Verwijdering van een interne translationele startplaats van mRNA met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte
16 maart 2022
Het huidige protocol beschrijft een enkele M213L-mutatie in Gja1 die de connexin43-generatie over de volledige lengte behoudt, maar de vertaling van de kleinere GJA1-20k intern vertaalde isovorm voorkomt.
De moeilijkheid met een enkele residusubstitutie is om dieren efficiënt te genotyperen, ondanks het verschil in enkel residu. Speciaal gebruik van een restrictie-enzym voegt slechts een enkele, snelle en goedkope stap toe aan typische PCR-gebaseerde genotypering. Dit protocol kan worden toegepast op elk ander muismodel met een punt van mutatie als de doelsequentie wordt herkend door een restrictie-enzym, wat meestal het geval is.
Knip één tot drie millimeter van de staartpunt met een schone schaar en breng deze over naar een 0,2 milliliter achtstrips PCR-buis. Nadat u het staartmonster hebt bevat zoals beschreven in het manuscript, bewaart u het bij T-minus 20 graden Celsius tot de extractie, tot ongeveer een week. Voeg 100 microliter weefsellysisoplossing per buis toe en meng goed, gevolgd door spin-down met behulp van een tafelmodel minicentrifuge op 2, 200 keer G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.
Zorg ervoor dat de staartmonsters in de oplossing zijn ondergedompeld. Plaats de buizen op een thermische cycler die is ingesteld door de parameters voor weefsellysis, inactivatie en vasthouden te programmeren. Bewaar het weefsel lysaat bij vier graden Celsius gedurende maximaal een week als PCR niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd.
Bereid een PCR-oplossing met vijf microliter nucleasevrij water, 0,75 microliter 10 micromolaire voorwaartse en omgekeerde primers en 7,5 microliter PCR-mastermix per monster in een nieuwe PCR-buis. Voeg één microliter van het eerder bereide weefsellysaat toe aan de PCR-oplossing. Meng de PCR-oplossing goed en draai met een tafelmodel minicentrifuge op 2, 200 maal G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.
Zet de buizen op een geprogrammeerde thermische cycler. Zodra de reactie is voltooid, bewaart u de PCR-producten bij vier graden Celsius gedurende één tot twee maanden of ongeveer een jaar bij min 20 graden Celsius. Bereid de enzymoplossing met zeven microliter nucleasevrij water, twee microliter CutSmart-buffer met een sterkte van 10X en één microliter NlaIII-restrictie-enzym.
Als er meerdere monsters zijn, vermenigvuldigt u elke inhoud om het mengsel te maken en aliquot 10 microliter per buis. Voeg per buis 10 microliter PCR-product toe aan de enzymoplossing. Meng goed en draai naar beneden met de tafelmodel minicentrifuge zoals eerder gedemonstreerd.
Plaats de buizen op een geprogrammeerde thermische cycler of warmteblok. Bewaar het product na incubatie onder koude omstandigheden. Voeg 0,75 gram agarose toe in 50 milliliter tae-buffer met enkele sterkte.
Meng en verwarm de agarose in de magnetron totdat deze volledig is opgelost. Voeg na het afkoelen vijf microliter DNA-kleuring toe en meng voorzichtig. Giet 25 milliliter van de agarose gel in de gelvorm en laat de gel stollen.
Laad 10 microliter verteerd PCR-product in de put. Laat de gel 35 minuten met 100 volt lopen. Stel je de agarose-gel voor onder ultraviolet licht.
De agarose-elektroforese uitgevoerd met behulp van het verteerde PCR-product resulteerde in verschillende banden van verschillende grootte in elk genotype, met respectievelijk twee banden in wildtype, drie in heterozygoot en één in homozygoot. Testinjectie met blastocystanalyse resulteerde in een slagingspercentage van 76,9% bij het injecteren van 50 nanogram per microliter van de donor oligo's en een slagingspercentage van 25% bij het injecteren van respectievelijk 25 nanogram per microliter van dezelfde donor oligo's. Ten slotte werd door het injecteren van 50 nanogram per microliter van de donor oligo's met ethanolprecipitatie stichterdieren met een slagingspercentage van 50% verkregen.
Zuivering van oligodonoren door ethanolprecipitatie verlaagde de toxiciteit met behoud van een hoge efficiëntie van het bewerken van het genoom. Zorgvuldige hantering en bij het toevoegen van een lage hoeveelheid reagentia is erg belangrijk. Zorg ervoor dat ze correct worden toegevoegd en goed worden gemengd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het genotyperen van dieren met een enkele M213L-mutatie in het Gja1-gen, die leidt tot de productie van full-length Connexin43 terwijl de translatie van de kleinere GJA1-20k-isovorm wordt voorkomen. De methode benadrukt de efficiëntie en kosteneffectiviteit van het gebruik van restrictie-enzymen in combinatie met PCR-gebaseerd genotyperen.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Genetica
- Moleculaire biologie
- Diermodellen
Achtergrond
- Belang van het identificeren van genetische mutaties
- Uitdagingen van substituties van enkelvoudige residuen
- Toepassing van restrictie-enzymen bij genotypering
Gebruikte methoden
- PCR-gebaseerde genotypering
- Muismodellen met puntmutaties
- Agarosegelelektroforese voor DNA-analyse
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van genotypen met verschillende bandingspatronen
- Hoge succespercentages bij het genereren van founder-dieren
- Gevalideerde efficiëntie van de beschreven methoden voor genetische analyse
Conclusies
- De studie demonstreert een efficiënt protocol voor het genotyperen van mutaties in muismodellen.
- Het draagt waardevolle methodologieën bij voor genetisch onderzoek in de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit protocol maakt nauwkeurige genotyping van puntmutaties in muismodellen mogelijk, ter ondersteuning van target-validatiestudies waarbij isoform-specifieke eiwitexpressie moet worden ontleed. Door verwarrende getrunceerde isoforms te elimineren terwijl de functie van het volledige eiwit behouden blijft, wordt de mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase verbeterd. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen in therapeutische hypothesen met betrekking tot de biologie van Connexin 43 en gerelateerde gap junction-routes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de functionele bijdrage van full-length Cx43 te isoleren van N-terminale getrunceerde isovormen.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbare genotyperingsmethode om wild-type, heterozygote en homozygote mutante allelen in grote cohorten te onderscheiden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door te verduidelijken of geobserveerde fenotypes voortvloeien uit verlies van het full-length eiwit of uit isovormspecifieke mechanismen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert DNA-monsters met restrictiefragmentpatronen die geschikt zijn voor high-throughput screening-workflows.
- Kwantitatieve output: Maakt allelspecifieke kwantificering mogelijk via PCR-restrictiefragmentlengtepolymorfisme-analyse.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert genotypering tussen laboratoria door middel van een goedkope toevoeging van één enkel enzym aan bestaande PCR-protocollen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Faciliteert preklinische modellen waarin Cx43-trafficking en de assemblage van gap junctions betrokken zijn bij cardiale, neurale of oncologische aandoeningen.
- Translationele continuïteit: Koppelt moleculair genotype aan fenotypische uitkomsten door volledige Cx43-expressie te behouden terwijl GJA1-20k wordt verminderd.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria door correlatie van isoformexpressieniveaus met functionele read-outs in vivo mogelijk te maken.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische effectiviteitstesten, met name wanneer isoform-specifieke eiwitfuncties moeten worden ontrafeld.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door genetische modellen mogelijk te maken die onderscheid maken tussen de functie van het eiwit in volledige lengte en de activiteit van getrunceerde isovormen.
- Screening: Levert assay-klaar genomisch DNA voor downstream toepassingen zoals CRISPR-validatie of het beheer van kweekkolonies.
- Analytics: Biedt duidelijke, scorebare bandenpatronen op agarosegel die een snelle genotypebepaling mogelijk maken zonder sequencing.
- Translational Research: Maakt preklinische studies mogelijk waarbij Cx43-membraanlokalisatie en intercellulaire communicatie cruciale mechanistische eindpunten zijn.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar aan elke puntmutatie waarbij een restrictieplaats kan worden geïntroduceerd of verstoord, wat een herbruikbaar genotyping-platform biedt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie door isovormspecifieke bijdragen te isoleren.
- Operationele waarde: Verhoogt de doorvoer en verlaagt de kosten per monster via een enkele post-PCR restrictie-digeststap.
- Strategische waarde: Verbetert het beslisvertrouwen bij lead-optimalisatie door genotype-fenotype-relaties te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk van kandidaten die zich richten op Cx43-afhankelijke pathways.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist moleculaire biologie-expertise in het ontwerp van PCR-primers en de selectie van restrictie-enzymen.
- Is afhankelijk van toegang tot thermocyclers, agarosegelelektroforese-systemen en UV-beeldvormingsapparatuur.
- Maakt standaardisatie van weefsellysis en PCR-condities tussen gebruikers noodzakelijk voor consistente resultaten.
- Aanpassing aan alternatieve modelsystemen is afhankelijk van de sequentiecontext en de compatibiliteit van restrictie-enzymen.
- Beperkt tot mutaties die een herkenningsplaats voor een restrictie-enzym wijzigen of creëren; stille mutaties kunnen alternatieve strategieën vereisen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
