Name: Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Leer micro-CT-scanning voor parasitaire plant-gastheer interacties met vacuümperfusie. Deze methode verbetert weefselcontrast en visualiseert haustoria en vaatverbindingen driedimensionaal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ik wil dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brazilië) en Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, VS) bedanken voor hun belangrijkste hulp en onmisbare gebruikerstraining voor verschillende microtomografiesystemen en data-analysesoftware. Ik dank ook het personeel van de EEB Greenhouse aan de Universiteit van Connecticut (VS), in het bijzonder Clinton Morse en Matthew Opel voor het leveren van de exemplaren van Viscum minimum. Dr. John Wenzel bood de gelegenheid en grote hulp voor het bemonsteren van Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao en Talitha Motta hebben enorm geholpen met de bemonstering van Scybalium fungiforme. MSc. Ariadne Furtado, en Drs. Fernanda Oliveira en Maria Aline Neves leverden de referentie voor het gebruik van phloxine B voor de analyse van endofytische schimmels. Video-opnames aan de Vrije Universiteit Brussel werden mogelijk gemaakt door de hulp van Dr. Philippe Claeys, Dr. Christophe Snoeck, MSc. Jake Griffith, Dr. Barabara Veselka en Dr. Harry Olde Venterink. De financiering werd verstrekt door de Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brazilië) en de Harvard University Herbaria (VS).

1. Selectie van parasitaire plantenmonsters
<ol><li>Verzamel het volledige parasitaire plantenhaustorium, inclusief de aangehechte gastheerstam / wortel en segmenten van zowel proximale als distale uiteinden van het geparasiteerde gastheerorgaan; De ideale lengte van elk segment is gelijk aan het dubbele van de diameter van het Haustorium. OPMERKING: Neem voor laterale haustoria een deel van de parasietmoederstam/-wortel op waaruit het haustorium is gevormd (figuur 1A,B,D). Verzamel voor endoparasieten een segment van de gastheerstam/wortel waarin tekenen van de parasiet zichtbaar zijn (figuur 1B). In het geval van aansluitklemmen moet de hele installatie worden verzameld (figuur 1E).</li>
	<li>Dompel het hele monster onder in een fixatieve oplossing (bv. FAA) in een volumetrische verhouding van 1:10 (monster: fixatief). Laat de monsters ten minste 1 dag in fixatief staan, afhankelijk van de grootte van het monster27. OPMERKING: Monsters kunnen voor het scannen in fixatief worden opgeslagen of worden overgebracht naar een conserveringsoplossing (bijv. ethanol 70%). Verse monsters kunnen ook worden gebruikt als de daaropvolgende anatomische analyse niet gerechtvaardigd is (zie het gedeelte Discussie). Als u met vers materiaal werkt, stelt u het apparaat in voor perfusie van de contrastoplossing en verzamelt u vervolgens het monster. Het monster mag niet uitdrogen.</li>
</ol>2. Toepassing van contrasterende oplossingen
<ol><li>Kies de toepassingsmethode die u wilt gebruiken. Gebruik de vacuümmethode (stap 2.3) voor kleine (figuur 1A) of niet-houtachtige (figuur 1B) monsters. Gebruik de perfusiemethode voor grotere monsters, op voorwaarde dat deze een segment van de gastheerstam/wortel bevat (figuur 1A,C-E).</li>
	<li>Draag rubberen handschoenen en andere geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. laboratoriumjas) bij het manipuleren van het monster, ongeacht de aanpak die in de volgende stappen is gekozen. LET OP: Alle contrasterende oplossingen bevatten zware metaalzouten in hun samenstelling en mogen daarom niet worden gehanteerd zonder adequate persoonlijke beschermingsmiddelen en onder een zuurkast.</li>
	<li>Volg voor de vacuümmethode de onderstaande stappen.<ol><li>Kies een geschikte injectieflacon en label deze. De injectieflacon moet groot genoeg zijn om plaats te bieden aan het monster en de contrasterende oplossing, meestal in een verhouding van 1:10. Controleer de instructies van de fabrikant om ervoor te zorgen dat de injectieflacon bestand is tegen een laag tot matig vacuüm. OPMERKING: Vul de injectieflacon niet tot de rand, omdat de negatieve druk (vacuüm) ervoor kan zorgen dat de vloeistof morst.</li>
		<li>Plaats het monster in de injectieflacon met de contrasterende oplossing (1% jodium of 3% fosfotungstaat, zie tabel met materialen). Plaats de injectieflacon vervolgens in een vacuümkamer of exsiccator die is aangesloten op een vacuümpomp. Verwijder het deksel van de injectieflacon en sluit vervolgens de vacuümkamer of exsiccator.</li>
		<li>Controleer of er geen scheuren in de vacuümkamer/exsiccator zitten en of de vacuümpomp voldoende olie bevat.</li>
		<li>Sluit de uitlaatklep van de pomp om te voorkomen dat lucht afsluit en open de uitlaatklep van de kamer/exsiccator om de lucht naar buiten te persen.</li>
		<li>Zet de pomp aan en wacht tot de druk ongeveer 20" Hg bereikt. LET OP: Dit proces is meestal snel, dus laat het vacuümsysteem niet onbeheerd achter. OPMERKING: Hoewel de metrische systeemeenheid voor druk Pascal (Pa) is, geven manometers in de meeste laboratoriumvacuümpompen de druk weer in inches kwik ("Hg), pond per vierkante inch (psi) of staven. 20" Hg is gelijk aan ca. 67,7 Pa, 10 psi of 0,7 bar.</li>
		<li>Sluit de uitlaatklep van de kamer/exsiccator om te voorkomen dat er weer lucht binnenkomt en schakel de pomp snel uit.</li>
		<li>Laat het monster ten minste 2 uur onder vacuüm staan; grotere monsters hebben langer nodig om de contrasterende oplossing te laten doordringen.</li>
		<li>Verwijder na de gewenste periode het monster uit de contrasterende oplossing om het voor te bereiden op het scannen.</li>
		<li>Open langzaam de uitlaatklep van de kamer/exsiccator om er lucht in te laten.</li>
		<li>Wacht tot de druk in de kamer/exsiccator volledig is uitgeput (d.w.z. de manometer bereikt bijna 0) en open deze vervolgens voorzichtig om het monster op te halen.</li>
		<li>Gooi de contrasterende oplossing op de juiste manier weg en bewaar het monster ter voorbereiding op het scannen.</li>
	</ol></li>
	<li>Volg voor de perfusiemethode de onderstaande stappen.<ol><li>Selecteer een toevoertank voor de contrasterende oplossing op basis van de grootte van het monster. Gebruik een spuit van 50 ml (zonder naald of zuiger) voor kleine monsters (figuur 2A) of een intraveneuze medische kit van 1 l voor grote monsters (figuur 2B).</li>
		<li>Sluit het ene uiteinde van een transparante plastic buis (zie materiaaltabel) aan op de toevoertank en sluit het andere uiteinde vervolgens aan op een tweeweg- of driewegklep. Sluit een tweede slang aan op een andere uitlaat in de klep (figuur 2A,B).</li>
		<li>Bevestig de toevoertank op een verhoogde positie zonder het apparaat dat in de vorige stap is ingesteld, te demonteren. OPMERKING: De verticale afstand tussen de tank en het monster bepaalt de perfusiedruk van de oplossing (figuur 2B). Een afstand van 20-50 cm is voldoende voor kleine monsters. Voor grote monsters is een afstand van 1 m adequater.</li>
		<li>Sluit de driewegklep (figuur 2C) of tweewegklep (figuur 2D) om te voorkomen dat vloeistof het slangsysteem verlaat en giet vervolgens de contrasterende oplossing in de toevoertank. Als u een intraveneuze medische kit gebruikt, vult u de zak met de oplossing en sluit u de klep voordat u het apparaat op een verhoogde positie vastzet.</li>
		<li>Zorg ervoor dat er geen grote luchtbellen worden gevormd langs het buizensysteem (figuur 2E). Laat indien nodig de contrastoplossing uit de buis stromen totdat de bel is verwijderd. Sluit de klep weer en laat het apparaat op zijn plaats.</li>
		<li>Om het monster voor te bereiden op perfusie van de contrastoplossing, houdt u het ondergedompeld in vloeistof (water, ethanol of fixeermiddel) en snijdt u de punt van het proximale uiteinde van de gastheerstam/-wortel in het monster af (figuur 2F).</li>
		<li>Verwijder het monster uit de vloeistof waarin het is opgeslagen en wikkel het in een paraffinefilm om uitdroging te voorkomen. Houd het monster in de buurt en klaar om op het apparaat te worden aangesloten.</li>
		<li>Open de klep voorzichtig om de contrasterende oplossing langzaam te laten stromen en vul de plastic slang die op de tank is aangesloten terwijl u het open uiteinde van het systeem op een iets verhoogde positie houdt om te voorkomen dat de contrasterende oplossing morst. Nogmaals, zorg ervoor dat er geen grote luchtbellen langs de buis ontstaan.</li>
		<li>Verbind het proximale uiteinde van de gastheerstam/wortel in het monster met het open uiteinde van het buizensysteem (figuur 2B, vergroot gebied). Vermijd het introduceren van luchtbellen in het systeem tijdens deze stap. Koppel indien nodig het monster los van het apparaat en verwijder luchtbellen uit het systeem door de oplossing te laten stromen.</li>
		<li>Terwijl u het monster verbonden houdt met het apparaat, plaatst u het in een container om lekkage van de contrasterende oplossing in het gebied waar het experiment is opgezet te voorkomen. Gebruik buizen van verschillende diameters, plastic ritssluitingen en klepadapters (figuur 2G) om ervoor te zorgen dat alle verbindingen in het apparaat goed passen, geschikt zijn voor gastheertakken van verschillende groottes en dat de oplossing niet uit het buizensysteem lekt (figuur 2B, vergroot gebied).</li>
		<li>Laat de oplossing het monster gedurende ten minste 2 uur doordrenken, of totdat de oplossing zich in de container ophoopt.</li>
		<li>Sluit de klep en koppel het monster voorzichtig los van het apparaat. Giet de rest van de oplossing af in de container en gooi deze op de juiste manier weg.</li>
		<li>Verwijder de paraffinefilm uit het monster ter voorbereiding op het scannen.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63423/63423fig02.jpg"> Figuur 2: Perfusiebenadering voor contrasttoepassing. Kleine (A) en grote (B) versies van het perfusieapparaat omvatten een toevoertank (st) en twee plastic buizen (t1 en t2) verbonden door een klep (va). Het proximale uiteinde van de gastheerstam (H) met een parasiet (P) die eraan is bevestigd via het haustorium (ha) is verbonden met het open uiteinde van het systeem (B, uitgebreid). Een drieweg (C) of een tweeweg (D) klep wordt gebruikt om de vorming van luchtbellen in het buizensysteem te helpen voorkomen, die de doorgang van contrasterende oplossing (E) blokkeren. De punt van het proximale uiteinde van de gastheerstengel (H) wordt onder water gesneden om de contrastoplossing (F) te kunnen passeren. Ritssluitingen, klepadapters en slangen van verschillende diameters helpen nauwere verbindingen te beveiligen en lekkage in het systeem te voorkomen (G). Figuren 2B, D en F zijn gemaakt met BioRender. Schaalstaven = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63423/63423fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
3. Monstervoorbereiding en montage
<ol><li>Was het monster door het gedurende 2 minuten onder te dompelen in water. LET OP: Was geen monsters in de gootsteen, omdat alle contrasterende oplossingen zware metaalzouten in hun samenstelling bevatten. Beschouw het water dat wordt gebruikt voor het wassen als een verdunde contrasterende oplossing en gooi het op de juiste manier weg.</li>
	<li>Plaats het monster in een papieren handdoek bij kamertemperatuur om overtollig water gedurende 2-5 minuten te laten verdampen, afhankelijk van de grootte van het monster. U kunt het monster ook lichtjes drogen met behulp van een papieren handdoek. Laat het monster niet volledig uitdrogen.</li>
	<li>Wikkel het monster in een paraffinefilm door het uit te rekken tot een dunne laag. Vouw de paraffinefilm niet bovenop het monster.</li>
	<li>Monteer het ingepakte monster op een monsterhouder, zodat het stabiel en op zijn plaats blijft terwijl het tijdens het scannen draait. Gebruik plakband, schuim met lage dichtheid, pipetpunten en/of doorzichtige plastic containers om het monster op zijn plaats te houden.</li>
	<li>Scan het monster en analyseer de beelden volgens specifieke protocollen en richtlijnen die zijn vastgesteld voor het beschikbare micro-CT-systeem.</li>
</ol>

<ol><li>Stock, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SR+%22Microcomputed+tomography%3A+Methodology+and+applications%22">Microcomputed tomography: Methodology and applications</a>. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).</li>
<li>Hounsfield, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computerized+transverse+axial+scanning+%28tomography%29%3A+I.+Description+of+system%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system.</a> British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).</li>
<li>Dutilleul, P., Lafond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Branching+and+rooting+out+with+a+CT+Scanner%3A+The+why%2C+the+how%2C+and+the+outcomes%2C+present+and+possibly+future+pierre%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre.</a> Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+X-ray+microtomography%3A+Imaging+micro-+anatomy%2C+molecular+expression+and+organismal+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity.</a> Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).</li>
<li>Sakdinawat, A., Attwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+X-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Nanoscale X-ray imaging.</a> Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).</li>
<li>Walton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterisation+of+unstained+and+intact+tissue+micro-architecture+by+X-ray+computed+micro-+and+nano-tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography.</a> Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).</li>
<li>Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+and+analyses+in+the+ct+scanning+of+root+systems+and+leaf+canopies%3A+A+timely+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).</li>
<li>Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tissues+in+3D+via+X-Ray+Tomography%3A+Simple+contrasting+methods+allow+high+resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging.</a> PLoS ONE. 8 (9), 75295(2013).</li>
<li>Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+imaging+of+plant+roots+in+situ+with+X-ray+Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography.</a> Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).</li>
<li>Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+structure+visualization+by+high-resolution+X-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography.</a> Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).</li>
<li>McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+resolution+computed+tomography+to+visualize+the+three+dimensional+structure+and+function+of+plant+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).</li>
<li>Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography+%28micro-CT%29%3A+A+reference+technology+for+high-resolution+quantification+of+xylem+embolism+in+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees.</a> Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).</li>
<li>Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+roots+of+lianas%3A+A+case+study+in+Sapindaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae.</a> Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).</li>
<li>da Cunha Neto, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+distribution%2C+development%2C+and+evolution+of+medullary+bundles+in+Nyctaginaceae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae.</a> American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).</li>
<li>Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+3D+structure+of+the+graft+union+of+grapevine+using+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography.</a> Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).</li>
<li>Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+computed+tomography+uncovers+root-root+interactions%3A+Quantifying+spatial+relationships+between+interacting+root+systems+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).</li>
<li>Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+microtomography+analysis+with+traditional+anatomy+for+a+3D+understanding+of+the+host-parasite+interface+-+Phoradendron+spp.+Case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1340(2016).</li>
<li>Lusic, H., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-computed+tomography+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">X-ray-computed tomography contrast agents.</a> Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).</li>
<li>Těšitel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+biology+of+parasitic+plants%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Functional biology of parasitic plants: a review.</a> Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).</li>
<li>Teixeira-Costa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+bridge+between+two+enemies%3A+Haustorium+structure+and+evolution+across+parasitic+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Botanica%22%5BJournal%5D)">A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants.</a> Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).</li>
<li>Kuijt, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuijt%2C+J+%22The+Biology+of+Parasitic+Flowering+Plants%22">The Biology of Parasitic Flowering Plants</a>. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).</li>
<li>Masumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstructions+of+haustoria+in+two+parasitic+plant+species+in+the+Orobanchaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae.</a> Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).</li>
<li>Calo, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+correlation+analysis+of+Light+Microscopy+and+X-ray+MicroCT+imaging+methods+applied+to+archaeological+plant+remains%27+morphological+attributes+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).</li>
<li>Brodersen, C. R., Roddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+the+three-dimensional+visualization+of+plant+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function.</a> American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).</li>
<li>Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+history%2C+diversity%2C+and+distribution+in+parasitic+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants.</a> Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).</li>
<li>Simpson, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krameriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Flora+Neotropica+Monograph%22%5BJournal%5D)">Krameriaceae.</a> Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).</li>
<li>Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holoparasitic+Rafflesiaceae+possess+the+most+reduced+endophytes+and+yet+give+rise+to+the+world%27s+largest+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers.</a> Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).</li>
<li>Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoparasitic+plants+and+fungi+show+evolutionary+convergence+across+phylogenetic+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions.</a> New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).</li>
<li>Largent, D., Johnson, D., Watling, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLargent%2C+D+%22How+to+Identify+Mushrooms+to+Genus+III%3A+Microscopic+Features%22">How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features</a>. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).</li>
<li>Busse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+virtual+histology+enabled+through+cytoplasm-specific+X-ray+stain+for+microscopic+and+nanoscopic+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).</li>
<li>Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measuring+hydraulic+conductivity+and+embolism+in+xylem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem.</a> Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).</li>
<li>Calvin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-formed+tyloses+in+vessels+of+the+mistletoe+Phoradendron+%28Viscaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22IAWA+Journal%22%5BJournal%5D)">Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae).</a> IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).</li>
<li>Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embolism+increase+and+anatomical+modifications+caused+by+a+parasitic+plant%5BTitle%5D)+AND+%22IAWA+Journal%22%5BJournal%5D)">Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant.</a> IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).</li>
<li>Ellmore, G. S., Ewers, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+in+the+outermost+xylem+increment+of+a+ring-porous+tree%2C+Ulmus+americana%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana.</a> American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).</li>
<li>Ellis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+sectioned+biological+specimens+for+transmission+electron+microscopy%3A+Conventional+and+En+bloc+stains%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microscopy%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains.</a> Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).</li>
<li>Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+embolism+repair+in+xylem%3A+In+vivo+visualizations+using+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).</li>
<li>Brodersen, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+three-dimensional+xylem+networks+using+high-resolution+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography.</a> New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+plant+development+and+gene+expression+in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

Het gebruik van oplossingen voor zware metalen om het contrast van plantenweefsel te verbeteren, is een cruciale stap geworden in de monstervoorbereiding voor micro-CT-analyse. Verschillende verbindingen die algemeen beschikbaar zijn in laboratoria voor micromorfologie van planten zijn getest door Staedler et al., die aanbevelen fosfotungstaat te gebruiken als het meest effectieve middel in penetrerende monsters en de contrastindex8 te verhogen. De resultaten die hier zijn verkregen bij de analyse...

Hoge resolutie X-ray microcomputed tomography (micro-CT) is een beeldvormingsmethode waarbij meerdere röntgenfoto's (projecties) van een monster worden opgenomen vanuit verschillende kijkhoeken en later worden gebruikt om een virtuele reconstructie van het monsterte bieden 1. Dit virtuele object kan vervolgens worden geanalyseerd, gemanipuleerd en gesegmenteerd, waardoor niet-destructieve verkenning in drie dimensiesmogelijk is 2. Oorspronkelijk ontworpen voor medische analyses en later voor industriële toepassingen, biedt micro-CT ook het voordeel van het visualiseren van inwendige organen en weefsels zonder de noodzaak van invasieve procedures3. Net als andere vormen van beeldvorming werkt micro-CT met een afweging tussen het gezichtsveld en de pixelgrootte, wat betekent dat beeldvorming met hoge resolutie van grote monsters bijna onbereikbaar is4. Er wordt voortdurend vooruitgang geboekt in het gebruik van hoogenergetische röntgenbronnen (d.w.z. synchrotron) en secundaire optische vergroting, waardoor de kleinste resolutie minder dan 100 nm 5,6 kan bereiken. Niettemin zijn langere scantijden nodig voor grote monsters, waardoor de kans op artefacten als gevolg van monsterbeweging of vervorming in de scanner toeneemt. Bovendien wordt micro-CT over het algemeen beperkt door natuurlijke dichtheidsvariaties in het monster en hoe het monster interageert met röntgenstralen. Hoewel een hogere röntgendosis het beste is voor het penetreren van dichtere monsters, is het minder efficiënt in het vastleggen van variaties in dichtheid binnen en tussen het monster en het omringende medium7. Aan de andere kant biedt een lagere röntgendosis minder penetratievermogen en vereist het vaak langere scantijden maar meer gevoeligheid bij dichtheidsdetectie7.
Deze beperkingen hebben het gebruik van microtomografie voor plantenwetenschappen lang belemmerd, aangezien de meeste plantenweefsels zijn samengesteld uit licht (niet-dicht) weefsel met een lage röntgenabsorptie8. De eerste toepassingen van micro-CT waren gericht op het in kaart brengen van wortelnetwerken binnen de bodemmatrix 9,10. Later begonnen plantenstructuren met meer significante verschillen in weefseldichtheid, zoals hout, te worden onderzocht. Dit heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar xyleemfunctionaliteit 11,12, ontwikkeling van complexe weefselorganisaties 13,14 en interacties tussen planten 15,16,17. De analyse van zacht en homogeen weefsel wordt wijdverspreid als gevolg van contrastmiddelen, die nu standaardprocedure zijn in preparaten voor micro-CT-scans van plantenmonsters. Protocollen voor contrastintroductie kunnen echter verschillende resultaten hebben, afhankelijk van het monstervolume, de structurele eigenschappen en het type oplossing dat wordt gebruikt8. Idealiter zou het contrastmiddel het onderscheid tussen verschillende weefsels moeten verbeteren, evaluatie van de weefsel- / orgaanfunctionaliteit mogelijk moeten maken en / of biochemische informatie over een weefsel moeten verstrekken18. Daarom worden adequate monsterbehandeling, voorbereiding en montage vóór het scannen cruciaal voor elke micro-CT-analyse.
Micro-CT van de parasitaire plant haustorium Parasitaire bloeiende planten vertegenwoordigen een afzonderlijke functionele groep angiospermen die worden gekenmerkt door een orgaan dat bekend staat als haustorium19. Dit meercellige orgaan, een ontwikkelingshybride tussen een gemodificeerde stengel en een wortel, werkt in op de hechting, penetratie en het contact van de gastheer door een parasiet20. Om deze reden wordt het haustorium beschouwd als "de belichaming van het idee van parasitisme onder planten"21. Een gedetailleerd begrip van de ontwikkeling, structuur en werking van dit orgaan is cruciaal voor parasitaire plantenecologie, evolutie en managementstudies. Niettemin belemmeren de algehele complexiteit van parasitaire planten en de sterk gewijzigde structuur en haustoria vaak een gedetailleerde analyse en vergelijking. Haustoriumverbindingen zijn meestal ook uitgebreid en niet homogeen in weefsel- en celverdeling (figuur 1). In deze context, terwijl het werken met kleine weefselfragmenten eenvoudigere manipulatie en een hogere resolutie mogelijk maakt, kan dit leiden tot onjuiste conclusies over de driedimensionale architectuur van complexe structuren, zoals het parasitaire plantenhaustorium.
Hoewel er een uitgebreide literatuur bestaat over de anatomie en ultrastructuur van haustorium voor de meeste parasitaire plantensoorten, blijft de driedimensionale organisatie en de ruimtelijke relatie tussen parasiet en gastheerweefsel slecht onderzocht17. In een recent werk van Masumoto et al.22 werden meer dan 300 seriële halfdunne microtoomsecties in beeld gebracht en gereconstrueerd tot een driedimensionaal virtueel object dat het haustorium van twee parasietsoorten vertegenwoordigt. Het uitstekende detailniveau van deze methode biedt ongekende inzichten in de cellulaire en anatomische 3D-structuur van het haustorium. Een dergelijke tijdrovende techniek zou echter een soortgelijke analyse bij parasieten met uitgebreidere haustoriumverbindingen verbieden. Het gebruik van micro-CT komt naar voren als een uitstekend hulpmiddel voor driedimensionale analyse van complexe en vaak omvangrijke haustoria van parasitaire planten. Hoewel het geen vervanging is voor gedetailleerde anatomische secties en andere complementaire vormen van microscopieanalyses17,23, kunnen resultaten verkregen via micro-CT-scanning, vooral voor grote monsters, ook dienen als een gids voor het sturen van de subbemonstering van kleinere segmenten, die vervolgens kunnen worden geanalyseerd met behulp van andere hulpmiddelen, zoals confocale en elektronenmicroscopie, of opnieuw geanalyseerd met micro-CT-systemen met hoge resolutie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63423/63423fig01.jpg"> Figuur 1: Parasitaire planten van verschillende functionele groepen die in dit protocol worden gebruikt. Eufytoïde parasiet Pyrularia pubera (A), endoparasiet Viscum minimum (B) met groene vruchten (onderbroken zwarte cirkel), parasitaire wijnstok Cuscuta americana (C), maretak Struthanthus martianus (D), obligate wortelparasiet Scybalium fungiforme (E). Segmenten van de gastheerwortel (Hr) of stengel (Hs) vergemakkelijken de toepassing van contrast in de parasiet haustorium (P). De aanwezigheid van parasiet moeder wortel / stengel (pijlen) in het monster maakt analyse van haustorium vat organisatie mogelijk. Rechthoeken geven segmenten van het monster aan die voor de analyse worden gebruikt. Schaalstaven = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63423/63423fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Naarmate micro-CT een steeds populairdere techniek wordt in de plantenwetenschappen, zijn er handleidingen, protocollen en literatuur over het scannen van monsters, driedimensionale reconstructie, segmentatie en analyse 3,10,24. Deze stappen zullen hier dus niet worden besproken. Zoals met elke verbeeldingstechniek, zijn de juiste behandeling en montage van monsters een fundamentele, hoewel het vaak een over het hoofd geziene procedure is. Om deze reden richt dit protocol zich op de voorbereiding van haustoriummonsters voor micro-CT-scanning. Meer specifiek beschrijft dit protocol twee benaderingen voor het introduceren van contrastmiddelen in haustoriummonsters om de visualisatie van verschillende weefsels en celtypen in het haustorium te verbeteren, om de detectie van parasitair weefsel in de gastheerwortel / stam te vergemakkelijken en om parasiet-gastheer vasculaire verbindingen in drie dimensies te analyseren. De hier beschreven preparaten kunnen ook worden aangepast aan de analyse van andere plantstructuren.
Vijf soorten werden gebruikt om het gemak van het hier beschreven protocol beter te illustreren. Elke soort vertegenwoordigt een van de vijf functionele groepen van parasitaire bloeiende planten, waardoor specifieke punten met betrekking tot de functionaliteit van elke groep worden aangepakt. Pyrularia pubera (Santalaceae) werd gekozen om eufytoïde parasieten te vertegenwoordigen, die in de grond ontkiemen en meerdere haustoria vormen die de parasiet verbinden met de wortels van zijn gastheren25. De haustoria die door deze planten worden gecreëerd, zijn vaak ijl en gemakkelijk los te scheuren van de gastheer26 (figuur 1A), waardoor een delicater behandelingsproces nodig is. Endoparasieten worden hier vertegenwoordigd door Viscum minimum (Viscaceae). Soorten in deze functionele groep zijn slechts gedurende korte perioden zichtbaar buiten het lichaam van hun gastheren (figuur 1B) en leven het grootste deel van hun levenscyclus als aanzienlijk gereduceerde en myceliale strengen cellen ingebed in gastheerweefsels25. Een derde functionele groep bestaat uit parasitaire wijnstokken, die op de grond ontkiemen maar slechts rudimentaire wortels vormen, afhankelijk van meerdere haustoria die zich hechten aan de stengels van waardplanten25 (figuur 1C). Hier wordt deze functionele groep vertegenwoordigd door Cuscuta americana (Convolvulaceae). In tegenstelling tot parasitaire wijnstokken ontkiemen maretak direct op de takken van hun waardplanten en ontwikkelen ze meerdere of solitaire haustoria25. De soort die is gekozen om deze functionele groep te illustreren is Struthanthus martianus (Loranthaceae), die verschillende verbindingen vormt met de gastheertak (figuur 1D). Analyse van solitaire maretak haustoria met behulp van een combinatie van micro-CT en lichtmicroscopie is te vinden in Teixeira-Costa &; Ceccantini17. Ten slotte omvatten obligate wortelparasieten soorten die op de grond ontkiemen en de wortels van waardplanten binnendringen, waarvan ze volledig afhankelijk zijn vanaf de vroegste groeistadia25. Deze planten worden hier vertegenwoordigd door Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), die grote knolachtige haustoria produceren (figuur 1E).
Alle plantenmonsters die in dit protocol werden gebruikt, werden gefixeerd in een 70% formaline-azijnzuuralcohol (FAA 70). De fixatie op bemonstering is cruciaal voor het behoud van plantenweefsels, vooral als latere anatomische analyses nodig zijn. In het geval van parasitaire plantenhaustorium is fixatie ook essentieel, omdat dit orgaan vaak voornamelijk bestaat uit niet-gelignificeerde parenchymcellen20. Gedetailleerde protocollen voor de fixatie van plantenweefsel, inclusief de bereiding van fixatieve oplossingen, zijn elders te vinden27. Aan de andere kant kunnen fixatieven in meer of mindere mate veranderingen in de fysische en chemische eigenschappen van een monster veroorzaken, waardoor het ongeschikt wordt voor specifieke biomechanische en histochemische analyses. Zo kunnen verse monsters, d.w.z. niet-gefixeerd materiaal dat onmiddellijk voor de bereiding wordt verzameld, ook met dit protocol worden gebruikt. Details over het omgaan met nieuwe monsters en suggesties voor het oplossen van problemen met gefixeerd materiaal vindt u in de discussiesectie.

<table><tbody><tr><td>3D X-ray microscope (XRM) system</td><td></td><td>Zeiss Versa 620</td><td>gebruikt voor het scannen van Pyrularia pubera</td></tr><tr><td>3D X-ray microscope + A2:D22</td><td>Zeiss</td><td>Versa 620</td><td>Gebaat voor het scannen van de soort P. pubera</td></tr><tr><td>CT-Pro 3D software</td><td>Nikon</td><td>versie XT 3.1.11</td><td>Gebaat voor driedimensionale reconstructie van scans</td></tr><tr><td>CT-Vox software</td><td>Bruker</td><td>versie 3.3.1</td><td>Gebaat voor analyses en acquisitie van beelden en video's</td></tr><tr><td>Dragonfly software</td><td>Object Research Systems - ORS</td><td>versie</td><td>Gebaat voor analyses en acquisitie van beelden en video's</td></tr><tr><td>Glazen flacons</td><td>Glass Vials Inc. SE</td><td>V2708C-FM-SP</td><td>Verkocht door VWR - VS; zorg ervoor dat de flacons in staat zijn om een vacuüm van ca. 10 psi te weerstaan</td></tr><tr><td>Inspect-X</td><td>Zeiss</td><td>versie XT 3.1.11</td><td>Gebaat voor het bedienen van het Nikon X-Tek HMXST225 systeem</td></tr><tr><td>Jodiumoplossing 0,0282 N</td><td>WR Chemicals BDH</td><td>BDH7422-1</td><td>Verkocht door VWR - VS</td></tr><tr><td>Lodzijn II PA 500 g</td><td>Vetec</td><td>361.08</td><td>Verkocht door SPLab</td></tr><tr><td>Microtomografiescanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan1176</td><td>Gebaat voor het scannen van de soorten C. americana, S. martianus en S. fungiforme</td></tr><tr><td>Microtomografiescanner</td><td>Nikon</td><td>X-Tek HMXST225</td><td>Gebaat voor het scannen van de soort V. minimum</td></tr><tr><td>NRecon software</td><td>Bruker</td><td>versie 1.0.0</td><td>Gebaat voor driedimensionale reconstructie</td></tr><tr><td>Fosfowolfraamzuurhydraat 3% in waterige oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>101410-756</td><td>Verkocht door VWR - VS</td></tr><tr><td>Kunststoffolie (Parafilm)</td><td>Heathrow Scientific</td><td>PM996</td><td>Verkocht door VWR - VS</td></tr><tr><td>Kunststof IV-zak 500 mL</td><td>Taylor</td><td>3478</td><td>Verkocht door Fibra Cirurgica Produtos para Saude</td></tr><tr><td>PVC-buis 3/4''</td><td>Nalge Nunc International</td><td>SC63013-164</td><td>Verkocht door VWR - VS</td></tr><tr><td>Scansysteem</td><td></td><td>Nikon X-Tek HMXST225</td><td>gebruikt voor het scannen van Viscum minimum</td></tr><tr><td>Scansysteem</td><td></td><td>Bruker Skyscan 1176</td><td>gebruikt voor het scannen van C. americana</td></tr><tr><td>Scout-and-ScanTM software</td><td>Zeiss</td><td>versie 16</td><td>Gebaat voor het bedienen van het Zeiss Versa 620 systeem en voor driedimensionale reconstructie van scans</td></tr><tr><td>Driewegklep</td><td>ToToT</td><td>DMTWVS-5</td><td>Verkocht door Amazon USA</td></tr><tr><td>Tweedelige spuit</td><td>HSW Henke-Ject</td><td>4850001000</td><td>Gebaat zonder de plunjer</td></tr><tr><td>Vacuumkamer</td><td>Binder</td><td>80080-434</td><td>Verkocht door VWR - VS; inclusief pomp en verbindingsbuizen</td></tr><tr><td>VG Studio Max software</td><td>Volume Graphics</td><td>versie 3.0</td><td>Gebaat voor analyses en acquisitie van beelden en video's</td></tr></tbody></table>

gebruik maken van micro-ct-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren

Leveraging Micro-CT Scanning to Analyze Parasitic Plant-Host Interactions

Micro-CT-scanning is een ingeburgerd hulpmiddel geworden bij het onderzoeken van de structuur en functie van planten. De niet-destructieve aard, gecombineerd met de mogelijkheid van driedimensionale visualisatie en virtuele secties, heeft nieuwe en steeds gedetailleerdere analyse van complexe plantenorganen mogelijk gemaakt. Interacties tussen planten, inclusief tussen parasitaire planten en hun gastheren, kunnen ook worden onderzocht. Monstervoorbereiding voor het scannen wordt echter cruciaal vanwege de interactie tussen deze planten, die vaak verschillen in weefselorganisatie en samenstelling. Bovendien moet rekening worden gehouden met de grote diversiteit van parasitaire bloeiende planten, variërend van sterk gereduceerde vegetatieve lichamen tot bomen, kruiden en struiken, tijdens de bemonstering, behandeling en bereiding van parasiet-gastheermateriaal. Hier worden twee verschillende benaderingen beschreven voor het introduceren van contrastoplossingen in de parasiet en / of waardplanten, met de nadruk op het analyseren van het haustorium. Dit orgaan bevordert de verbinding en communicatie tussen de twee planten. Volgens een eenvoudige benadering kunnen details van haustoriumweefselorganisatie driedimensionaal worden onderzocht, zoals hier wordt getoond voor eufytoïde, wijnstok- en maretakparasitaire soorten. Het selecteren van specifieke contrasterende middelen en toepassingsbenaderingen maakt ook gedetailleerde observatie van endoparasietverspreiding in het gastheerlichaam mogelijk en detectie van directe vaat-tot-vatverbinding tussen parasiet en gastheer, zoals hier getoond voor een obligate wortelparasiet. Het hier besproken protocol kan dus worden toegepast op de brede diversiteit van parasitaire bloeiende planten om het begrip van hun ontwikkeling, structuur en functioneren te bevorderen.

Het haustorium van parasitaire planten is een complex orgaan dat bestaat uit verschillende weefsels en celtypen die zich verstrengelen en verbinden met de weefsels van een andere plant, gebruikt als gastheer20. Micro-CT-scanning kan worden gebruikt om deze complexe structuur op een niet-destructieve en driedimensionale manier beter te begrijpen bij het analyseren van zowel kleine (Figuur 1A-C) als grote (Figuur 1D, E</str...

Micro-CT is een niet-destructief hulpmiddel dat plantstructuren in drie dimensies kan analyseren. Het huidige protocol beschrijft de monstervoorbereiding om micro-CT te gebruiken om de parasitaire plantstructuur en -functie te analyseren. Verschillende soorten worden gebruikt om de voordelen van deze methode te benadrukken in combinatie met specifieke preparaten.

Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren

Micro-CT scanning has become an established tool in investigating plant structure and function. Its non-destructive nature, combined with the possibility ...

Dit protocol verbetert aanzienlijk het contrast tussen de weefsels van de parasitaire plant en de gastheer in monsters die zullen worden geanalyseerd met behulp van microtomografie. De hier beschreven techniek versnelt het proces van contrastperfusie door het monster, waardoor de analyse van specifieke weefsels en structuren gevormd tussen de parasitaire plant en de gastheer mogelijk is. De vacuümbenadering is zeer eenvoudig en zou geen problemen moeten opleveren.Het perfusieapparaat daarentegen kan een beetje uitdagend zijn om in te stellen. Maar oefenen vooraf zou kunnen helpen. Voor kleine niet-houtachtige monsters kan de vacuümmethode worden gebruikt voor toepassing.Overwegende dat de profusiemethode moet worden gebruikt voor monsters die groter en houtachtig zijn, met inbegrip van een segment van de gastheerstengel of -wortel. Als u de vacuümmethode gebruikt, plaatst u het monster in de injectieflacon met de contrasterende oplossing. Plaats vervolgens de injectieflacon in een vacuümkamer of exsiccator die is aangesloten op een vacuümpomp.Verwijder het deksel van de injectieflacon en sluit de vacuümkamer of exsiccator. Controleer of er geen scheuren in de vacuümkamer of exsiccator zitten. Open de uitlaatklep van de kamer of exsiccator om de lucht naar buiten te persen.Zet de pomp aan en wacht tot de druk ongeveer 20 inch kwik of 10 psi bereikt. Sluit de kamer of de exsiccator uitlaatklep om te voorkomen dat lucht opnieuw binnenkomt. Zet dan snel de pomp uit.Laat het monster ten minste twee uur onder vacuüm staan. Als u de profusiemethode gebruikt, selecteert u de toevoertank op basis van de monstergrootte. Voor kleine monsters kan een spuit van 50 milliliter zonder naald als tank worden gebruikt.Sluit het ene uiteinde van een transparante plastic slang aan op de toevoertank. Sluit vervolgens het andere uiteinde aan op een tweeweg- of driewegklep. Sluit een tweede slang aan op een andere uitlaat in de klep.Bevestig de toevoertank op een verhoogde positie zonder het apparaat dat in de vorige stap is ingesteld, te demonteren. Sluit de drieweg- of tweewegklep om te voorkomen dat vloeistof het slangsysteem verlaat en giet de contrasterende oplossing in de toevoertank. Zorg ervoor dat er geen grote luchtbellen in het buizensysteem zitten en sluit de klep weer, zodat het apparaat op zijn plaats blijft.Om het monster voor te bereiden op overdaad van de contrastoplossing, houdt u het ondergedompeld in vloeistof en snijdt u de punt van het proximale uiteinde van de gastheerstengel of -wortel af. Open de klep voorzichtig om de contrasterende oplossing langzaam te laten stromen en vul de plastic slang die op de tank is aangesloten terwijl u het open uiteinde van het systeem op een iets verhoogde positie houdt om te voorkomen dat de contrasterende oplossing morst. Verbind het proximale uiteinde van de gastheerstengel of wortel in het monster met het open uiteinde van het buizensysteem.Laat de oplossing het monster gedurende ten minste twee uur doordrenken of totdat de oplossing zich in de container ophoopt. Sluit de klep en koppel het monster voorzichtig los van het apparaat. Was het monster door het gedurende twee minuten onder te dompelen in water.Leg het monster in een papieren handdoek bij kamertemperatuur om overtollig water gedurende twee tot vijf minuten te laten verdampen zonder het monster volledig te laten uitdrogen. Wikkel het monster in een paraffinefilm en vouw de film niet op het monster. Micro-CT-scanning kan worden gebruikt om de complexe structuren van parasitaire planten en hun interactie met gastheren op een niet-destructieve, driedimensionale manier beter te begrijpen.De hier beschreven protocollen werken voor verschillende micro-CT-systemen. De instellingen en parameters zijn echter afhankelijk van het systeem en de monsters. 3D-röntgenmicroscoopbeelden waren net zo effectief als anatomische secties die onder een lichtmicroscoop werden waargenomen om weefselorganisatie en topologie op de interface van de parasietgastheer te analyseren.Op basis van het helderwitte en donkergrijze kleurverschil als gevolg van differentiële absorptie van de contrastoplossing, is het mogelijk om de overvloed aan parenchym rond de vasculaire kern van het haustorium waar te nemen. De vasculaire kern is gemakkelijk waar te nemen in dwarsdoorsneden, omdat twee vasculaire strengen worden gescheiden door parenchym. De endoparasiet Viscum minimum, groeiend in een vetplant waardplant, toonde parenchymcellen die koolhydraten opslaan in de vorm van zetmeel.Het verschil in jodiumabsorptie maakte de detectie mogelijk van het ingewikkelde web van corticale strengen gevormd door de endoparasiet in het gastheerlichaam. De resultaten verkregen voor Cuscuta Americana en Struthantus marcianus illustreren het gemak van de microtomografiebenadering voor respectievelijk kleine en grotere monsters. De virtuele seriële sectie Sibelium fungiform toonde aan dat de vaten in de gastheerwortel zich splitsen in de parasietknol, en dat de xyleemcontinuïteit tussen de twee planten wordt gevormd door vaat-tot-vatverbinding via perforatieplaten.De hier beschreven procedure kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals virtuele segmentatie, om nieuwe inzichten te verschaffen in de driedimensionale structuur van de verbinding tussen parasitaire planten en hun gastheren. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor het analyseren van verschillende aspecten van de biologie van parasitaire planten, waaronder de ontwikkeling van endoparasieten en de functionaliteit van hyperparasitaire verbindingen.

leveraging-micro-ct-scanning-to-analyze-parasitic-plant-host

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Protocollen voor een efficiënte bereiding van homogene monsters van spintmijten, aantasting van experimentele installaties, en beoordeling van plantaardige schade, zoals vereist voor studies van planten-plaaginteractie werden ontwikkeld.

Toepassing van twee-gespot spintmijt<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Voor Plant-pest Interaction Studies

Problemen bij de verwerking van biologische monsters voor waarneming door middel van rasterelektronenmicroscopie omvatten celimplosie, behandeling van monsters uit natte micro-omgevingen en celvernietiging. Goedkope en relatief snelle protocollen die geschikt zijn voor het voorbereiden van uitdagende monsters zoals bloemtoppen, oömyceten cysten en schimmels (Agaricales) zijn hier samengesteld en gedetailleerd.

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocollen voor Problematisch Plant, oömyceet en Fungal Samples

Wij bieden een nieuwe methode om het contrast X-ray absorptie van maïs weefsel geschikt voor het scannen van gewone microcomputed-tomografie. Op basis van CT-beelden, introduceren we een set van beeldverwerking workflows voor verschillende maïs materialen effectief uitpakken microscopische fenotypes van vaatbundels van maïs.

Micron-schaal fenotypering technieken van maïs vaatbundels gebaseerd op de X-ray Microcomputed tomografie

Hier worden protocollen voor het uitvoeren van micro focus X-Ray computertomografie (microCT) Imaging van drie mariene ongewervelde dieren gedetailleerd uitgelegd. Deze studie beschrijft stappen zoals monster fixatie, kleuring, montage, Scanning, beeld reconstructie en data-analyses. Suggesties over hoe het protocol kan worden aangepast voor verschillende monsters worden ook verstrekt.

MicroFocus X-Ray CT (microCT) beeldvorming van Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe SP. (Annelida), en xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

De meeste planten binnen gemeenschappen waarschijnlijk zijn onderling verbonden door arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels, maar bemiddeling van plant interacties door hen voornamelijk door het kweken van planten met versus zonder mycorrhiza heeft onderzocht. Presenteren we een methode om te manipuleren gemeenschappelijk mycorrhiza netwerken onder bijzondere planten te onderzoeken van de gevolgen daarvan voor de plant interacties.

Onderzoek van Plant interacties via gemeenschappelijke mycorrhiza netwerken met behulp van gedraaide Cores

Het huidige protocol beschrijft een betrouwbare en eenvoudige methode voor het kweken, verzamelen en screenen van Ditylenchus dipsaci.

Het kweken en screenen van de plant Parasitaire Nematode Ditylenchus dipsaci

Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.

Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen

Het protocol beschrijft hier de methoden voor de beoordeling van de arbusculaire mycorrhiza kolonisatiepatronen en strategie in wortels voor twee soorten: Zea mays en Festuca rubra. Het gebruik van de MycoPatt-methode maakt de berekening van parameters, de conversie van mycorrhizastructuren in digitale gegevens en het in kaart brengen van hun werkelijke positie in wortels mogelijk.

Mycorrhiza-kaarten als hulpmiddel om kolonisatiepatronen en schimmelstrategieën in de wortels van Festuca rubra en Zea mays te verkennen

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.

Losse maïsomhulsels voor levende beeldvorming van infectie door schimmelpathogenen van bladmaïs

We stellen een geoptimaliseerd Scanning Electron Microscopie-protocol voor voor het visualiseren van zeer heterogene en delicate monsters die planten- en schimmelbiomassa bevatten, samen met microbiota en biofilm. Dit protocol maakt het mogelijk om de ruimtelijke dimensies van de microbiota-organisatie te beschrijven.

Microbiota van attine mierentuinen: visualisatie van een microbieel landschap door scanning elektronenmicroscopie

Leer micro-CT-scanning voor parasitaire plant-gastheer interacties met vacuümperfusie. Deze methode verbetert weefselcontrast en visualiseert haustoria en vaatverbindingen driedimensionaal.

Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren

Meer video's verkennen