Ontwikkeling van organoïden uit muizenpluipcel als in vitro model om hypofyse stamcelbiologie te verkennen

Ons organoïde model is zeer waardevol om hypofyse stamcelbiologie te onderzoeken in homeostatische en hypofyse remodellering omstandigheden, zoals in neonatale rijping van de klier, veroudering-geassocieerde functionele achteruitgang, en tumorgroei in de klier. Tot op heden is onze hypofyse organoïde techniek het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze primaire hypofysestamcellen van muizen te laten groeien en uit te breiden. De procedure wordt gedemonstreerd door Emma Laporte en Charlotte Nys, promovendi in mijn onderzoeksgroep.

Was om te beginnen de muizenkop met gedeïoniseerd water om het bloed te verwijderen. Spuit 70% ethanol op de kop om een steriele omgeving te genereren. Verwijder vervolgens de huid tussen de oren met behulp van steriele chirurgische hulpmiddelen.

Om de schedel te openen, breek je de neusbrug met een steriele schaar. Open verder de schedel vanaf de neusbrug naar de oren aan beide zijden. Verwijder de schedel en de hersenen met een steriel pincet zonder de hypofyse aan te raken.

Verwijder de diafragma sellae met een stomp pincet. Scheid vervolgens onder een stereomicroscoop de voorkwab van de achterste en tussenlobben. Isoleer de voorkwab zorgvuldig met een stomp pincet en verzamel deze in een Erlenmeyer van 10 milliliter met drie milliliter medium A.Voeg twee milliliter voorverwarmde 2,5% trypsine-oplossing toe.

Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg twee milliliter voorverwarmde DNAse-oplossing toe en draai de Erlenmeyer 10 keer rond. Laat de hypofyse naar de bodem zinken en verwijder het supernatant.

Voeg twee milliliter voorverwarmde trypsineremmeroplossing toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder het bovennatuurlijk wanneer de hypofyse naar de bodem zinkt. Voeg twee milliliter voorverwarmd medium B toe en incubeer gedurende vijf minuten.

Voeg hier twee milliliter voorverwarmd medium C aan toe en incubeer gedurende 15 minuten. Laat de hypofyse naar de bodem zinken en verwijder het supernatant. Spoel het vervolgens drie keer af met voorverwarmd medium C.Voeg twee milliliter voorverwarmd medium C.Aspiraat toe en verdrijft de hypofyse meerdere keren met een steriele, vlamgepolijste Pasteur-pipet totdat fragmenten niet meer zichtbaar zijn.

Breng de suspensie over in een buis van 15 milliliter met 4,5 milliliter voorverwarmde DNAse-oplossing. Spoel de kolf driemaal af met twee milliliter voorverwarmd medium C en breng de suspensie over in de buis. Meng de verzamelde celsuspensie en filtreer deze door een celzeef van 40 micron in een buis van 30 milliliter.

Spoel de buis en de celzeef drie keer met twee milliliter medium C en breng de suspensie over op de buis. Vul een glazen Pasteur pipet met twee milliliter BSA. Plaats de punt van de pipet aan de onderkant van de buis en pipetteer voorzichtig uit om een zichtbare dichtheidslaag te vormen.

Centrifugeer 10 minuten bij 190 maal G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in één milliliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12. Kwantificeer vervolgens de cellen met een celteller.

Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 190 maal G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Resuspend de celkorrel in geavanceerde DMEM/F-12 om een celdichtheid van 1,1 maal 10 tot de 6e cellen per milliliter te bereiken. Voeg ECM toe aan het gewenste volume celsuspensie in een verhouding van 30:70 en meng goed.

Deponeer een druppel van 30 microliter van dit mengsel in elke put van een voorverwarmde plaat met 48 putten. Draai de plaat ondersteboven en laat de ECU 20 minuten stollen bij 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie voorzichtig 250 microliter voorverwarmd hypofyseorganoïde medium toe, aangevuld met 10-micromolaire ROCK-remmer.

Verander om de twee tot drie dagen het medium zonder ROCK-remmer gedurende 10 tot 14 dagen totdat de organoïden volgroeid zijn. Om de organoïden te passeren, zuigt u eerst het medium voorzichtig op en voegt u 400 microliter ijskoude geavanceerde DMEM / F-12 toe om de ECM te desintegreren. Verzamel vervolgens de organoïden in een microcentrifugebuis.

Was de put met 400 microliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 200 maal G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en voeg 400 microliter voorverwarmd TrypLE Express-enzym toe.

Meng door de buis meerdere keren om te keren en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg 400 microliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12 toe. Centrifugeer vijf minuten bij 200 maal G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant.

Resuspend de pellet met 100 microliter ijskoude geavanceerde DMEM/F-12. Beperk een P-200-punt en gebruik de punt om de organoïden te dissociëren door krachtig te pipetteren totdat organoïdefragmenten zijn verkregen. Voeg 800 microliter geavanceerde DMEM/F-12 toe.

Centrifugeer 10 minuten bij 190 maal G bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Om de organoïden te passeren, resuspendeert u de pellet in een voldoende volume geavanceerde DMEM / F-12 en voegt u ECM toe in een verhouding van 30: 70. Meng goed.

Blijf de organoïden zaaien en kweken zoals beschreven in het teksthandschrift. Gedissocieerde afzonderlijke cellen van de voorkwab werden gezaaid in ECM en gekweekt in hypofyseorganoïde medium. 14 dagen na het zaaien waren de organoïden volledig ontwikkeld en bereikten ze een diameter van maximaal 500 micrometer.

In dit stadium vertoonden de organoïden cystische morfologie met een epitheliale laag die een lumen omsluit. Het wordt niet aanbevolen om de putten te gebruiken waarin dichte structuren verschijnen na groei. Voor passageing werden organoïde fragmenten gebruikt voor het zaaien.

Zeven dagen na het passeren werd gunstige organoïde hergroei waargenomen met cystische structuren. Dichte organoïden moeten worden weggegooid, omdat de ongunstige organoïden de cultuur kunnen overnemen. Immunofluorescentiekleuringsanalyse voor de epitheliale markers E-cadherine en cytokeratinen 8 en 18 bevestigde het epitheliale karakter van de organoïden.

Expressie van hypofyse stamcelmarkers Sox2 en Trop2 toonde de stengelheid aan, en hypofyse-specifieke marker LHX3 toonde hypofysefenotype van de organoïden. Expressie van de marker Ki67 toonde aan dat de organoïde-constitutieve cellen zich in een proliferatieve toestand bevinden. RTQ PCR-analyse toonde een hogere expressie van stengelheidsmarkers in de organoïden dan in de voorkwab, zelfs na meerdere passages, wat de verrijking van stamcellen valideerde.

Het is belangrijk om het juiste aantal afzonderlijke cellen in de ECM-koepel te plaatsen bij de eerste zaaiing, en bij het passeren van de organoïden moet men onthouden om fragmenten opnieuw te zaaien en geen enkele cellen.