd een succesvolle identificatie van veranderingen in de dichtheid van basale dendritische spines vastgesteld bij zowel mannelijke als vrouwelijke adolescente ratten.
Conclusies
- Deze studie valideert de gemodificeerde Golgi-methode als een betrouwbare benadering voor neuroanatomische analyse.
- Inzichten in de dichtheid van dendritische stekels dragen bij aan het begrip van neuronale plasticiteit.
- Toekomstige toepassingen kunnen het beoordelen van omgevingsinvloeden op de hersenmorfologie omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze snelle Golgi-kleuringsmethode biedt een reproduceerbare benadering met een lage variabiliteit voor het visualiseren van de dichtheid van dendritische spines in belangrijke hersengebieden die relevant zijn voor neuropsychiatrische ziekte-modellen. Door een consistente kwantificering van synaptische structuren in de hippocampus en prefrontale cortex mogelijk te maken, ondersteunt deze techniek target-validatie en mechanistische risicoreductie in CNS-drug discovery-programma's. De compatibiliteit met bevroren weefselopslag en de minimale variabiliteit tussen experimenten verhogen de betrouwbaarheid van de assay voor longitudinale preklinische studies.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot synaptische plasticiteit en dendritische morfologie in ziekterelevante neurale circuits te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve metingen van de spine-densiteit per 10 µm dendriet voor betrouwbare vergelijkingen tussen experimenten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door structurele neuroanatomie te koppelen aan functionele uitkomsten in modellen van omgevingsverrijking en farmacologische modellen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert consistent goed geïmpregneerde neuronen met minimale achtergrondruis, wat een betrouwbare visualisatie en telling van dendritische stekels mogelijk maakt.
- Reproduceerbaarheid: Vertoont extreem kleine afwijkingen in stekeldichtheid tussen experimenten, wat de precisie van de assay en de statistische kracht ondersteunt.
- Schaalbaarheid: Maakt accumulatie van hersenweefsel en bevroren opslag tot aan de verwerking mogelijk, wat batchverwerking en workflow-efficiëntie in discovery pipelines faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar op regio's in de hippocampus en de prefrontale cortex die betrokken zijn bij modellen voor cognitie, depressie en schizofrenie.
- Translationele continuïteit: Maakt analyse van de spine-densiteit mogelijk als een op biomarkers afgestemde readout voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de neuronale structuur.
- Mechanische risicoreductie: Verbindt structurele veranderingen (bijv. toename van de spine-densiteit na verrijking) met functionele plasticiteit, wat het vertrouwen in het doelwit binnen CNS-programma's ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische fenotypische screening, in het bijzonder voor programma's gericht op het centraal zenuwstelsel ter beoordeling van neuroplasticiteit en synaptische integriteit.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot dendritische structuur en spine-dichtheid als indicatoren voor synaptische gezondheid en neuronale connectiviteit.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten (spine-aantal per 10 µm dendriet) die geschikt zijn voor high-content analyse en het vergelijken van effecten van verbindingen.
- Analytica: Maakt statistische vergelijking van spine-dichtheid tussen verschillende condities mogelijk middels beeldanalyse en handmatig tellen, waarbij een lage standaardfout van het gemiddelde de betrouwbaarheid van de gegevens verhoogt.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische validatie door structurele read-outs te bieden die correleren met functionele uitkomsten in leer- en geheugenmodellen.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Vormt een gestandaardiseerd, herbruikbaar neuroanatomisch platform dat toepasbaar is op meerdere hersengebieden en ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in beoordelingen van synaptische plasticiteit te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door consistente impregnatie, een lage achtergrondruis en minimale variantie tussen experimenten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door betrouwbare neuroanatomische gegevens te leveren om verbindingen met aantoonbare effecten op de dendritische structuur te prioriteren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door structurele CNS-biomarkers te kwantificeren die gekoppeld zijn aan cognitieve en gedragsmatige eindpunten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in cryostaatsnijden en weefselbehandeling om de vlakheid en integriteit van de coupes te behouden tijdens het snijden bij -22°C.
- Afhankelijk van correcte ontdooi- en monteertechnieken en het gebruik van een anti-roll plaat of penseel om beschadiging van de coupes tijdens de overdracht naar het objectglas te voorkomen.
- Vereist gestandaardiseerde kleuringstijden (10 min in Golgi-oplossing) en het aanbrengen van het monteermedium om een consistente neuronale labeling te waarborgen.
- Omvat langere droogperiodes (initieel 3–5 dagen, daarna ≥3 weken) vóór de beeldvorming, wat een geplande workflow-planning vereist.
- Vertrouwt op getraind personeel voor het nauwkeurig tellen van dendritische stekels en het meten van de lengte met behulp van beeldanalyse-instrumenten en handmatige tellers.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Sectioning of Brain Tissues and Mounting
2:04
Staining and Dehydration of Brain Tissue
3:06
Determination of Dendritic Spine Density
3:48
Results: Observation of Hippocampus and Effect of Environmental Enrichment on CA1 and mPFC
4:23
Conclusion
