Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

De Saccharomyces cerevisiae kinesine-5 Cin8 is een bidirectioneel motoreiwit. Cin8 beweegt in de min-eindrichting van de microtubuli als een enkel molecuul en verandert de directionaliteit onder een aantal verschillende experimentele omstandigheden. Het algemene doel van ons onderzoek is om het mechanisme van bidirectionele motiliteit te begrijpen door factoren en structurele elementen te bestuderen die de bidirectionele beweeglijkheid van Cin8 reguleren.

Dit protocol verklaart uitgebreid de zuivering van GFP-type full-length Cin8 overexpressie in gistcellen, de single-molecule motiliteitstest en de daaropvolgende analyse van beweeglijke eigenschappen van enkele moleculen en clusters van Cin8. Deze scheiding is belangrijk, omdat de directionaliteit van Cin8 wordt beïnvloed door de accumulatie in clusters op de microtubuli. Deze techniek kan eenvoudig worden aangepast om andere nucleaire eiwitten uit de gist te zuiveren.

Bovendien kan het worden toegepast op fluorescerende deeltjes die moeten worden gescheiden in groottegroepen op basis van hun fluorescentie-intensiteit. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Mary Popov, onze laboratoriummanager, Dr. Alina Goldstein-Levitin, en Dr. Nurit Siegler, postdoctorale fellows; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan en Shira Hershfinkel, afgestudeerde studenten; en Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham en Meital Haberman, niet-gegradueerde studenten van ons laboratorium. Om te beginnen, kweek Saccharomyces cerevisiae cellen die het plasmide bevatten voor overexpressie van Cin8-GFP-6His naar de exponentiële groeifase in één liter gistselectief medium, aangevuld met 2% raffinose bij 28 graden Celsius.

Induceer vervolgens Cin8-GFP-6His overexpressie door 2% galactose toe te voegen en controleer de groei van de gistcultuur door de absorptie op 600 nanometer te meten. Vijf uur na toevoeging van galactose, oogst de cellen door centrifugeren. Suspensie de cellen opnieuw in lysisbuffer en vries ze in vloeibare stikstof in.

Maal vervolgens met behulp van een gekoelde vijzel en stamper de bevroren cellen in vloeibare stikstof. Blijf tijdens het malen vloeibare stikstof toevoegen, zodat de extracten bevroren blijven. Controleer de cellyse onder een fase- of differentiële interferentiecontrastmicroscoop.

Ontdooi vervolgens de grondcellen en centrifugeer ze. Laad het supernatant op een zwaartekrachtstroomkolom gevuld met twee milliliter nikkel-NTA en breng het vooraf in evenwicht met lysisbuffer. Laat het bovennatuurlijk door de kolom naar buiten stromen.

Was de kolom met vijf kolomvolumes lysisbuffer, gevolgd door vijf kolomvolumes lysisbuffer aangevuld met 25-millimolair imidazool. Elueer vervolgens de Cin8-GFP-6His met elutiebuffer. Analyseer de geëlueerde monsters door SDS-PAGE fractionering, gevolgd door Coomassie blauwe kleuring en Western blot analyse onderzocht met anti-GFP antilichaam.

Na het poolen van de fracties die Cin8-GFP-6His bevatten, zuivert u ze door maatuitsluitingschromatografie met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut en een kolomdruklimiet van 1,5 megapascal. Bewaak tegelijkertijd de absorptie op 280 nanometer. Verzamel de fracties die overeenkomen met het Cin8-GFP-tetrameer en analyseer ze met SDS-PAGE en Western blotting.

Vul vervolgens de geselecteerde fracties aan, vries in en bewaar tot gebruik bij min 80 graden Celsius. Om de biotine en rhodamine gelabelde microtubuli te polymeriseren en te stabiliseren, mengt u de reactiecomponenten in een buis van 1,5 milliliter en incubeert u het mengsel gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 80 microliter warme algemene tubulinebuffer toe, meng voorzichtig en centrifugeer.

Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet voorzichtig opnieuw door op en neer te pipetteren met 50 microliter warme algemene tubulinebuffer. Bewaar de suspensie vervolgens bij 28 of 37 graden Celsius. Onderzoek de microtubuli met een fluorescentiemicroscoop, met behulp van het 647-nanometer rhodaminekanaal.

Verwijder vervolgens het beschermende papier van de tapestroken en plaats een silanized coverslip op de strips om drie 10-microliter volumestroomkamers te creëren. Voer vervolgens de avidinecoating van de coverslip uit door sequentiële toevoeging van de aangegeven reagentia. Incubeer de dekplaat gedurende drie tot vijf minuten voordat u deze wast met 80 microliter algemene tubulinebuffer.

Bevestig vervolgens de gebiotinyleerde microtubuli aan de b-BSA / avidin-gecoate coverslips door 20 microliter microtub microtub in de stroomkamer in te brengen. Incubeer de dia's met de afdekplaat naar beneden gericht in een donkere vochtigheidskamer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de glaasjes met 200 microliter algemene tubulinebuffer.

Breng vervolgens 30 microliter motiliteitsreactiemix aan, gevolgd door Cin8-GFP-motoren verdund in 20 microliter van het motiliteitsreactiemengsel in de stroomkamer en ga onmiddellijk verder met het in beeld brengen van de beweging van de motoren langs de microtubuli. Voor motormotiliteitsbeeldvorming plaatst u een druppel dompelolie op het microscoopobjectief en plaatst u vervolgens de stroomkamer op het fluorescerende microscoopstadium, met de coverslip naar het objectief gericht. Schakel het rhodaminekanaal in om te focussen op de microtubuli die aan het oppervlak van de dekvloer zijn bevestigd.

Vervolgens kunt u met behulp van ImageJ Micro-Manager-software het beeld verkrijgen met een belichting van 20 milliseconden. Schakel vervolgens het GFP-kanaal in en verkrijg 90 time-lapse-beelden met een interval van één seconde en een belichting van 800 milliseconden. Open in de ImageJ Fiji-software de time-lapse-film en het bijbehorende microtubule-veldbeeld.

Synchroniseer deze twee vensters door Analyseren te kiezen, gevolgd door Extra en Windows synchroniseren. Om een kymograaf te verkrijgen, markeert u één microtubool met de optie Gesegmenteerde lijn. Selecteer vervolgens in Analyseren het tabblad Multi-Kymograaf.

Om de clustergrootte van de Cin8-GFP-moleculen te bepalen, voert u de achtergrondaftrekking en correctie voor ongelijke verlichting uit door op Verwerken te klikken, gevolgd door Achtergrond aftrekken. Stel de straal van de rollende kogel in op 100 pixels en vink de optie Glijdende paraboloïde aan. Volg vervolgens een specifieke niet-beweeglijke Cin8-GFP-motor met behulp van de TrackMate-plug-in van de ImageJ Fiji-software.

Kies Plug-ins, gevolgd door Tracking, TrackMate, LoG-detector en Simple LAP-tracker om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de Cin8-GFP-motor te volgen als functie van de tijd binnen een cirkel van vier pixels radius. Na het herhalen van de procedure voor verschillende Cin8-GFP-motoren, plot de fluorescentie-intensiteiten als een functie van de tijd. Vervolgens, voor het volgen van de beweeglijkheid van de Cin8-GFP-moleculen langs de microtubulisporen, snijdt u de microtubuli bij die moeten worden geanalyseerd in de time-lapse-reeks van opgenomen frames door deze te markeren met het rechthoekgereedschap en op Afbeelding te klikken, gevolgd door Bijsnijden.

Kies een fluorescerend Cin8-GFP-deeltje voor de analyse. Noteer de deeltjescoördinaten in elk frame van de time-lapse-reeks met behulp van het gereedschap Punt en de opties Meten. Registreer op dezelfde manier coördinaten voor andere fluorescerende deeltjes in de time-lapse-reeks.

Wijs vervolgens clustergrootte toe aan alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes in het eerste frame van hun verschijning, zoals eerder aangetoond. Bereken vervolgens met behulp van de aangegeven formule en de bepaalde Cin8-GFP-bewegingscoördinaten de verplaatsingen van Cin8-GFP op elk tijdstip ten opzichte van de begincoördinaten. Bereken op basis van deze verplaatsingswaarden de verplaatsing voor alle mogelijke tijdsintervallen voor een gespecificeerd Cin8-GFP-deeltje.

Herhaal de procedure voor alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes. Zet ten slotte de gemiddelde verplaatsing van alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes versus het tijdsinterval uit en onderwerp deze aan een lineaire pasvorm. De helling van deze fit vertegenwoordigt de gemiddelde snelheid van beweeglijke Cin8-GFP deeltjes.

De beweeglijkheidskenmerken van bidirectioneel motoreiwit Cin8 van verschillende clustergroottes op enkele microtubuli worden hier getoond. Voor elke clustergroottecategorie werden meer dan 40 trajecten van individuele Cin8-GFP uit de opnames geëxtraheerd. Het uitzetten van de gemiddelde verplaatsingen van enkele moleculen en clusters van Cin8-motoren als functie van het tijdsinterval toonde aan dat enkele Cin8-GFP-moleculen op een unidirectionele minus-end-gerichte manier met hoge snelheid bewegen.

Cin8-clusters vertonen daarentegen een lagere snelheid en een hogere bidirectionele beweeglijkheid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moet een zeer zuiver motoreiwit worden gebruikt om verontreinigingen te voorkomen die de motorclustering kunnen beïnvloeden. Bij het analyseren van de motorfluorescentie-intensiteit is het belangrijk om de motoren in het eerste frame dat ze verschijnen te onderzoeken, om het effect van fotobleaching te voorkomen.

Bij het bestuderen van de beweeglijkheid van bidirectionele motoren is het uiterst belangrijk om afzonderlijke moleculen en clusters afzonderlijk te analyseren, omdat motorclustering een van de belangrijkste factoren is die de motorische directionaliteit beïnvloeden.