Name: Verwijdering van een interne translationele startplaats van mRNA met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Leer een efficiënte PCR-gebaseerde genotyperingsmethode voor muismodellen met puntmutaties in het Gja1-gen. Deze protocol gebruikt restrictie-enzymen om genotype-identificatie snel en kosteneffectief uit te voeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het project werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 en R01HL159983) aan RMS.

'Alle dierverzorgings- en studieprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Cedars-Sinai Medical Center en de University of Utah. C57BL/6J vrouwelijke muizen verkregen uit commerciële bronnen op de leeftijd van 8-9 weken (zie Tabel met materialen) werden gebruikt voor de experimenten.
1. Voorbereiding op gentargeting
<ol><li>Selecteer de richtdoelsequentie rond de beoogde mutatieplaats die M213 codeert met behulp van CRISPOR-webalgoritme 4,9,10 (zie Tabel met materialen). OPMERKING: Er werd een 20-base gidssequentie (ATTCAGAGCGAGAGACACCA) geselecteerd, in de tegenovergestelde streng van de GJA1-coderende sequentie, met een MIT-score11 van 62, waarbij de potentiële splitsingsplaats zich bevindt na 16 basen stroomafwaarts van het te muteren codon (ATG) (figuur 1; de hele crRNA-sequentie is weergegeven in tabel 1).</li>
	<li>Synthetiseer het crRNA en tracrRNA die interageren met Cas9 als gids-RNA12. OPMERKING: Hoewel de MIT-score van het gids-RNA 62 is, is er slechts één potentiële off-target mutatie met vier mismatches meer dan 12 basen verwijderd van de PAM. Daarom wordt deze gids RNA als veilig beschouwd.</li>
	<li>Ontwerp een donor oligo complementair aan de gidssequentie om een enkele aminozuursubstitutie (ATG naar TTA; M213L) met 60 en 48 basen homologie armen in respectievelijk de 5'- en 3'-zijden. OPMERKING: Dit donor oligo omvat een puntmutatie voor verstoring van de PAM (AGG naar ACG) door introductie van een stille mutatie (TCC naar TCG; S217S) om herbewerking na CRISPR homology-directed repair (HDR)13 te voorkomen voor de introductie van de beoogde mutaties (figuur 1 en tabel 1).</li>
	<li>Gebruik NaCl (eindconcentratie van 200 mM) om 10 μg oligo's neer te slaan om zoutoverdracht naar pronucleaire micro-injectiebuffer te minimaliseren (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA en 100 mM NaCl zonder spermine en spermidine14). OPMERKING: Was de DNA-pellet niet met 70% ethanol, omdat de pellet in de oplossing kan worden opgelost.</li>
	<li>Meng 50 ng/μL donor oligo, 60 ng/μL crRNA/tracrRNA mix (1:1 molaire verhouding) (vanaf stap 1.2) en 50 ng/μL eSpCas9 eiwit (zie Tabel der Materialen) om crispr-mengsel in eindvolume 20 μL te maken (tabel 2). Verlaag de concentratie van het donor oligo als hoge toxiciteit wordt waargenomen (bijv. 25 ng/μL).</li>
</ol>2. Inductie van superovulatie, oogsteieren, pronucleaire micro-injectie van CRISPR-mix en blastocystscreening
OPMERKING: Deze procedure volgt een eerder gepubliceerd algemeen protocol14.
<ol><li>Injecteer 5 IE PMSG (serumgonadotrofine van de drachtige merrie) (zie materiaaltabel) in 100 μL steriel water aan 5-10 muizen op de leeftijd van 8 weken door een intraperitoneale benadering om ongeveer 15:00 uur.m. (dag 1).</li>
	<li>Injecteer 5 IE hCG (humaan choriongonadotrofine) (zie Materiaaltabel) in 100 μL steriel water aan de eiceldonoren door een intraperitoneale benadering 46-48 uur na PMSG-injectie (dag 3). Zet 1:1 fokken op met dekreuen.</li>
	<li>Oogst bevruchte eieren in M2-medium met hyaluronidase, was driemaal in 100 μL M2-medium rond 10:00 .m en bewaar vervolgens in mWM15 of KSOM16 medium (dag 4) (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Introduceer het CRISPR-mengsel (stap 1.3) in embryo's in het 1-celstadium die uit de muizen zijn geoogst door pronucleaire micro-injectie14 op 100 μL M2 bedekt met paraffineolie in een plastic schaal op een omgekeerde microscoop met een contrastverhogende optiek in de vroege tot late namiddag (video 1). OPMERKING: Pronucleaire micro-injectie van het CRISPR-mengsel werd uitgevoerd op embryo's in het 1-celstadium na 14-16 uur postcoïtum (p.c.). De geïnjecteerde embryo's werden gedurende enkele uren gekweekt in een 5% CO2-incubator en chirurgisch met 18-20 uur p.c. overgebracht naar ontvangende ICR-muizen die dezelfde ochtend een copulatieplug hadden.</li>
	<li>Breng 20-30 2-cel embryo's over in elke ontvanger om recombinante dieren te produceren. OPMERKING: Volg het algemene protocol14 of kweek die embryo's gedurende 4 dagen in mWM of KSOM-medium om de efficiëntie te valideren en de toxiciteit te onderzoeken. Toxiciteit van het CRISPR-mengsel is aanvaardbaar wanneer ten minste een derde van de geïnjecteerde embryo's vroeg in het volledig uitgebreide blastocyststadium komt met meerdere recombinanten onder hen. Tegelijkertijd bereikt meer dan 90% van de ongemanipuleerde embryo's hetzelfde blastocyststadium in een parallelle cultuur. Volg de stap 2.6-2.9 voor blastcystscreening die niet essentieel is, maar desgewenst kan worden gedaan om het slagingspercentage van HDR te kwantificeren.</li>
	<li>Individueel vroeg oppakken tot volledig geëxpandeerde blastocysten met 2 μL kweekmedium met behulp van een verstopte fijne pipetpunt met een micropipetter in enkele PCR-buizen (dag 8; Video 2).</li>
	<li>Lyse blastocysten in 8 μL vergistingsmengsel (hetzelfde als stap 3.2; zie Materiaaltabel) en verwerk bij 75 °C gedurende 10 minuten, 95 °C gedurende 5 minuten en koel vervolgens af tot 4 °C voor opslag. Gebruik 2 μL van het lysaat als sjabloon voor PCR in een totaal PCR-mengsel van 15 μL (stap 3).</li>
	<li>Onderzoek de werkzaamheid van de HDR door agarosegel-elektroforese17 van de PCR-monsters na restrictieve vertering met NlaIII (stap 3-5).</li>
	<li>Bevestig de status van gerichte recombinatie door de 668 bp amplicon17 in de oprichters en het daaropvolgende nageslacht te sequentiëren om de integriteit van de mutatie te bevestigen.</li>
</ol>3. DNA-extractie
OPMERKING: Muizen op postnatale dag 10 werden gebruikt voor dit experiment als gevolg van plotselinge dood van GJA1-20k knock-out muis ongeveer 2-4 weken na de geboorte4. Een meer algemeen protocol kan ook worden toegepast naar aanleiding van eerder gepubliceerd rapport18.
<ol><li>Knip 1-3 mm van de teen of staartpunt met een schone schaar en breng deze over naar een 0,2 ml 8-Strip PCR-buis. Om besmetting tussen de teen- of staartmonsters te voorkomen, gebruikt u een voorgezuiverde schaar of één mes per muis of reinigt u voorafgaand aan elk monster met 70% ethanol of 10% bleekmiddel. Als de staart na het bemonsteren bloedt, oefen dan korte druk uit met gaas om de bloeding te stoppen. Bewaar de staartmonsters bij -20 °C tot de extractie gedurende maximaal ongeveer een week.</li>
	<li>Voeg weefsellysisoplossing (zie materiaaltabel) toe in een buis van 100 μL/buis en meng goed, gevolgd door spin-down met een tafelmodel minicentrifuge (2.200 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur). Zorg ervoor dat de staartmonsters in de oplossing zijn ondergedompeld.</li>
	<li>Plaats de buizen op een thermische cycler die is ingesteld door het volgende programma; 75 °C gedurende 10 minuten (weefsellysis), 95 °C gedurende 5 minuten (inactivering) en 4 °C (vasthouden). Bewaar het weefsel lysaat bij 4 °C gedurende maximaal een week als PCR's niet onmiddellijk kunnen worden uitgevoerd.</li>
</ol>4. DNA-amplificatie door PCR
<ol><li>Bereid een PCR-oplossing met 5 μL nucleasevrije H2O, 0,75 μL van 10 μM voorwaartse en omgekeerde primers en 7,5 μL PCR-mastermix (zie Materialentabel) per monster in een nieuwe PCR-buis (zie tabel 1 voor primersequenties). Als er meerdere monsters zijn, schaal de inhoud dan tot aliquot 14 μL per buis.</li>
	<li>Voeg 1 μL van het weefsellysaat toe aan de in stap 3.1 bereide PCR-oplossing. Pas op dat u de staart niet aanraakt.</li>
	<li>Meng goed en draai af met een tafelmodel minicentrifuge (2.200 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur).</li>
	<li>Zet de buizen op een thermische cycler die is ingesteld door het onderstaande programma. Bewaar de PCR-producten bij 4 °C gedurende 1-2 maanden of ~1 jaar bij -20 °C. OPMERKING: 95 °C gedurende 3 minuten (stap 1, Initiële denaturatie), 95 °C gedurende 15 s (stap 2, Denaturatie), 60 °C gedurende 15 s (stap 2, Gloeien), 72 °C voor 45 s (stap 2, Extensie), herhaal stap 2 gedurende 35 cycli, 72 °C gedurende 10 minuten (stap 3, Definitieve extensie) en 4 °C (stap 4, Vasthouden).</li>
</ol>5. Incubatie met restrictie-enzym
<ol><li>Bereid de enzymoplossing met 7 μL nucleasevrij H2O, 2 μL 10x CutSmart-buffer en 1 μL NlaIII-restrictie-enzym (zie Materialentabel). Als er meerdere monsters zijn, vermenigvuldigt u elke inhoud om het mengsel te maken en aliquot 10 μL per buis.</li>
	<li>Voeg 10 μL PCR-product verkregen in stap 3 toe aan de enzymoplossing per buis.</li>
	<li>Meng goed en draai af met een tafelmodel minicentrifuge (2.200 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur).</li>
	<li>Plaats de buizen op een thermische cycler of warmteblok dat is ingesteld door het onderstaande programma. Bewaar het product na de incubatie bij 4 °C gedurende 1-2 maanden of ~1 jaar bij -20 °C. OPMERKING: 37 °C gedurende 16 uur (ten minste 2 uur; korte incubatietijd kan leiden tot onvoldoende splitsing) en 4 °C voor het vasthouden.</li>
</ol>6. DNA-band detectie
<ol><li>Bereid een 1,5% agarose gel met DNA-gelkleuring voor elektroforese.<ol>
<li>Voeg 0,75 g agarose toe in 50 ml 1x TAE-buffer gevolgd door mix en verwarm in de magnetron totdat agarose volledig oplost. Voeg na het afkoelen 5 μL DNA-kleuring toe en meng voorzichtig.</li>
		<li>Giet in de gelvorm (25 ml per vorm) en laat de gel stollen. Om een betere resolutie en scheiding te verkrijgen, verhoogt u de agaroseconcentratie naar 2,5% -4% indien nodig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laad 10 μL verteerd PCR-product in de put. Meng indien nodig 6x laadbuffer.</li>
	<li>Laat de gel 35 min met 100 V lopen. OPMERKING: Deze parameters moeten mogelijk worden geoptimaliseerd.</li>
	<li>Beeld onder UV-licht (302 nm golflengte).</li>
</ol>

<ol><li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+connexin43+gap+junction+formation+by+internally+translated+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms.</a> Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GJA1-20k+arranges+actin+to+guide+Cx43+delivery+to+cardiac+intercalated+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs.</a> Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+isoform+GJA1-20k+promotes+microtubule+dependent+mitochondrial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport.</a> Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxiliary+trafficking+subunit+GJA1-20k+protects+connexin-43+from+degradation+and+limits+ventricular+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).</li>
<li>Syvanen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gels+to+chips%3A+%26%2334%3Bminisequencing%26%2334%3B+primer+extension+for+analysis+of+point+mutations+and+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">From gels to chips: &#34;minisequencing&#34; primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms.</a> Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+SNP+discovery+in+tetraploid+alfalfa+using+454+sequencing+and+high+resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis.</a> BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).</li>
<li>Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+for+SNP+genotyping+and+mapping+in+tetraploid+alfalfa+%28Medicago+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.).</a> Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).</li>
<li>Peng, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+quick+PCR-based+method+to+genotype+mice+with+a+leptin+receptor+mutation+%28db%2Fdb+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice).</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Paquet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+introduction+of+specific+homozygous+and+heterozygous+mutations+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9.</a> Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , (2014).</li>
<li>Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+sodium+lactate+in+Whitten%27s+medium+improves+in+vitro+developmental+capacity+of+one-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos.</a> Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).</li>
<li>Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVF+of+mouse+ova+in+a+simplex+optimized+medium+supplemented+with+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids.</a> Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).</li>
<li>Green, M. R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MRS+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%28Fourth+Edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition)</a>. , (2012).</li>
<li>Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genotyping+of+animals+followed+by+establishing+primary+cultures+of+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments.+95%22%5BJournal%5D)">Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+unexpected+CRISPR-Cas9+off-target+activity+revealed+by+trio+sequencing+of+gene-edited+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice.</a> PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).</li>
<li>Nature Medicine. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keep+off-target+effects+in+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Keep off-target effects in focus.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).</li>
<li>Mayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EcoRI-activity+of+EcoRI+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease.</a> FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+close+to+the+AUG+initiator+codon+affect+the+efficiency+of+translation+of+rat+preproinsulin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo.</a> Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutations+define+a+sequence+flanking+the+AUG+initiator+codon+that+modulates+translation+by+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes.</a> Cell. 44 (2), 283-292 (1986).</li>
<li>Basheer, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+response+protein+GJA1-20k+promotes+mitochondrial+biogenesis%2C+metabolic+quiescence%2C+and+cardioprotection+against+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury.</a> JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).</li>
<li>Shimura, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mitochondrial+fission+induced+by+stress-responsive+protein+GJA1-20k%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k.</a> Elife. 10, 69207(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een gen-gemodificeerd muismodel is een veel voorkomende benadering voor het begrijpen van de genfunctie. Omdat de intern vertaalde isovorm van GJA1-20k echter wordt vertaald uit hetzelfde Gja1-mRNA als Cx43 van volledige lengte, werd een creatieve strategie bedacht om de Cx43-expressie over de volledige lengte te behouden en toch de GJA1-20k-expressie te onderdrukken. De aanpak is gebaseerd op een mutatie van het interne startcodon van GJA1-20k. Met een single point mutatie werd M213 overgeschakeld naar L op <em...

De volledige lengte Connexin 43 (Cx43) en de N-terminus afgeknotte isovorm, GJA1-20k, gecodeerd door hetzelfde GJA1-mRNA, maar gebruiken verschillende startcodons1 om de translatie te initiëren. Cx43-translatie vindt plaats bij het eerste AUG-startcodon, terwijl GJA1-20k-translatie begint bij de AUG bij residu 213. Eerder werd vastgesteld dat GJA1-20k essentiële rollen heeft voor volledige Cx43-handel, actinestabilisatie en regulatie van mitochondriale morfologie in vitro 1,2,3.
Om de rol van GJA1-20k in vivo te begrijpen, werd een GJA1-20k "knock-out" muismodel gegenereerd dat de mogelijkheid behield om Cx43 van volledige lengte te maken. De aanpak was om het CRISPR-Cas9-systeem te gebruiken om het enkele residu bij 213 te vervangen van een methionine (M) naar een leucine (L) (Gja1M213L / M213L)4. Een interne M naar L mutatie vermindert de kans op interne translatie drastisch, maar behoudt de translatie en functie van eiwit4 over de volledige lengte. Omdat het wildtype (WT) en het gemuteerde allel identieke afmetingen en bijna identieke mRNA-producten hebben, is het bij de muizen erg moeilijk om het genotype te bevestigen. DNA-sequencing kan de mutatie identificeren, maar is te duur en tijdrovend voor routinematig gebruik. Over het algemeen zijn verschillende snellere genotyperingsmethoden vastgesteld, zoals Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), minisequencing-ligatie, hoge-resolutie smeltanalyse en tetra-primer amplificatie refractair mutatiesysteem PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Toch vereisen deze alternatieve methoden meerdere stappen, unieke bronnen en /of verschillende specifieke primersets die niet-specifieke PCR-producten kunnen induceren.
Dit protocol introduceert een gedetailleerde gen targeting en editing aanpak door CRISPR-Cas9 om een enkele aminozuurmutatie te creëren, en snelle genotypering wordt gepresenteerd om de mutatie te bevestigen. Genotype-identificatie omvat het creatieve gebruik van restrictie-enzymen die slechts een enkele set primers gebruiken om het doelgen te identificeren. Lezers worden verwezen naar Referentie4 om het diepgaande elektrofysiologische effect van plotselinge hartdood te observeren, veroorzaakt door een één residu Gja1M213L / M213L substitutiemutatie die nog steeds eiwit over de volledige lengte genereert, maar er niet in slaagt een kleinere intern vertaalde truncation isoform te genereren. Dit protocol zal andere muizenmodellen helpen een puntmutatie te gebruiken om de interne translatie van een isovorm van belang te verminderen met behoud van de expressie van het endogene eiwit over de volledige lengte.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 8-Strip PCR tube</td><td>Thomas Scientific</td><td>1148A28</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Voor pronucleaire micro-injectie buffer</td></tr><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Digestiebuffer voor NlaIII</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>Voor pronucleaire micro-injectie buffer</td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>24710-030</td><td></td></tr><tr><td>96-well Thermal cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Model # 9902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>muisstam</td></tr><tr><td>Chemidoc MP beeldvormingssysteem</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Om gelbeeld te maken met 302 nm UV-licht</td></tr><tr><td>eSpCas9-eiwit</td><td>MilliporeSigma</td><td>ESPCAS9PRO-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Gel Lading Dye Purple (6x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Laadbuffer voor elektroforese</td></tr><tr><td>Handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (humaan choriongonadotropine)</td><td>MilliporeSigma</td><td>23-073-425G</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3884-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Image Lab-software</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>Om gelbeeld te analyseren</td></tr><tr><td>Omgekeerde stereomicroscoop met plasDIC</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert A1</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Mouse Genotyping Kits</td><td>Roche Diagnostics</td><td>KK7352</td><td>Voor weefsel- of cellyse, DNA-extractie en PCR-mastermix</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>LifeGlobal</td><td>ZEKS-050</td><td>embryocultuurmedium</td></tr><tr><td>Lab coat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>MilliporeSigma</td><td>MR015D</td><td></td></tr><tr><td>NlaIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0125S</td><td>Om PCR-product te verteren</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Om reagentia te verdunnen</td></tr><tr><td>Paraffineolie</td><td>Nacalai USA</td><td>2613785</td><td></td></tr><tr><td>Plugged 20 &mu;L fijne pipettip</td><td>FisherScientific</td><td>02-707-171</td><td>Om blastocyten op te halen</td></tr><tr><td>PMSG (zwangerschapsserum van merrie)</td><td>ProSpec-Tany</td><td>HOR-272</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td>Voor pronucleaire micro-injectie buffer</td></tr><tr><td>SYBR safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Om banden in gel te detecteren</td></tr><tr><td>tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002000-120</td><td>Gids-RNA</td></tr></tbody></table>

verwijdering van een interne translationele startplaats van mrna met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte

Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein

Het CRISPR-Cas9 genbewerkingssysteem, gebaseerd op genoomherstelmechanismen, maakt het mogelijk om sneller en gemakkelijker gen-gemodificeerde muismodellen te genereren in vergelijking met traditionele homologe recombinatie. Het CRISPR-Cas9-systeem is vooral aantrekkelijk wanneer een single-point mutatie gewenst is. Het gap junction-eiwit, Connexin 43 (Cx43), wordt gecodeerd door gen Gja1, dat een enkel coderend exon heeft en niet kan worden gesplitst. Gja1 produceert echter niet alleen Cx43-eiwit over de volledige lengte, maar tot zes N-terminus afgeknotte isovormen door een proces dat bekend staat als interne translatie, het resultaat van ribosomale translatie-initiatie op interne AUG (Methionine) startplaatsen. GJA1-20k is de meest gegenereerde afgeknotte isovorm van Cx43 geïnitieerd bij het AUG-codon op positie 213 van Gja1 mRNA. Omdat residu 213 optreedt aan het einde van het laatste transmembraandomein van Cx43, is GJA1-20k effectief de 20 kDa C-terminusstaart van Cx43 als onafhankelijk eiwit. Eerdere onderzoekers identificeerden in cellen dat een cruciale rol van GJA1-20k is om de handel in Cx43 gap junction hemichannels over de volledige lengte naar het plasmamembraan te vergemakkelijken. Om dit fenomeen in vivo te onderzoeken, werd een mutante muis met een Gja1-puntmutatie gegenereerd die de ATG (Methionine) bij residu 213 vervangt door TTA (Leucine, M213L-mutatie). Het resultaat van M213L is dat Gja1 mRNA en full-length Cx43 nog steeds worden gegenereerd, maar de translatie van Gja1-20k is aanzienlijk verminderd. Dit rapport richt zich op het kiezen van de restrictie-enzymplaats om een één aminozuur gemuteerd (Gja1M213L / M213L) muismodel te ontwikkelen. Dit protocol beschrijft genetisch gemodificeerde muizen door het CRISPR-Cas9-systeem en snelle genotypering door pcr- en restrictie-enzymbehandelingen te combineren.

Het CRISPR/Cas9-genbewerkingssysteem produceert een ATG naar TTA-mutatie en een stille TCC naar TCG-mutatie bij 56.264.279 tot 56.264.281 en bij 56.264.291 tot 56.264.293 op muischromosoom 10, of bij respectievelijk 869 tot 871 en 881 tot 883 op Gja1 mRNA. Die mutatie resulteert in een methionine 213 tot Leucine (M213L) mutatie op GJA1 eiwit en de TTC naar TTG mutatie verstoort een nabijgelegen PAM-sequentie om ongewenste geneditie te voorkomen (figuur 1). De details van de mutatie zijn besc...

Het huidige protocol beschrijft een enkele M213L-mutatie in Gja1 die de connexin43-generatie over de volledige lengte behoudt, maar de vertaling van de kleinere GJA1-20k intern vertaalde isovorm voorkomt.

Verwijdering van een interne translationele startplaats van mRNA met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte

The CRISPR-Cas9 gene-editing system, based on genome repair mechanisms, enables the generation of gene-modified mouse models more quickly and easily ...

De moeilijkheid met een enkele residusubstitutie is om dieren efficiënt te genotyperen, ondanks het verschil in enkel residu. Speciaal gebruik van een restrictie-enzym voegt slechts een enkele, snelle en goedkope stap toe aan typische PCR-gebaseerde genotypering. Dit protocol kan worden toegepast op elk ander muismodel met een punt van mutatie als de doelsequentie wordt herkend door een restrictie-enzym, wat meestal het geval is.Knip één tot drie millimeter van de staartpunt met een schone schaar en breng deze over naar een 0,2 milliliter achtstrips PCR-buis. Nadat u het staartmonster hebt bevat zoals beschreven in het manuscript, bewaart u het bij T-minus 20 graden Celsius tot de extractie, tot ongeveer een week. Voeg 100 microliter weefsellysisoplossing per buis toe en meng goed, gevolgd door spin-down met behulp van een tafelmodel minicentrifuge op 2, 200 keer G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.Zorg ervoor dat de staartmonsters in de oplossing zijn ondergedompeld. Plaats de buizen op een thermische cycler die is ingesteld door de parameters voor weefsellysis, inactivatie en vasthouden te programmeren. Bewaar het weefsel lysaat bij vier graden Celsius gedurende maximaal een week als PCR niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd.Bereid een PCR-oplossing met vijf microliter nucleasevrij water, 0,75 microliter 10 micromolaire voorwaartse en omgekeerde primers en 7,5 microliter PCR-mastermix per monster in een nieuwe PCR-buis. Voeg één microliter van het eerder bereide weefsellysaat toe aan de PCR-oplossing. Meng de PCR-oplossing goed en draai met een tafelmodel minicentrifuge op 2, 200 maal G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur.Zet de buizen op een geprogrammeerde thermische cycler. Zodra de reactie is voltooid, bewaart u de PCR-producten bij vier graden Celsius gedurende één tot twee maanden of ongeveer een jaar bij min 20 graden Celsius. Bereid de enzymoplossing met zeven microliter nucleasevrij water, twee microliter CutSmart-buffer met een sterkte van 10X en één microliter NlaIII-restrictie-enzym.Als er meerdere monsters zijn, vermenigvuldigt u elke inhoud om het mengsel te maken en aliquot 10 microliter per buis. Voeg per buis 10 microliter PCR-product toe aan de enzymoplossing. Meng goed en draai naar beneden met de tafelmodel minicentrifuge zoals eerder gedemonstreerd.Plaats de buizen op een geprogrammeerde thermische cycler of warmteblok. Bewaar het product na incubatie onder koude omstandigheden. Voeg 0,75 gram agarose toe in 50 milliliter tae-buffer met enkele sterkte.Meng en verwarm de agarose in de magnetron totdat deze volledig is opgelost. Voeg na het afkoelen vijf microliter DNA-kleuring toe en meng voorzichtig. Giet 25 milliliter van de agarose gel in de gelvorm en laat de gel stollen.Laad 10 microliter verteerd PCR-product in de put. Laat de gel 35 minuten met 100 volt lopen. Stel je de agarose-gel voor onder ultraviolet licht.De agarose-elektroforese uitgevoerd met behulp van het verteerde PCR-product resulteerde in verschillende banden van verschillende grootte in elk genotype, met respectievelijk twee banden in wildtype, drie in heterozygoot en één in homozygoot. Testinjectie met blastocystanalyse resulteerde in een slagingspercentage van 76,9% bij het injecteren van 50 nanogram per microliter van de donor oligo's en een slagingspercentage van 25% bij het injecteren van respectievelijk 25 nanogram per microliter van dezelfde donor oligo's. Ten slotte werd door het injecteren van 50 nanogram per microliter van de donor oligo's met ethanolprecipitatie stichterdieren met een slagingspercentage van 50% verkregen.Zuivering van oligodonoren door ethanolprecipitatie verlaagde de toxiciteit met behoud van een hoge efficiëntie van het bewerken van het genoom. Zorgvuldige hantering en bij het toevoegen van een lage hoeveelheid reagentia is erg belangrijk. Zorg ervoor dat ze correct worden toegevoegd en goed worden gemengd.

removal-an-internal-translational-start-site-from-mrna-while

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische...

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Hier beschrijven we een methode om endoplasmatisch reticulum-geassocieerde mRNA in zoogdiercellen visualiseren weefselcultuurcellen. Deze techniek omvat het selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan met digitonine verwijderen cytoplasmatische inhoud gevolgd door...

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum gelokaliseerd mRNA&#39;s in zoogdiercellen

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Isolatie van mRNA&#39;s geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Toeprinting wil het vermogen meten van in vitro Getranscribeerd RNA naar formulier vertaling initiatie complexen met ribosomen onder een aantal voorwaarden. Dit protocol wordt een methode beschreven voor de toeprinting zoogdieren RNA en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de GLB-afhankelijke zowel IRES gestuurde vertaling.

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Directe levering van voorgemonteerde Cas9/gids RNA RiboNucleoProteïne-complexen is een snel en efficiënt middel voor genoom bewerking in hematopoietische cellen. Hier gebruiken we deze aanpak om een RUNX1 intronic geluiddemper te verwijderen en de transcriptionele responsen in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken.

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Leer een efficiënte PCR-gebaseerde genotyperingsmethode voor muismodellen met puntmutaties in het Gja1-gen. Deze protocol gebruikt restrictie-enzymen om genotype-identificatie snel en kosteneffectief uit te voeren.

Verwijdering van een interne translationele startplaats van mRNA met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte (Video) | JoVE Journal

Verwijdering van een interne translationele startplaats van mRNA met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte

Meer video's verkennen