Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

We ontwikkelden een eenvoudige methode om robuuste en progressieve glaucoomdegeneratie te induceren op basis van tijdelijke intraoculaire drukverhoging. Dit is een unieke kans om de belangrijkste punten van de pathofysiologie van glaucoom te bestuderen. Dit is een gemakkelijk te leren, niet-invasief, goedkoop en zeer reproduceerbaar model dat in vivo functieanalyse en experimentele ontwerpen op korte termijn mogelijk maakt met een beperkt aantal dieren voor elk experiment.

Het netvlies en de oogzenuw zijn beoordeelbare delen van het centrale zenuwstelsel, dus het modelleren van de progressieve aantasting van deze structuren kan waardevolle inzichten opleveren in andere neurodegeneratieve aandoeningen. Om de baseline intraoculaire druk, of IOP, van zowel experimentele als contralaterale controleogen te meten, plaatst u de verdoofde rat in een ventrale decubituspositie op het tafelblad, zodat het hoornvliesoppervlak gemakkelijk toegankelijk is voor de punt van de tonometer. Plaats de punt van de tonometer zo dat deze de centrale hoornvlieszone loodrecht lichtjes raakt.

Verkrijg vervolgens de meting door op de meetknop te drukken. Plaats de rat vervolgens in een lichte laterale decubituspositie onder een stereomicroscoop en inspecteer het experimentele oog met een vergroting van 40 keer. Houd tijdens de procedure het contralaterale controleoog gesmeerd door een druppel carmellosenatrium of natriumhyaluronaat in te druppelen.

Duw vervolgens met behulp van een gebogen pincet de experimentele oogbol voorzichtig naar voren om het vaatstelsel rond 360 graden van de limbus bloot te leggen. Vervolgens, met de andere hand, met behulp van een oogheelkundige cauterisatie bij lage temperatuur, de bloedvaten rondom het hoornvlies voorzichtig dichtschroeien. Pas op dat u de periferie van het hoornvlies niet dichtschroeit.

Bevestig het succes van de chirurgische ingreep door het observeren van het verschijnen van kleine cirkelvormige sporen van cauterisatie op de sclerale limbus, de vernietiging van limbale vasculatuur en pupilverwijding in het geopereerde oog. Controleer na de operatie de onmiddellijke postoperatieve IOP in beide ogen, zoals eerder aangetoond. Breng vervolgens een druppel oogheelkundig prednisolonacetaat aan op het voorste oppervlak van het experimentele oog.

Vervang het na 40 seconden door een oogheelkundige antibiotische zalf. Breng een dagelijkse klinische follow-up van het experimentele oog aan met actuele medicatie die bestaat uit een niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel en antibiotische zalf. Voor optomotorische responsanalyse plaatst u de rat ter gewenning op een platform dat is gebouwd met vier computermonitoren in een vierhoek.

Houd de rode dradenkruiscursor op het videoframe tussen de ogen van de vrij bewegende rat, omdat deze het midden van de virtuele cilinder aangeeft. Observeer de optomotorische respons die bestaat uit een reflexieve tracking van de kop en nek van de rat, uitgelokt door de roterende gradaties. Introduceer in eerste instantie een stimulus met een lage ruimtelijke frequentie en verhoog vervolgens de frequentie geleidelijk totdat de volgbeweging niet wordt opgemerkt.

Om het patroon elektroretinogram vast te leggen, plaatst u na het verdoven van de rat voorzichtig de actieve elektrode aan de temporale periferie van het hoornvlies. Steek bovendien de referentie-elektrode in het onderhuidse weefsel van de ipsilaterale temporale canthus en de aardelektrode in een van de achterpoten. Plaats vervolgens de rat op 20 centimeter van het stimulusscherm, bewaak de signaalbasislijn en start de acquisitie door op de analyseknop op het acquisitiesysteem te drukken.

Nadat u het netvlies hebt geïsoleerd, brengt u het over in een kweekplaat met 24 putjes die PBS van één milliliter bevat, waarbij u het binnenste netvlies naar boven houdt. Permeabiliseer het weefsel door te wassen met een 0,5% niet-ionogene oppervlakteactieve stof verdund in PBS. Incubeer vervolgens het weefsel en de blokkerende oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.

Bereid tijdens de incubatie Brn-3a primaire antilichaamoplossing en bewaar deze bij vier graden Celsius. Na weefselblokkering, incubeer de netvliezen in 200 microliter primaire antilichaamoplossing bij vier graden Celsius gedurende 72 uur met zacht schudden. Was vervolgens het weefsel met PBS.

Incubeer het weefsel in 200 microliter van de secundaire antilichaamoplossing gedurende twee uur bij kamertemperatuur en vervolgens gedurende 10 minuten met nucleaire tegenkleuringsoplossing voor fluorescerende kernkleuring. Breng na drie PBS-wasbeurten het netvlies over op een glazen microscoopglaasje met behulp van twee kleine borstels die de glaskant naar boven houden. Plaats het dorsale retinale kwadrant omhoog op het microscoopglaasje.

Breng ten slotte 200 microliter antifade-montagemedium aan op een glazen afdekglaasje en plaats het op het plat gemonteerde netvlies voor microscopische analyse. Onder een confocale epifluorescentiemicroscoop, met behulp van een 40 keer vergrotend objectief, onderzoekt u de platte monteringen om retinale ganglioncellen te schatten. Verwijder na enucleatie van de oogbol het proximale segment van het intraorbitale deel van de oogzenuw, inclusief een deel van het intraoculaire gedeelte.

Plaats de monsters vervolgens onmiddellijk in injectieflacons of buisjes met 200 tot 300 microliter koud fixeermiddel. Was het weefsel na twee uur met een koude 100 micromolaire natriumcacodylaatbuffer. Fixeer het weefsel vervolgens gedurende een uur in 1% osmiumtetroxide en vijf nanomolair calciumchloride bij vier graden Celsius onder zacht schudden.

Was na drie wasbeurten met koude natriumcacodylaatbuffer de oogzenuwfragmenten met koud gedestilleerd water voordat u ze een nacht incubeert en 1% urinalacetaat bij vier graden Celsius. De volgende dag, na drie wasbeurten met water, droogt u het weefsel geleidelijk uit in toenemende acetonconcentraties. Voer vervolgens drie rondes inbedding en epoxyhars-acetonoplossingen uit voordat u het weefsel gedurende 24 uur in pure epoxyhars inbedt.

Haal de volgende dag de monsters uit de monsterdrager en breng ze over naar inbeddingsmallen gedurende 48 uur bij 60 graden Celsius. Gebruik na polymerisatie een ultramicrotoom om transversale halfdunne delen van de oogzenuwfragmenten door te snijden. Verzamel vervolgens de secties en breng ze over op een microscoopglaasje.

Kleur de secties met toluïdineblauw en breng ze in beeld met een optische microscoop met een vergroting van 100 keer. Voor ultrastructurele analyse voert u ultradunne doorsneden uit en verzamelt u deze op een koperen rooster. Kleurt vervolgens de secties met urinalacetaat en loodcitraat voor microscopisch onderzoek van transmissie-elektronen.

Cauterisatie van de volledige cirkel induceerde IOD-verhoging onmiddellijk na de operatie in vergelijking met controleogen. De piek voor postoperatieve IOP werd waargenomen op dag één en nam geleidelijk af tot de uitgangswaarden op dag zes. Verder werd de retinale functie zowel gedragsmatig als elektrofysiologisch geëvalueerd met behulp van respectievelijk optomotorische reflex en patroonelektroretinogram.

Na de operatie vertoonden beide parameters twee verschillende fasen van stoornissen: oculaire hypertensie acute fase op dag drie en een secundaire degeneratiefase op dag 30. Vergeleken met de controle-oogzenuwen namen het aantal axonen en semi-dunne transversale oogzenuwsecties geleidelijk af na de operatie. Transmissie-elektronenmicrofoto's van oogzenuwen van het controleoog toonden dicht opeengepakte gemyeliniseerde vezels gescheiden door dunne gliacelprocessen en duidelijke axonale microtubuli en neurofilamenten.

Daarentegen werden na drie dagen oculaire hypertensie enkele gedegenereerde vezels, cytoplasmatische vacuolatie in gliacelprocessen en gecondenseerd chromatine in gliacelkernen waargenomen. Na zeven dagen was er een toename van gedegenereerde axonale vezels en hypertone gliacelprocessen. En na 14 dagen werd meer ontregeling van de oogzenuwvezels waargenomen die verband houden met de invasie van gliacelprocessen tussen de axonen.

Bovendien nam de dichtheid van retinale ganglioncellen in de loop van de tijd af, voornamelijk in de dorsale en temporale retinale kwadranten. Probeer tijdens het uitvoeren van deze procedure limbale vaten voorzichtig aan te raken met een cauterisatiepunt, waarbij de omtrek van de navelstreng wordt gespaard en ervoor wordt gezorgd dat continue cauterisatiemarkeringen rondom de sclerale limbus worden waargenomen. Na deze procedure kunnen verschillende methoden worden toegepast, zoals functionele biochemische en immunohistochemische evaluatie van oogstructuren en andere methoden die glaucoomfysiopathologie kunnen erkennen.