Gemeenschapswetenschappers inzetten om niet-destructieve genetische bemonstering van zeldzame vlinderpopulaties uit te voeren

Dit protocol maakt gebruik van een nieuwe benadering van het bemonsteren van het chorion van uitgekomen vlinder ovi voor genetische analyse. Het kan met name nuttig zijn wanneer andere weefselbemonsteringstechnieken onpraktisch, niet beschikbaar of niet toegestaan zijn. Dit protocol heeft relatief lage totale kosten met behulp van gemakkelijk te verkrijgen voorraden en richt zich op resterend organisch materiaal dat de noodzaak elimineert om tijdelijk levende organismen te vangen of te manipuleren en mogelijk te schaden om genetische monsters te verkrijgen.

Het algemene protocol is eenvoudig en gemakkelijk te leren, maar vereist behendigheid en strikte aandacht voor detail, met name om zeer kleine doelmonsters met succes te lokaliseren, identificeren en verwijderen om kruisbesmetting tussen monsterverzamelingsgebeurtenissen te voorkomen. Begin met het zorgvuldig bekijken en verzamelen van de volledige lijst met benodigde collectiegerelateerde benodigdheden. Als monsterverzameling plaatsvindt op meerdere locaties of door meerdere personen of teams, verzamel en organiseer dan alle benodigde benodigdheden in afzonderlijke inzetbare eenheden.

Transportbenodigdheden naar gemeenschapswetenschappers of ander personeel dat verantwoordelijk is voor het verzamelen van velden. Als het personeel niet lokaal is, verpak dan zorgvuldig benodigdheden in een aparte kartonnen verzenddoos met een compleet verzendlabel en verzend ze. Na ontvangst van verzamelbenodigdheden, inclusief de verzameldoos, bekijkt u zorgvuldig de gelamineerde voorraadlijst en voert u een volledige inventaris uit.

Breng de projectleider op de hoogte als er voorraden ontbreken. Voorvul 1,5 milliliter microcentrifugebuizen met 180 microliter lysisbuffer. Breng een voorbedrukt uniek ID-label aan op elke microcentrifugebuis en plaats alle buizen in de 64-wells microcentrifugebuisopslagdoos.

Zet het deksel stevig vast na het laden. Zorg ervoor dat alle digitale apparatuur volledig is opgeladen en dat eventuele reservebatterijen zijn ingepakt. Vul een kleine koeler gedeeltelijk met ijs voor veldopslag en lokaal transport van de verzamelde monsters.

Verpak alle verzamelbenodigdheden in de verzameldoos of soortgelijke stevige weerbestendige container voor veilig transport en geconsolideerde opslag. Bekijk het niet-destructieve protocol voor het verzamelen van genetische monsters en details voordat u het veld ingaat. Gebruik bij aankomst op de veldlocatie een potlood of een all weather-pen om het tijdstip van de dag, de datum, de algemene naam van de accommodatie, de naam of beschrijving van de specifieke locatie van de veldlocatie, de GPS-lezing indien beschikbaar en de volledige naam en rollen van alle personen in het weerbestendige veldnotitieblok vast te leggen.

Zoek een geschikte habitat voor de aanwezigheid van een larvale waardplant voor de soortspecifieke doelvlinder. Maak met behulp van een smartphone of camera gedetailleerde foto's van alle veldlocaties, monsterverzamelingslocaties, waardplanten en andere relevante informatie. Gebruik smartphones of andere camera's die GPS-coördinaten registreren.

Doorzoek uitgebreid alle larvale gastheerplantdelen zoals bladeren, bloemknoppen, bloemen of zich ontwikkelende vruchten waarvan bekend is dat ze worden geselecteerd door volwassen vrouwelijke vlinders die eicellen poseren voor uitgekomen eieren. Zoek voor de meeste Lycaenidae naar witte uitgekomen eieren met een duidelijk gat in het midden dat lijkt op een donut waaruit de pasgeboren larve is voortgekomen. Zoek naar niet-gehate eieren die donkerder van kleur zijn, vaak groen of blauwachtig, en volledig intact zijn zonder een gat in het midden.

Zodra een uitgekomen ei is gevonden, draagt u nitrilhandschoenen. Pak met behulp van een steriele en puntige tang het uitgekomen ei voorzichtig van de waardplant en plaats het rechtstreeks in een gelabelde microcentrifugebuis die vooraf is gevuld met lysisbuffer. Op dezelfde manier kunnen andere weefselmonsters worden gebruikt en verwerkt.

Zorg ervoor dat al het verzamelde materiaal volledig is ondergedompeld in de lysisbuffer in elke microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Tik op de bodem van de buis op een hard oppervlak om eventuele monsters indien nodig opnieuw onder te dompelen. Gooi bij het verzamelen van een nieuw monster gebruikte nitrilhandschoenen weg en vervang ze door een schoon paar.

Maak na elke eierverzameling de tangpunten zorgvuldig schoon door ze in een injectieflacon met 95% ethanol uit een knijpfles te dopen of te dopen of door alcoholdoekjes te gebruiken. Verzamel ten minste vijf monsters per gastheerplant per locatie, elk monster bevat één tot 20 eieren, met als doel meer dan 50 eieren in totaal op een locatie, indien beschikbaar. Verzamel één tot 20 uitgekomen eieren van meerdere planten in dezelfde gastheerpleister in een enkele microcentrifugebuis en sluit het deksel stevig.

Voor vlindersoorten die grotere kruidachtige of houtachtige gastheersoorten gebruiken, verzamel meerdere eieren van verschillende locaties op dezelfde plant als gastheerplekken beperkt zijn. Noteer in het weerbestendige veldnotitieblok het toegewezen unieke ID-label samen met het type monster, het geschatte aantal uitgekomen eieren en verzamelinformatie. Plaats de gesloten microcentrifugebuis met eirestenmonster terug in de 64-wells microcentrifuge-opslagdoos.

Onderhoud de opbergdoos in een koeler met ijs terwijl u in het veld bent. Plaats alle andere verzamelbenodigdheden in de verzamelbox voor veilige en geconsolideerde opslag en transport tussen locaties. Van deze 160 monsters werd met succes DNA geëxtraheerd uit 88 met een gemiddelde concentratie van 1,67 nanogram per microliter en de hoogste DNA-opbrengst was 26,8 nanogram per microliter.

DNA-concentraties per weefseltype bevestigden dat de monsters met een enkel eideksel slechts één eierdoos hadden en monsters met meerdere eierdozen ten minste twee gevallen hadden met het aantal gevallen variërend van twee tot 20, gemiddeld tot 5,3 per monster. Materialen voor het verzamelen van maximaal 563 monsters werden verzonden naar acht natuurbeschermings- en gemeenschapswetenschappers uit negen staten in het soortengebied in Oost-Noord-Amerika. Materialen werden in 2021 gedurende drie maanden verzonden voorafgaand aan lokale piekvluchttijden.

In totaal zijn 160 Calephelis irisweefselmonsters ontvangen. Het is van cruciaal belang om kruisbesmetting tussen de monsters te minimaliseren, ervoor te zorgen dat het verzamelde monster volledig wordt ondergedompeld in de lysisbuffer en het unieke ID-label en de verzamelgegevens voor elk monster nauwkeurig vast te leggen. Dit protocol maakte een brede inzet en gebruik door gemeenschapswetenschappers mogelijk om niet-destructief bestaande populaties van een zeldzame vlinder te bemonsteren om een brede genetische structuuranalyse uit te voeren.