Grootschalige, geautomatiseerde productie van van vetweefsel afgeleide stamcelsferoïden voor 3D-bioprinting

De betekenis van het protocol is het verminderen van menselijke fouten en microbiologische besmetting. Daarnaast verantwoordelijk voor het produceren van duizenden sferoïden voor 3D-bioprinting. Het belangrijkste voordeel van deze kwestie is echter dat het de arbeidsuren heeft geoptimaliseerd.

De softwareparameters zijn cruciaal omdat ze de uiteindelijke kwaliteit van de sferoïden kunnen beïnvloeden. En het beste advies zou zijn om alleen tests uit te voeren met celkweekmedia. De visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het een oude traditionele 3D-celkweekmethode is op basis van Begin door de stamcelsuspensie te oogsten met een serologische pipet van 10 milliliter en deze over te brengen naar een centrifugebuis van 50 milliliter.

Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 400 RCF om de ASC-pellet te verkrijgen. Resuspendeer de celpellet met DMEM-Low met 10% FBS. Na het uitvoeren van het aantal cellen, neem ASC's in afzonderlijke centrifugebuizen van 15 milliliter om de 81 en 256 recessies te zaaien die zijn gemicromold met niet-adherente hydrogel.

Raadpleeg het tekstmanuscript voor meer informatie over het aantal gebruikte cellen. Voeg 500 microliter steriele 2% ultrazuivere agarose-oplossing toe in het midden van een siliconenmal met 81 of 256 cirkelvormige uitsparingen. Maak na 40 minuten de ultrazuivere agaroos uit de siliconenvorm los en plaats deze in een putje van een 12-wells plastic plaat.

Voeg twee milliliter DMEM-Low toe in de put met de micromolded agarose en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% atmosferische kooldioxidetoevoer gedurende ten minste 12 uur voordat de ASC's worden ingezaaid. Zorg ervoor dat de laminaire stroom is ingeschakeld en dat de luchtstroom van de kast goed werkt. Controleer of de apparatuur op de juiste spanning is aangesloten en of de tablet op de apparatuur is aangesloten.

Controleer of de hoogte van het kastbeschermingsglas op hetzelfde niveau ligt als de sensormarkering van de apparatuur. Druk op de aan- of uitknop aan de linkerkant van de apparatuur. Wacht vervolgens tot de tablet en de apparatuur starten.

Plaats de tipboxen, het rek voor centrifugebuizen en de plaat met de micromolded agarose hydrogel in de werkruimte van de apparatuur. Klik in de software die op de tablet is geopend op LabWare Editor. Zet een virtuele werktafel op en kies de posities van de pipetten, tipboxen, het rek voor de plastic buizen en de platen.

Klik op de knop overschakelen naar procedure om alle parameters en opdrachten op te nemen die door de apparatuur tijdens het experiment zijn uitgevoerd. Wacht tot een werkbalk en een procedurelijst in de software worden geopend. Om de opdrachten aan te geven, neemt u in eerste instantie het aantal monsters op dat moet worden gepipetteerd en sleept u dit naar de procedurelijst.

Klik vervolgens op de opdrachtknop reagensoverdracht op de software om de ASC-suspensie over te brengen naar de putten van de 12-wellsplaat met de micromalen en sleep deze naar de procedurelijst. Klik op eigenschappen"om de begin- en eindposities in te stellen voor de apparatuur om het monster over te brengen. Wacht tot de software terugkeert naar de pagina Werktabel.

Stel de parameters in voor het automatisch zaaien van de ASC's zoals beschreven in het tekstmanuscript. Selecteer water als het standaard vloeistoftype. Klik op de knop opties om de parameters in te stellen om een homogene suspensie van de ASC's te creëren zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Klik op de knop met een vinkje op de bovenste balk van de software om er zeker van te zijn dat er geen programmeerfout is. Klik op de play"-knop op de bovenste balk van de software om het programma te starten. Laat de apparatuur starten zoals geprogrammeerd.

En wacht tot het geluid maakt dat aangeeft dat het klaar is. Verzamel de 12-well plaat en incubeer deze vervolgens bij 37 graden Celsius met een 5% atmosferische kooldioxidetoevoer gedurende ten minste 18 uur, om volledige en compacte sferoïdenvorming mogelijk te maken. Oogst de sferoïden handmatig na één, drie en zeven dagen cultuur voor analyse.

Spoel het medium met een micropipet om de sferoïden vrij te maken uit de niet-hechtende agarose hydrogel. Verzamel de sferoïden handmatig met behulp van een micropipet en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Een totaal van 85 en 160 sferoïden werden gemeten uit micromolded niet-klevende hydrogels met respectievelijk 81 en 256 circulaire recessies.

Het automatische pipetsysteem zaaide de ASC-celsuspensie in 15 minuten in 12 putten van een enkele 12-wellsplaat. Met behulp van de 81 micromolded niet-adherente hydrogel, produceerde 972 sferoïden in deze studie. Terwijl de 256 micromol niet-adherente hydrogel, produceerde 3072 sferoïden.

ASC-sferoïden werden geanalyseerd op de homogeniteit van hun grootte en vorm. ASC-steroïden uit micromalen met 81 recessies vertoonden een homogene diameter tijdens de kweekperiode. In tegenstelling tot ASC-steroïden uit micromalen met 256 recessies, was de kleinste en grootste diameterverhouding dicht bij één in ASC-sferoïden uit micromalen met 81 en 256 recessies.

De levensvatbaarheid, morfologie en krachtanalyses leverden bewijs voor de succesvolle, grootschalige productie van ASC-sferoïden. Het meest voorkomende is om ervoor te zorgen dat het probleem abrupt en zonder fouten werd opgelost.