Name: In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer hoe u gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie combineert met twee-fotonenfluorescentie voor labelvrije beeldvorming van het ruggenmerg bij levende muizen. Deze methode onthult celdynamica relevant voor neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Hong Kong Research Grants Council door middel van subsidies 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, de Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), het Area of Excellence Scheme van de University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) en de Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) door middel van subsidie RPC10EG33.

De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen concurrerende financiële belangen.

In dit protocol wordt de basisopstelling van de TPEF-SRS microscoop in detail beschreven. Voor SRS-beeldvorming zijn de pomp- en Stokes-stralen tijdelijk en ruimtelijk overlapt in de OPO. Deze overlapping kan echter worden verstoord na het passeren van het microscoopsysteem. Daarom is zowel ruimtelijke als temporele optimalisatie van de colocalisatie van de pomp en Stokes-balken noodzakelijk en cruciaal voor het bereiken van optimale SRS-beeldvorming. De temporele vertraging tussen de pomp en de Stokes-bundel is gerelate...

Raman microscopie1,2 is in opkomst als een krachtige labelvrije methode om biologische weefsels in beeld te brengen op basis van de karakteristieke frequenties van verschillende chemische bindingen in biomoleculen. Vanwege het niet-invasieve en goed adaptieve beeldvormingsvermogen is Raman-microscopie op grote schaal gebruikt voor het afbeelden van lipide-verrijkte componenten in biologische weefsels zoals myelineschede3,4,5, adipocyten6,7 en lipidedruppels8,9,10 . Gestimuleerd Raman-verstrooiingssignaal (SRS) verkregen als gestimuleerde Raman-versterking (SRG) of gestimuleerd Raman-verlies (SRL) is achtergrondvrij en vertoont perfecte spectrale gelijkenis met spontane Raman-verstrooiing11,12. Bovendien zijn SRL en SRG lineair afhankelijk van de analytconcentratie, waardoor kwantitatieve analyse van biochemische componenten mogelijk is9,11,13. Twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (TPEF) is veel gebruikt voor in vivo biologische beeldvorming vanwege het inherente optische sectioningvermogen, de diepe penetratiediepte en de lage fototoxiciteit14,15,16. De prestaties van TPEF-beeldvorming zijn echter afhankelijk van de kenmerken van fluorescerende tags en het aantal oplosbare kleuren is beperkt vanwege de breedbandfluorescentiespectraspray8,17,18,19. Labelvrije SRS-beeldvorming en op fluorescentie gebaseerde TPEF-beeldvorming zijn twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten en hun combinatie kan overvloedige biofysische en biochemische informatie van weefsels bieden. Deze twee beeldvormingsmodaliteiten zijn beide gebaseerd op de niet-lineaire optische (NLO) processen, die eenvoudige integratie in één microscoopsysteem mogelijk maken. De combinatie van de SRS- en TPEF-beeldvorming, de zogenaamde dual-modale beeldvorming, maakt hoogdimensionale beeldvorming en profilering van cellen en weefsels mogelijk, waardoor een uitgebreid begrip van complexe biologische systemen wordt vergemakkelijkt. In het bijzonder kan picoseconde (ps) SRS-microscopie chemische bindingsbeeldvorming bereiken met een hoge spectrale resolutie in vergelijking met femtoseconde (fs) SRS-techniek11, waardoor meerdere biochemische componenten in biologisch weefsel kunnen worden onderscheiden, vooral in het overvolle vingerafdrukgebied20,21. Bovendien, in vergelijking met een ander veelgebruikt dual-modaal NLO-microscoopsysteem met integratie van coherente anti-Stokes-verstrooiingsmicroscoop (CARS), vertoont SRS superieure prestaties ten opzichte van CARS in termen van spectrale en beeldinterpretatie en detectiegevoeligheid11. De SRS-TPEF microscoop is gebruikt als een krachtig hulpmiddel om verschillende biologische systemen te bestuderen, zoals Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kikkervis hersenen5, muizenbrein23,24, ruggenmerg25,26, perifere zenuw27 en vetweefsel7, enz.
Het ruggenmerg vormt samen met de hersenen het centrale zenuwstelsel (CZS). Het visualiseren van cellulaire activiteiten in het CZS in vivo onder fysiologische en pathologische omstandigheden is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van CZS-aandoeningen28,29,30 en voor het ontwikkelen van overeenkomstige therapieën31,32,33. Myelineschede, die axonen omwikkelt en isoleert voor snelle actiepotentiaalgeleiding, speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van het CZS. Demyelinisatie wordt gezien als een kenmerk bij wittestofstoornissen, zoals multiple sclerose34. Bovendien kan myeline-puin na ruggenmergletsel35 de activering van macrofagen moduleren, wat bijdraagt aan chronische ontsteking en secundair letsel36. Daarom is in vivo beeldvorming van myelineschede samen met neuronen en gliacellen in levende muismodellen van grote hulp om de dynamische processen bij CZS-aandoeningen te begrijpen.
In dit protocol worden de fundamentele installatieprocedures van een zelfgebouwde TPEF-SRS-microscoop beschreven en worden de dual-modale in vivo beeldvormingsmethoden voor het ruggenmerg van muizen geïntroduceerd.

<table><tbody><tr><td>#2 Forceps</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td>Voor laminectomie</td></tr><tr><td>10X objectief</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td><td></td></tr><tr><td>25X objectief</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP2</td><td></td></tr><tr><td>Brandcrème</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Sony</td><td>&alpha;6300</td><td></td></tr><tr><td>Stroomversterker</td><td>Stanford research</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>Huidige fotomultiplier modules</td><td>Hamamatsu</td><td>H11461-01</td><td></td></tr><tr><td>D2 665 nm lang-doorlaatdichroic spiegel</td><td>Semrock</td><td>FF665-Di02-25x36</td><td>Voor het richten van epi-fluorescentiesignaal naar de detectiemodule</td></tr><tr><td>D3 700 nm kort-doorlaatdichroic spiegel</td><td>Edmund</td><td>69-206</td><td>Voor het scheiden van SRS van TPEF detectiepad</td></tr><tr><td>Ontharingscrème</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FS1 975 nm kort-doorlaatfilter</td><td>Edmund</td><td>86-108</td><td>Voor het blokkeren van stokesstraal</td></tr><tr><td>FS1 Bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-850/310</td><td>Voor het blokkeren van stokesstraal</td></tr><tr><td>Fs2 Bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/50</td><td>Voor het selecteren van YFP-signaal</td></tr><tr><td>Fs2 Shortpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-715/SP-25</td><td>Voor het blokkeren van fs excitatielaserstraal</td></tr><tr><td>Halfgolfplaat</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td></td></tr><tr><td>Hogesnelheidsfotodetector</td><td>MenloSystems</td><td>FPD 310-F</td><td>Voor het controleren van stokesstraalmodulatie</td></tr><tr><td>Jodium</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR Scope</td><td>FJW</td><td>FIND-R-SCOPE Infraroodkijker 2X Kit Model 84499C2X</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CPA1</td><td></td></tr><tr><td>L1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L10</td><td>Thorlabs</td><td>LA4052-A</td><td></td></tr><tr><td>L2</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-B</td><td></td></tr><tr><td>L3</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B</td><td></td></tr><tr><td>L4</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>L7</td><td></td><td></td><td>f=100 mm, AB coating</td></tr><tr><td>L8</td><td>Thorlabs</td><td>LA4874-A</td><td></td></tr><tr><td>L9</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Lock-in versterker</td><td>APE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde flipper</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td><td></td></tr><tr><td>Multifunctionele aanschafkaart</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscoop</td><td>Tektronix</td><td>TDS2012C</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiode</td><td>APE</td><td></td><td>Voor het detecteren van SRS-signaal</td></tr><tr><td>Picoseconde laserbron</td><td>APE</td><td>picoEmerald</td><td></td></tr><tr><td>Polrisatie straalparator</td><td>Thorlabs</td><td>CCM1-PBS252/M</td><td></td></tr><tr><td>Vermogen meter</td><td>Newport</td><td>843-R</td><td></td></tr><tr><td>Zoutoplossing</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanlens L5</td><td>Thorlabs</td><td>SL50-CLS2</td><td></td></tr><tr><td>Scannende spiegel</td><td>Cambridge Technology</td><td>6215H</td><td></td></tr><tr><td>Siliconengel</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Ti:saffier fs laser</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Ultra II</td><td></td></tr><tr><td>Buislens L6</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200-S8</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde raman-verstrooiingsmicroscopie

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) maakt labelvrije beeldvorming van de biologische weefsels in zijn natuurlijke micro-omgeving mogelijk op basis van intrinsieke moleculaire trillingen, waardoor een perfect hulpmiddel wordt geboden voor in vivo studie van biologische processen met subcellulaire resolutie. Door twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) beeldvorming in de SRS-microscoop te integreren, kan de dual-modale in vivo beeldvorming van weefsels kritische biochemische en biofysische informatie vanuit meerdere perspectieven verkrijgen die helpt bij het begrijpen van de dynamische processen die betrokken zijn bij cellulair metabolisme, immuunrespons en weefselremodellering, enz. In dit videoprotocol wordt de opstelling van een TPEF-SRS microscoopsysteem en de in vivo beeldvormingsmethode van het dierlijke ruggenmerg geïntroduceerd. Het ruggenmerg, als onderdeel van het centrale zenuwstelsel, speelt een cruciale rol in de communicatie tussen de hersenen en het perifere zenuwstelsel. Myelineschede, overvloedig aanwezig in fosfolipiden, omringt en isoleert het axon om zoute geleiding van actiepotentialen mogelijk te maken. In vivo beeldvorming van myelinescheden in het ruggenmerg is belangrijk om de progressie van neurodegeneratieve ziekten en dwarslaesie te bestuderen. Het protocol beschrijft ook dierbereiding en in vivo TPEF-SRS-beeldvormingsmethoden om biologische beelden met hoge resolutie te verkrijgen.

In vivo dual-modale beeldvorming van spinale axonen en myelinescheden wordt uitgevoerd met behulp van de Thy1-YFPH transgene muizen, die EYFP tot expressie brengen in dorsale wortel ganglion afferente neuronen (figuur 3). Deze gelabelde afferente neuronen geven de sensorische informatie van de perifere zenuw door aan het ruggenmerg, met de centrale tak in de dorsale kolom van het ruggenmerg. Met de TPEF-SRS-microscoop kan een dicht verdeelde myelineschede duidelijk worden gevisualis...

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

In Vivo beeldvorming van biologische weefsels met subcellulaire resolutie en chemische specificiteit is een krachtig hulpmiddel om de dynamische processen te begrijpen die betrokken zijn bij cellulair metabolisme, immuunrespons en weefselremodellering. Met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kan kritische biochemische en biofysische informatie van biologische weefsels vanuit meerdere perspectieven met subcellulaire resolutie worden verkregen. In het bijzonder kan deze dual-modale microscopie worden gebruikt om cellulaire dynamiek en interacties in het ruggenmerg van muizen in beeld te brengen om de progressie van neurodegeneratieve ziekten en dwarslaesie te bestuderen.Schakel om te beginnen de titanium saffierlaser in door de toetsschakelaar van de stand-by naar de aan-positie te schakelen en wacht 30 minuten totdat de laser is opgewarmd. Schakel vervolgens de OPO in door op de startknop op het OPO-bedieningspaneel te klikken en wacht 20 minuten tot de laser is opgewarmd. Nadat de picosecondelaser is opgewarmd, controleert u de modulatiediepte van de Stokes-straal door het vermogen van de Stokes-straal te verlagen tot ongeveer 20 milliwatt, de lasersluiter voor de Stokes-straal te openen en een snelle fotodetector op de OPO-uitgang te plaatsen om de straal te detecteren.Sluit vervolgens de uitvoerpoort van de fotodetector aan op de ingangspoort van een oscilloscoop met behulp van een coaxiale kabel met een BNC-connector om de laserpuls te bewaken. Open vervolgens het EOM-besturingsvenster in de OPO-besturingssoftware en pas het EOM-vermogen en de fase aan volgens het pulsintensiteitsdiagram dat op de oscilloscoop wordt weergegeven om een maximale modulatiediepte van 20 megahertz te bereiken. Open in de OPO-besturingssoftware de lasersluiter van de pomp terwijl u de Stokes-uitgang stopt.Klik vervolgens op het instelsignaalhuis om de golflengte van de pompbundel in te stellen op 796 nanometer, klik vervolgens op de OPO-voedingsbox instellen en voer 20 in om het vermogen in te stellen op het minimum voor optische uitlijning. Plaats vervolgens uitlijnplaat P1 achter de polariserende bundelsplitser op ongeveer 10 centimeter en plaats plaat P2 achter P1 op ongeveer 30 centimeter op het optische pad. Na het openen van de microscoopsluiter voor de picoseconde laserstraal, past u de spiegel M1 aan om het picoseconde laserstraalcentrum in het doorgaande gat van P1 te lokaliseren. Gebruik een infraroodkijker om de positie van de bundelvlek op P1 te observeren bij het afstellen van de spiegel M1. Pas op dezelfde manier de spiegel M2 aan om het picoseconde laserstraalcentrum in het doorgaande gat van P2 te lokaliseren. Gebruik de infraroodkijker om de positie van de bundelspot op P2 te observeren bij het afstellen van de spiegel M2. Na het afstellen van de spiegels totdat het picoseconde bundelcentrum zich in het doorgaande gat van beide uitlijningsplaten bevindt, sluit u de sluiter van de picosecondebundel in de microscoopbesturingssoftware.Open vervolgens de microscoopsluiter voor de femtoseconde laserstraal. Pas de spiegel M3 aan om het femtoseconde laserstraalspotcentrum in het doorgaande gat van P1 te lokaliseren en pas vervolgens spiegel M4 aan om het femtoseconde laserstraalspotcentrum in het doorgaande gat van P2 te lokaliseren. Nadat u de spiegels hebt afgesteld totdat het femtoseconde laserstraalcentrum zich in de doorgaande gaten van de twee uitlijningsplaten bevindt, sluit u de microscoopsluiter voor de femtosecondestraal. Plaats vervolgens een camera op de positie van het objectief om de locatie van de twee bundelspots te visualiseren en markeer de positie van de pompstraal op het camerascherm als referentie.Plaats vervolgens een uitlijningsplaat P0 voor de lens L3 en pas de optische spiegel aan met een inbussleutel, zodat het Stokes-straalcentrum het doorgaande gat van de uitlijningsplaat bij de laseruitgangspoort passeert. Gebruik de infraroodkijker om de positie van de bundelvlek op P0 te bevestigen tijdens de aanpassing. Verwijder vervolgens de uitlijningsplaat P0 en gebruik de inbussleutel om de optische spiegel twee aan te passen, zodat het midden van de Stokes-bundel co-lokaliseert met het referentiemerk van de pompstraal op de camera.Blijf de spiegels afstellen totdat de Stokes-straal strikt overlapt met de pompstraal op zowel P0- als de cameravlakken. Open de lock-in versterkerbesturingssoftware en stel de golflengte van de pomplaser in op 796 nanometer en het vermogen van de pomp en Stokes-straal op 50 en 70 milliwatt, wat overeenkomt met respectievelijk 15 en 25 milliwatt op het monster. Gebruik dan olijfolie voor lock-in versterker fase optimalisatie.De olijfolie is verzegeld in een dia met tissuepapier aan de onderkant om de signaalverstrooiing of EPI-SRS-detectie te verbeteren. Plaats het olijfoliemonster op het podium en pas de focus van het 25X-objectief aan op het monster. Stel met behulp van de microscoopbesturingssoftware de beeldvormingsparameters in zoals vermeld in het tekstmanuscript.Stel vervolgens met behulp van de lock-in versterkerbesturingssoftware de tijdconstante waarde in op 10 microseconden. Scan vervolgens de laserstraal over het monster en stem de fase af met een stapgrootte van 22,5 graden totdat de SRS-signaalintensiteit het maximum bereikt. Scan vervolgens het monster met de lasersluiter gesloten en stem de offsetwaarde af met een stapgrootte van één millivolt totdat het gemiddelde SRS-signaal dicht bij nul is.Open vervolgens het dialoogvenster vertragingsmanager in de OPO-besturingssoftware en scan de olijfolie, waarbij u de vertragingsfase afstemt totdat het SRS-signaal van de olijfolie zijn maximum bereikt. Stop vervolgens met scannen en klik op de knop Gegevens toevoegen in het dialoogvenster vertragingsbeheer om de huidige vertragingsgegevens vast te leggen. Na het op dezelfde manier verkrijgen van vertragingsgegevens bij verschillende Raman-verschuivingen door verschillende chemische monsters in beeld te brengen, selecteert u de gegevens in volgorde vijf in het dialoogvenster vertragingsmanager om de huidige gegevenspunten te passen met de polynomische functie van de vijfde orde.Pas vervolgens de aangepaste gegevens toe door op de knop Gebruiken als aangepast te klikken en het selectievakje aan te vinken. De vertragingsfase wordt automatisch aangepast op verschillende golflengten volgens de aangepaste vertragingscurve. Voor in vivo beeldvorming fixeert u de muis op het stabilisatiestadium met het ruggenmerg blootgelegd en ondergedompeld in zoutoplossing.Monteer nu de stabilisatietrap op een vijfassige trap onder de TPEF-SRS-microscoop. Bevestig vervolgens de muiskop met twee hoofdstangen en laat de houderplaat zakken om voldoende ruimte te bieden voor borstbewegingen tijdens de ademhaling, waardoor bewegingsartefacten worden verlicht. Pas vervolgens de Z-translationele fase aan om de focus af te stemmen totdat het Brightfield-beeld van de vasculatuur van het ruggenmerg kan worden waargenomen onder een 10X-objectief.Lokaliseer de ruggenmergader in het midden van het gezichtsveld door de tweeassige translationele fase van de vijfassige fase af te stemmen. Stem vervolgens de rol- en pitchhoeken van de vijfassige trap af om het ruggenmerg dorsale oppervlak loodrecht op de objectieve as aan te passen op basis van de Brightfield-afbeelding. Vervang vervolgens de 10X door een 25X waterdompelingsobjectief voor TPEF-SRS-beeldvorming.Voor SRS-beeldvorming selecteert u de polariserende bundelsplitser boven het objectief door op de schakelknop te drukken die is aangesloten op de gemotoriseerde flipper. Voor TPEF-beeldvorming selecteert u de dichroïsche spiegel D2 boven het objectief door op de schakelknop te drukken die is aangesloten op de gemotoriseerde flipper. Stel ten slotte de beeldvormingsparameters in zoals beschreven in het tekstmanuscript en begin met het scannen van het monster.In vivo dual-modale beeldvorming van schaars gelabelde YFP-axonen en myelineschechten in het ruggenmerg van de muis onthulde dat de axonen nauw omwikkeld zijn door een dikke laag myelinescheden. Zoals te zien is in de TPEF-SRS-ruggenmergafbeelding, hebben de knopen van Ranvier een verminderde axonale diameter en wordt het axilemma direct blootgesteld aan de extracellulaire matrix. In combinatie met nieuwe sondes voor fluorescentie en SRS-beeldvorming van twee-foton geëxciteerde fluorescentie kan SRS-microscopie gelijktijdige structurele en functionele beeldvorming van verschillende biomoleculen bereiken, waardoor ons begrip van complexe biologische processen wordt vergemakkelijkt.

in-vivo-imaging-biological-tissues-with-combined-two-photon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Espinoza, R., et al. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (2022). The video demonstrates two-color stimulated Raman scattering (SRS) imaging of mouse brain tissue sections. Two synchronized laser beams are directed onto the tissue section to excite molecular vibrations, resulting in a relative intensity change in the beams. Lipids and proteins in the tissue are detected using distinct frequency pairs of the laser...

Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain Tissue

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).

Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in...

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.

Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Leer hoe u gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie combineert met twee-fotonenfluorescentie voor labelvrije beeldvorming van het ruggenmerg bij levende muizen. Deze methode onthult celdynamica relevant voor neurodegeneratieve ziekten.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (Video) | JoVE Journal

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Meer video's verkennen