Name: Dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Leer een dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteracties met lichtmicroscopie. Deze techniek identificeert schimmelstructuren en celwanddefecten bij koffieplanten zonder dure apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Hudson W.P. de Carvalho bedanken voor de steun om dit werk te ontwikkelen. De auteurs zijn ook het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' dankbaar voor het leveren van de lichtmicroscopiefaciliteit. De auteurs bedanken Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício voor het leveren van laesies aan het plantmateriaal.

1. Bereiding van de bufferoplossing en reagentia
<ol><li>Bereid 2 M cacodylaatbuffer door 4,28 g natriumcacodylaat toe te voegen aan 100 ml gedestilleerd water en stel de pH in op 7,25 met 0,2 N HCl.</li>
	<li>Bereid 100 ml van de Karnovsky-fixatieoplossing door 10 ml 25% waterig glutaaraldehyde, 10 ml 10% waterig formaldehyde, 25 ml 2 m cacodylaatbuffer en 0,5 ml 0,5 m CaCl2 26 te mengen. Vul het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water. OPMERKING: De oplossing kan 6 maanden in een koelkast worden bewaard. LET OP: De cacodylaatbufferoplossing is giftig; behandel daarom de fixerende oplossing in een zuurkast of een open ruimte. Vermijd het inademen van de oplossingsdampen en draag handschoenen tijdens het hanteren.</li>
	<li>Bereid een waterige Hoagland-voedingsoplossing door het volgende te mengen: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO 4.7H2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 en 36 mM FeSO 4,7H2O als ijzer-EDTA (ethyleendiamine tetra-azijnzuur)27.</li>
</ol>2. Plantenmonsters en schimmelinenting
OPMERKING: Voor experimenten op bladeren die zijn aangetast door koffieroest, vijf zaailingen van 2 maanden oude Koffie arabica cv. Catuaí werden geteeld en bewaard in een kas in het Center of Nuclear Energy in Agriculture (CENA) van de Universiteit van São Paulo, Piracicaba, staat São Paulo, Brazilië.
<ol><li>Kweek koffieplanten in plastic potten van 500 ml gevuld met waterige Hoagland-voedingsoplossing (pH van ~ 5,5) gedurende 4 maanden in een groeikamer die op 27 ± 3 ° C wordt gehouden met een fotoperiode van 12 uur gemaakt door LED-lampen bij de fotonenflux van 250 μmol fotonen s-1 m-2. Vervang de Hoagland voedingsoplossing elke week gedurende 4 maanden.</li>
	<li>Ent vier geëxpandeerde bladeren van vijf planten op hun abaxiale oppervlakken met 1 x 103 H. vastatrix uredospores volgens de in referentie28 beschreven methode. Houd de planten na inenting 48 uur in het donker door ze af te dekken met een zwarte plastic zak. Oogst de laesies 30 dagen na inenting.</li>
	<li>Oogst karakteristieke laesies veroorzaakt door Cercospora coffeicola van Coffea arabica cv. Obatã-fabrieken (coördinaten: -22.906506126269942, -47.015075902025266) in het Biologisch Instituut, Campinas, staat São Paulo, Brazilië. Voordat u het monster verwerkt, analyseert u de laesies in een stereomicroscoop om de aanwezigheid van koffie C. coffeicola conidia te verifiëren. Monteer vervolgens enkele dia's met de conidia om de ziekte-etiologie te bevestigen22.</li>
</ol>3. Monsteroogst, fixatie en uitdroging
<ol><li>Oogst met behulp van een scalpel en pincet een monster van ~ 10 mm2 bladeren in het middelste gebied van de laesie (gele vlekken; Figuur 1) en dompel het onder in 30 ml Karnovsky fixatieve oplossing (figuur 1 en figuur 2A). De fixatiestap kan 48 uur in een koelkast plaatsvinden.</li>
	<li>Onderwerp het bladmonster gedurende ten minste vier keer aan een laag vacuüm (500-600 mBar) met behulp van een oliepomp gedurende 15 minuten elk om de permeabiliteit van de fixerende oplossing in het bladweefsel te vergroten. Voer deze stap uit met monsterrotatie (figuur 1).</li>
	<li>Was het bladmonster na fixatie driemaal in 0,5 M cacodylaatbuffer (pH 7,2) verdund in gedestilleerd water gedurende 5 minuten en breng het vervolgens over in een gesorteerde ethanolische reeks (30%, 50%, 70%, 90% (2x) en 100% (2x)) gedurende 15 minuten bij elke ethanolconcentratie (figuur 1 en figuur 2B).</li>
</ol>4. Historesin inbeddingsprocedure
<ol><li>Breng de monsters geleidelijk over naar glycolmethacrylaat (GMA) in drie stappen, volgens de instructies van de fabrikant. Maak eerst oplossing A door het GMA-poeder (1 g) te mengen met 100 ml basishars (historesinekit; Tabel met materialen) onder magnetische agitatie en volg vervolgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Dompel de monsters onder in 1:2 Oplossing A: 100% ethanol gedurende 3 uur.</li>
		<li>Dompel de monsters onder in 1:1 Oplossing A: 100% ethanol gedurende 3 uur.</li>
		<li>Dompel de monsters gedurende 2-4 dagen onder in een pure basishars. Tijdens deze stap onderwerpt u de monsters ten minste vier keer per dag aan een laag vacuüm gedurende 15 minuten gevolgd door rotatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Polymerisatie
OPMERKING: Het polymerisatieproces vereist 1,2 ml plastic mallen, basishars en verharder (zie Tabel met materialen voor de details van de commerciële kit).
<ol><li>Meng 15 ml oplossing A (stap 4.1) met 1 ml van de verharder in een bekerglas met rotatie gedurende 2 minuten om de polymerisatieoplossing (oplossing B) te produceren.</li>
	<li>Plaats 1,2 ml van de polymerisatieoplossing (oplossing B) in plastic mallen. Breng met behulp van een houten prikeel de laesiebladmonsters over van pure basishars naar oplossing B (figuur 2C). Vermijd het gebruik van een pincet, omdat deze weefselverplettering kunnen veroorzaken.</li>
	<li>Zorg ervoor dat bladmonsters snel loodrecht op de kunststof mallen worden georiënteerd, omdat oplossing B binnen 5 minuten snel stroperig wordt. Meer dan één laesiebladmonster kan in een enkele mal worden geplaatst. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de bovenstaande stap meerdere keren te oefenen voordat u veel monsters aanvraagt. Wanneer er veel monsters zijn, is de polymerisatietijd anders tussen de mallen en kan de loodrechte oriëntatie van de bladmonsters moeilijk te bereiken zijn.</li>
	<li>Wanneer de loodrechte oriëntatie van de bladmonsters is bereikt, wacht u 30 minuten en brengt u de plastic mal over naar een plastic of glazen kamer met silicagel om vocht te voorkomen. Wacht 2-3 uur voor polymerisatie.</li>
	<li>Zodra de hars en het bladmonster na de periode van 2-3 uur zijn gepolymeriseerd, maakt u het resulterende blok los van de plastic mal door de blokbasis te schuren met een schuurvijl. Lijm het blok vervolgens op een stuk hout (figuur 2D).</li>
</ol>6. Doorsnede
<ol><li>Snijd met behulp van een roterende microtoom uitgerust met stalen messen van 8 cm (figuur 2E) het blok in secties van 5 μm dik. Plaats de secties op glazen platen bedekt met gedestilleerd water. Breng de dia's met de over water zwevende secties over op een hete plaat bij 40 °C om te drogen en de hechting van de secties op de glasplaten te bevorderen.</li>
	<li>Label na het drogen (figuur 2F) de glasplaten met de blokreferentienaam en het dianummer.</li>
</ol>7. Dubbel kleurproces
<ol><li>Bedek de secties met 2 ml 5% katoenblauw in lactofenol (40% glycerol, 20% fenol en 20% melkzuur in water) en verwarm ze op een hete plaat bij 45 °C gedurende 5 minuten (figuur 3A).</li>
	<li>Verwijder de overtollige kleurstof door de dia driemaal te wassen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (figuur 3B-D).</li>
	<li>Kleur met 2 ml 0,01% rutheniumrood in water gedurende 1 minuut (figuur 3E).</li>
	<li>Verwijder de overtollige kleurstof door de plaat driemaal te wassen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (figuur 3F,G).</li>
	<li>Doe een druppel gedestilleerd water over de secties en bedek de secties met een afdekplaat van 24 mm x 60 mm voor het uitvoeren van lichtmicroscopieanalyse.</li>
</ol>

<ol><li>deBary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+development+of+some+parasitic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Natural+Sciences.+Botany+and+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Research on the development of some parasitic fungi.</a> Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).</li>
<li>Mangin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+Peronospores%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Natural+History+Society+of+Autun%22%5BJournal%5D)">Research on the Peronospores.</a> Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).</li>
<li>Underwood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall%3A+a+dynamic+barrier+against+pathogen+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).</li>
<li>Hückelhoven, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-associated+mechanisms+of+disease+resistance+and+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility.</a> Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).</li>
<li>Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Callose-mediated+resistance+to+pathogenic+intruders+in+plant+defense-related+papillae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).</li>
<li>Chowdhury, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+accumulation+of+callose%2C+arabinoxylan+and+cellulose+in+nonpenetrated+versus+penetrated+papillae+on+leaves+of+barley+infected+with+Blumeria+graminis+f.+sp.+Hordei%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei.</a> New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).</li>
<li>Caffall, K. H., Mohnen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function%2C+and+biosynthesis+of+plant+cell+wall+pectic+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).</li>
<li>Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarpita%2C+NC+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Plants.%2C+2nd+Edition%22">Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition</a>. , Wiley Blackwell. New York. 45(2015).</li>
<li>Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+esterification+of+pectin+plays+a+role+during+plant-pathogen+interactions+and+affects+plant+resistance+to+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases.</a> Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).</li>
<li>Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectoplate%3A+the+simultaneous+phenotyping+of+pectin+methylesterases%2C+pectinases%2C+and+oligogalacturonides+in+plants+during+biotic+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).</li>
<li>Lionetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+pectin+methylesterase+inhibitors+protect+cell+wall+integrity+for+Arabidopsis+immunity+to+Botrytis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis.</a> Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).</li>
<li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haustorium+sheath+formation+in+cowpea+leaves+immune+to+rust+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection.</a> Phytopathology. 61, 383-388 (1971).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+resistance+to+the+main+diseases%3A+leaf+rust+and+coffee+berry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease.</a> Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).</li>
<li>An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+effects+on+root+cell+wall+composition+and+ion+contents+in+two+soybean+cultivars+under+salinity+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress.</a> Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+smut%3A+shedding+light+on+the+development+of+the+whip-shaped+sorus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus.</a> Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).</li>
<li>Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytes+versus+biotrophic+and+necrotrophic+pathogens-are+fungal+lifestyles+evolutionarily+stable+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits.</a> Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Avelino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coffee+rust+crises+in+Colombia+and+Central+America+%282008-2013%29%3A+impacts%2C+plausible+causes+and+proposed+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions.</a> Food Security. 7, 303-321 (2015).</li>
<li>Zambolim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+management+of+coffee+leaf+rust+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Current status and management of coffee leaf rust in Brazil.</a> Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).</li>
<li>Swiderska-Burek, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytopathogenic+Cercosporoidfungi-from+taxonomy+to+modern+biochemistry+and+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555(2020).</li>
<li>Andrade, C. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+and+defense+response+of+two+distinct+symptoms+of+Cercospora+leaf+spot+in+coffee+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytoparasitica%22%5BJournal%5D)">Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves.</a> Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).</li>
<li>Zambolim, L. Coffee tree diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZambolim%2C+L+%22Handbook+of+Phytopathology%3A+Diseases+of+cultivated+plants.+5th+ed%22">Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed</a>. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810(2016).</li>
<li>Castaño, A. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%5BTitle%5D)+AND+%22Informative+report+Cenicaf%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Coffee rust.</a> Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).</li>
<li>Echandi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%2C+caused+by+the+fungus+Cercospora+coffeicola%5BTitle%5D)+AND+%22Turrialba%22%5BJournal%5D)">Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola.</a> Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).</li>
<li>Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+of+Cercospora+coffeicola+on+coffee+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf.</a> Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22College+of+Agriculture%2C+Agricultural+Experiment+Station%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347(1950).</li>
<li>Eskes, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Coffee+rust%3A+epidemiology%2C+resistance+and+management%22%5BJournal%5D)">Resistance.</a> Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171(1989).</li>
<li>Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+aspects+of+the+plant-rust+fungus+interface+during+the+compatible+interaction+Coffea+arabica+%28cv.+Caturra%29-Hemileia+vastatrix+%28race+III%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III).</a> International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).</li>
<li>Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+of+infection+and+colonization+of+Pseudocercospora+kaki+in+persimmon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves.</a> Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%3A+Biological+Applications%2C+Vol.+1%22">Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1</a>. , International Publishing. Berkeley Heights. 564(1981).</li>
<li>Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaiva%2C+EAS+%22Light+microscopy%3A+methods+and+protocols%22">Light microscopy: methods and protocols</a>. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+staining+technique+for+fungal-infected+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">New staining technique for fungal-infected plant tissues.</a> Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).</li>
<li>Schuller, A., Ludwig-Müller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+to+detect+the+clubroot+pathogen+Plasmodiophora+brassicae+during+its+complex+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle.</a> Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).</li>
<li>Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+evidence+of+concomitant+sexual+and+asexual+reproduction+of+Elsino%C3%AB+ampelina+in+grapevine+under+subtropical+climate%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517(2020).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarques%2C+JPR+%22Manual+of+Techniques+Applied+to+Plant+Histopathology%22">Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology</a>. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140(2021).</li>
<li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).</li>
<li>Chesters, C. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+methods+of+using+cotton+blue+as+a+mycological+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Three methods of using cotton blue as a mycological stain.</a> Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).</li>
<li>Macedo, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+of+Techniques+in+Plant+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Feira+de+Santana%3A+State+University+of+Feira+de+Santana%22%5BJournal%5D)">Manual of Techniques in Plant Histology.</a> Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68(1997).</li>
<li>Lecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+lactophenol+cotton+blue+slide+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts.</a> Community Eye Health Journal. 12 (30), 24(1999).</li>
<li>Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+in+wool+dyeing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+of+Dyers+and+Colourists%22%5BJournal%5D)">Lactic acid in wool dyeing.</a> Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103(1895).</li>
<li>Chamberlain, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChamberlain%2C+CJ+%22Methods+in+Plant+Histology%22">Methods in Plant Histology</a>. , The University of Chicago Press. Chicago. 349(1932).</li>
<li>Sterling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-structure+of+ruthenium+red+and+stereochemistry+of+its+pectin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain.</a> American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium+red+and+violet.+1.+Chemistry%2C+purification%2C+methods+of+use+for+electron+microscopy+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action.</a> The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).</li>
<li>Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckeridge%2C+MS+%22Plant+Physiology%22">Plant Physiology</a>. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Het huidige werk introduceert een alternatieve dubbelkleuring histochemische test om de pectinesamenstelling van celwanden te onderzoeken die haustoria inkapselt in een biotroof pathosysteem. Het doel is ook om de effectiviteit aan te tonen van de methode om necrotrofe schimmels en celwandveranderingen te detecteren die hierdoor worden veroorzaakt. Hier kan pectine van koffieparenchymcelwanden zowel de nek als het haustorium van de roestschimmel Hemileia vastatrix inkapselen. Silva et al. hebben ook inkapseling ...

Celwandafweermechanismen in planten zijn cruciaal om schimmelinfecties te beperken. Studies hebben veranderingen in celwanddikte en samenstelling gemeld sinds de19e eeuw 1,2. Deze veranderingen kunnen worden geïnduceerd door een schimmelpathogeen dat de vorming van een papilla stimuleert, waardoor schimmels de cel niet binnendringen of kunnen worden gebruikt om de schimmeldraden in te kapselen om de protoplast van de gastheercel te isoleren van de schimmelhaustoria. De productie van een dynamische celwandbarrière (d.w.z. papillen en een volledig ingekapseld haustorium) is belangrijk om de resistentie van planten te bevorderen3. Histopathologische studies op schimmelgerelateerde ziekten hebben het optreden van deze mechanismen onderzocht en hebben de celwandpolymeren, cellulose, hemicellulose (arabinoxylanen) en callose beschreven als resistentiemechanismen tegen schimmelaantasting 4,5,6,7.
De celwand is de eerste barrière tegen micro-organismen, waardoor de interactie tussen plant en schimmel wordt aangetast. Pectische polysacchariden vormen de celwand en zijn goed voor ongeveer 30% van de celwandsamenstelling in primaire cellen van eudicotplanten waarin homogalacturonanen het meest voorkomende polymeer zijn (ongeveer 60%)8. De Golgi scheidt complexe pectineverbindingen af waaruit de galacturonzuurketens bestaan, die al dan niet gemethyleerd kunnen worden 8,9. Sinds 2012 heeft de literatuur erop gewezen dat de mate van pectinemethylverestering van cruciaal belang is voor het bepalen van de compatibiliteit tijdens infectie door microbiële pectische enzymen 10,11,12. Er zijn dus protocollen nodig om de aanwezigheid en distributie van pectische verbindingen in plantschimmelpathosystemen te verifiëren.
Verschillende technieken zijn gebruikt om de inkapseling van papillen of haustoria te detecteren. De gebruikte referentiemethoden zijn transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van vast weefsel en lichtmicroscopie van levende en vaste weefsels. Met betrekking tot TEM hebben verschillende studies de structurele rol van celwandacposities in schimmelresistentieaangetoond 13,14,15,16, en dat het gebruik van lectines en antilichamen een ingewikkelde methode is om koolhydraatpolymeren te lokaliseren16. Studies tonen echter aan dat lichtmicroscopie een belangrijke benadering is en dat de histochemische en immunohistochemische hulpmiddelen een beter begrip van de samenstelling van papillen en haustorium-omhullingmogelijk maken 6,7.
Pathogene schimmels vertonen twee hoofdtypen levensstijlen: biotrofisch en necrotroof. Biotrofe schimmels zijn afhankelijk van levende cellen voor hun voeding, terwijl necrotrofe schimmels de gastheercellen doden en vervolgens in de dode weefsels leven17. In Latijns-Amerika is koffiebladroest, veroorzaakt door de schimmel Hemileia vastatrix, een belangrijke ziekte in koffiegewassen18,19. Hemileia vastatrix vertoont een biotroof gedrag en, onder de structurele veranderingen waargenomen bij resistente koffiesoorten of cultivars, een overgevoeligheidsrespons, afzetting van callose, cellulose en lignine op de celwanden, evenals celhypertrofie14 zijn gemeld. Voor zover de auteurs weten, rapporteert de literatuur geen informatie over het belang van pectine in koffieroestbestendigheid. Aan de andere kant richten necrotrofe schimmels die cercosporiose veroorzaken zich op pectine via een reeks enzymen die geassocieerd zijn met celwandafbraak, zoals pectinasen en polygalacturonase20. Cercosporiose in koffie, veroorzaakt door de schimmel Cercospora coffeicola is ook een grote bedreiging voor koffiegewassen21,22. Deze schimmel veroorzaakt necrotische laesies in zowel bladeren als bessen. Na penetratie koloniseert C. coffeicola plantenweefsels via intracellulaire en intercellulaire routes 23,24,25.
Het huidige protocol onderzoekt de aanwezigheid van schimmelstructuren en pectine op celwanden. Dit protocol is nuttig om de plantrespons geassocieerd met pectine (gekleurd met rutheniumrode kleurstof, die specifiek is voor zure groepen polyuronzuren van pectine), geïnduceerd door de gastheer in een biotrofe interactie met schimmel te identificeren. Het helpt ook om het effect van necrotrofe schimmels op de afbraak van pectische celwanden te verifiëren. De huidige resultaten geven aan dat de dubbele kleuringsmethode effectief is om structuren en de voortplantingsfase van schimmels te onderscheiden.

<table><tbody><tr><td>Blades DB80 HS</td><td>Leica</td><td>14035838383</td><td>Sectionering</td></tr><tr><td>Cacodylate buffer</td><td>EMS</td><td># 11652</td><td>Fixatie</td></tr><tr><td>Cotton Blue Lactophenol</td><td>Metaqu&iacute;mica</td><td>70SOLSIG024629</td><td>Kleuring</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>EMS</td><td>#15712</td><td>Fixatie</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>#16216</td><td>Fixatie</td></tr><tr><td>Historesin Kit</td><td>Technovit /EMS</td><td>#14653</td><td>Historesin voor inbedding</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Dubesser</td><td>SSCD25X30-110V</td><td>Kleuring</td></tr><tr><td>Microscopie</td><td>Zeiss</td><td>#490040-0030-000</td><td>Beeldvastlegging</td></tr><tr><td>Microtome (Leica RM 2540)</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1 14050238005</td><td>Sectionering</td></tr><tr><td>Plastic molding cup tray</td><td>EMS</td><td>10176-30</td><td>Kleuring</td></tr><tr><td>Ruthenium red</td><td>LABHouse</td><td>#006004</td><td>Kleuring</td></tr><tr><td>Software Axion Vision</td><td>Zeiss</td><td>#410130-0909-000</td><td>Beeldvastlegging</td></tr><tr><td>Vaccum pump</td><td>Prismatec</td><td>131 TIPO 2 V.C.</td><td>Fixatie</td></tr></tbody></table>

dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteractie

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plantencellen gebruiken verschillende structurele mechanismen, constitutief of inducerend, om zichzelf te verdedigen tegen schimmelinfecties. Inkapseling is een efficiënt induceerbaar mechanisme om de schimmel haustoria te isoleren van de protoplast van de plantencel. Omgekeerd is pectine, een van de polymere componenten van de celwand, een doelwit van verschillende pectolytische enzymen in necrotrofe interacties. Hier wordt een protocol gepresenteerd om pectine en schimmeldraden te detecteren door middel van optische microscopie. De pectinerijke inkapseling in de cellen van koffiebladeren die zijn geïnfecteerd door de roestschimmel Hemileia vastatrix en de mesofylcelwandmodificatie geïnduceerd door Cercospora coffeicola worden onderzocht. Laesiebladmonsters werden gefixeerd met de Karnovsky-oplossing, gedehydrateerd en ingebed in glycolmethacrylaat gedurende 2-4 dagen. Alle stappen werden gevolgd door vacuümpompen om lucht in de intercellulaire ruimtes te verwijderen en het inbeddingsproces te verbeteren. De ingebedde blokken werden verdeeld in 5-7 μm dikke secties, die werden afgezet op een glazen glijbaan bedekt met water en vervolgens verwarmd bij 40 °C gedurende 30 minuten. Vervolgens werden de dia's dubbel gekleurd met 5% katoenblauw in lactofenol om de schimmel te detecteren en 0,05% rutheniumrood in water om pectine (zure groepen polyuronzuren van pectine) te detecteren. Schimmel haustoria van Hemileia vastatrix bleken te zijn ingekapseld door pectine. Bij koffie cercosporiose vertoonden mesofylcellen oplossing van celwanden en werden intercellulaire schimmeldraden en conidioforen waargenomen. De hier gepresenteerde methode is effectief om een pectine-geassocieerde respons in de interactie tussen plant en schimmel te detecteren.

De katoenblauwe lactofenolkleuring op de GMA-ingebedde sectie onthulde de aanwezigheid van verschillende schimmelstructuren tussen en in koffie mesofylcellen in zowel biotrofe als necrotrofe schimmelinteracties.
In het biotrofe pathosysteem verschijnen, wanneer gekleurd met behulp van de dubbele kleuringsmethode, Hemileia vastatrix-schimmeldraden met celwanden en het dichte protoplastgehalte in donkerblauw in zowel sponsachtig als palissadeparenchym (figuur 4A</st...

Dit protocol beschrijft een microscopische methode om pectine te detecteren in koffie-schimmel interactie.

Dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteractie

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Dit protocol is belangrijk omdat het het mogelijk maakt om de interactie tussen plant en schimmel te identificeren. Naast het kleuren van de pectine, toont het ook defecten aan het pathogene celwandpolymeer en maakt het de identificatie van schimmelstructuren mogelijk. Deze eenvoudige en ongecompliceerde techniek kan worden uitgevoerd met behulp van lichtmicroscopie en vereist geen dure apparatuur zoals scanning elektronenmicroscoop.Bovendien is het een snelle techniek die een uitstekend onderscheid van plantenstructuren verkrijgt voor histopathologische studies. De techniek identificeert de interactie tussen plant en schimmel. Daarom werkt het samen om de ziekten te diagnosticeren die worden veroorzaakt door biotrofe en necrotrofe schimmels zoals koffieroest en cercosporiose.Om te beginnen, oogst en ongeveer 10 vierkante millimeter bladmonster in het middelste gebied van de laesie met behulp van een scalpel en pincet, en dompel het onder in 30 milliliter Karnovsky fixatieve oplossing. Onderwerp het bladmonster gedurende 15 minuten aan een laag vacuüm van 500 tot 600 millibar met behulp van een oliepomp, ten minste vier keer om de permeabiliteit van de fixerende oplossing in het bladweefsel te vergroten. Was het bladmonster na fixatie driemaal in 0,5 M cacodylaatbuffer verdund in gedestilleerd water gedurende vijf minuten en breng het vervolgens gedurende 15 minuten bij elke ethanolconcentratie over in een gesorteerde ethanolische serie.Om de monsters geleidelijk over te zetten naar glycolmethacrylaat, maakt u oplossing A door de ene gram glycolmethacrylaatpoeder te mengen met 100 milliliter basishars onder magnetische agitatie. Dompel de monsters vervolgens gedurende drie uur onder in verhouding één tot twee van oplossing A en 100% ethanol. Dompel de monsters gedurende drie uur onder in verhouding één op één voor oplossing A: 100% ethanol en dompel ze vervolgens twee tot vier dagen onder in een zuivere basishars.Onderwerp het monster ten minste vier keer per dag gedurende 15 minuten aan een laag vacuüm, gevolgd door rotatie. Meng 15 milliliter oplossing A met één milliliter van de verharder in een bekerglas met rotatie gedurende twee minuten om de polymerisatieoplossing B te produceren. Breng met behulp van een houten prik de laesiebladmonsters over van pure basishars naar oplossing B en vermijd het gebruik van een pincet omdat deze weefselverplettering kunnen veroorzaken.Zorg ervoor dat bladmonsters snel loodrecht op de plastic mallen worden georiënteerd, omdat oplossing B snel stroperig wordt. Wanneer de loodrechte oriëntatie van de bladmonsters is bereikt, wacht u 30 minuten en brengt u de plastic mal over naar een plastic of glazen kamer met silicagel om vocht te voorkomen. Zodra de hars en het bladmonster na twee tot drie uur zijn gepolymeriseerd, maakt u het resulterende blok los van de plastic mal door de blokbasis te schuren met een schuurvijl.Lijm het blok vervolgens op een stuk hout. Snijd het blok in vijf micrometer dikke secties met behulp van een roterend microtoom uitgerust met acht centimeter stalen messen. Plaats de secties op glazen platen bedekt met gedestilleerd water.Breng vervolgens de dia's over op een hete plaat om te drogen bij 40 graden Celsius en bevorder de hechting van de secties op de glasplaten. Label na het drogen de glasplaten met de blokreferentienaam en het dianummer. Bedek de secties met twee milliliter 5% katoenblauw in lactofenol en verwarm ze gedurende vijf minuten op een hete plaat bij 45 graden Celsius.Verwijder de overtollige kleurstof door de dia drie keer te wassen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water. Kleur het met twee milliliter van 0,01% rutheniumrood in water gedurende één minuut. Verwijder de overtollige kleurstof door de dia drie keer te wassen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water.Leg een druppel gedestilleerd water over de secties en bedek de secties met een afdekplaat voor het uitvoeren van lichtmicroscopieanalyse. In de dubbele kleuringsmethode verscheen Hemileia vastatrix-hyfen met celwanden en het dichte protoplastengehalte donkerblauw in zowel sponsachtig als palissadeparenchym. Ook de haustoriummoedercel en de haustoria vertoonden een donkerblauwe kleur.De tegenkleuring met rutheniumrood definieerde duidelijk de schimmelverdeling in de intercellulaire ruimten. Tijdens de interactie brak hemileia vastatrix haustorium moedercel de celwand van de gastheer en ontwikkelde een haustoriale nek omringd door pectische verbindingen. De pectinerijke roze-rood gekleurde inkapseling van de haustoriale hals kan haustoriale vorming niet voorkomen.In sommige gevallen omhulde de pectinerijke inkapseling het haustorium onvolledig. En in sommige gevallen is het haustorium volledig ingekapseld. De pectinerijke celwand behoudt de integriteit aan de laesiegrens, waar de schimmel niet aanwezig is.De dubbele kleuringsmethode toonde de aanwezigheid van intercellulaire schimmeldraden aan. In interactiezones leken pectinecelwanden hun integriteit te verliezen als gevolg van ontbinding. Voortplantingsstructuren zoals conidia werden gevonden in de adaxiale epidermis.Cercospora coffeicola hyfen werden gevonden in de substomatische kamer als krullende structuren, en het palissadeparenchym in het laesiegebied lijkt celwandlysis te ondergaan. Vermijd het gebruik van een pincet, omdat deze weefselverplettering kunnen veroorzaken. Verdere histopathologische studies naar roest, anthracnose, cercosporiose, smuts en andere biotrofe, hemibiotrofe en necrotrofe plant-schimmel interacties moeten worden uitgevoerd om het mogelijke gebruik van deze techniek in verschillende pathosystemen te onderzoeken.

double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a double staining method using ruthenium red and lactophenol cotton blue to visualize pectins and chitins during plant-fungus interactions in a coffee rust plant. The procedure helps understand plant defense mechanisms during fungal infections.

Double-Staining Method: A Technique to Visualize Plant-Fungus Interactions Using Ruthenium Red and Lactophenol Cotton Blue

This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

This video demonstrates an immunostaining technique to localize arabinogalactan proteins (AGPs) and pectins in plant tissues. Fixed and resin-embedded plant tissue sections are stained with AGP- and pectin-specific primary and fluorescent secondary antibodies and a cellulose-binding fluorescent dye to reveal their tissue-specific colocalization in the cell wall.

Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in Plant Tissue

De samenstelling van de plantencelwand varieert tussen weefselsoorten en kan lignine, cellulose, hemicellulosen en pectine omvatten. Er zijn verschillende kleuringstechnieken ontwikkeld om verschillen op celtypeniveau te visualiseren. Dit artikel is een samenstelling van veelgebruikte celwandkleuringstechnieken.

Histochemische kleuring van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Secundaire celwand Elements

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia's. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.

Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

Het protocol beschrijft hier de methoden voor de beoordeling van de arbusculaire mycorrhiza kolonisatiepatronen en strategie in wortels voor twee soorten: Zea mays en Festuca rubra. Het gebruik van de MycoPatt-methode maakt de berekening van parameters, de conversie van mycorrhizastructuren in digitale gegevens en het in kaart brengen van hun werkelijke positie in wortels mogelijk.

Mycorrhiza-kaarten als hulpmiddel om kolonisatiepatronen en schimmelstrategieën in de wortels van Festuca rubra en Zea mays te verkennen

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Dit rapport beschrijft de fundamentele methoden die worden gebruikt om de eencellige streptofytalg, Penium margaritaceum, te kweken en experimenteel te manipuleren. Het biedt ook fundamentele protocollen voor op microscopie gebaseerde beeldvorming, waaronder het labelen van levende cellen met monoklonale antilichamen en andere fluorescerende sondes en scanning-elektronenmicroscopie.

Experimentele screeningprotocollen, immunocytochemie en op microscopie gebaseerde beeldvormingstechnieken voor penium margaritaceum

Leer een dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteracties met lichtmicroscopie. Deze techniek identificeert schimmelstructuren en celwanddefecten bij koffieplanten zonder dure apparatuur.

Dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteractie

Meer video's verkennen