Name: Isolatie en screening van bodembiodiversiteit voor schimmels die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Ontdek een protocol voor het isoleren van schimmels uit bodemmonsters voor bioremediatie van verontreinigingen. Deze methode identificeert schimmelstammen die koolwaterstoffen en plastics kunnen afbreken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) van de Universiteit van Pavia en professor Solveig Tosi voor het bieden van de mogelijkheid voor dit werk.

1. Selectie van schimmelstammen die recalcitrante materialen uit de bodem kunnen afbreken
<ol><li>Bereiding van antibiotische oplossing.<ol>
<li>Doe penicilline (50 mg / L), streptomycine (40 mg / L), chloortetracycline (40 mg / L), neomycine (100 mg / L) en chlooramfenicol (100 mg / L) in 250 ml gedeïoniseerd steriel water.</li>
		<li>Voordat u chlooramfenicol aan de antibiotische oplossing toevoegt, lost u het op in 3 ml ≥99% ethanol.</li>
		<li>Plaats de antibioticumoplossing gedurende 10 minuten op een magneetroerder (geen warmte) met een magnetische roerstaaf in de oplossing. Bewaren bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van groeimedia.<ol>
<li>Doe 1 g commercieel humuszuur, 3,26 g Bushnell-Haas bouillon (BH) en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (humuszuur agar).</li>
		<li>Leg de humuszuuragar in petrischalen onder een laminaire stroomkast.</li>
		<li>Doe 4 g lignocellulose, 3,26 g BH en 15 g agar in 1 l gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (lignocellulose agar).</li>
		<li>Plaats de lignocellulose-agar in petrischalen onder een laminaire stroomkast.</li>
		<li>Breng onder een laminaire stroomkast, nadat de media in de petrischalen zijn gestold, 1 ml van de antibioticumoplossing over op de voorbereide platen met behulp van een steriele spuit met een filter van 0,2 μm om het te steriliseren.</li>
		<li>Verdeel de antibioticumoplossing gelijkmatig over de plaatoppervlakken met behulp van een steriele L-vormige wegwerpcelstrooier en laat deze aan de lucht drogen onder de laminaire stroomkast.</li>
		<li>Doe 20 g moutextractbouillon en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (moutextract agar - MEA).</li>
		<li>Leg de MEA in petrischaaltjes onder een laminaire stromingskast.</li>
	</ol></li>
	<li>Bodembemonstering en bodemverdunningen.<ol>
<li>Bemonster de grond van belang op een diepte van 10 cm, verwijder alle planten, gras en dode bladeren van de bovenste laag en doe het in steriele polyethyleen zakken.</li>
		<li>Na het bereiken van het laboratorium, zeef de grond met behulp van een 2 mm gaas, verwijder eventuele wortels en plantenresten.</li>
		<li>Als het niet mogelijk is om de stroomafwaartse analyse meteen uit te voeren, bewaar de gezeefde bodemmonsters dan bij 4 °C.</li>
		<li>Werk onder een laminaire stromingskast en doe 1 g van de gezeefde grond in een steriele buis van 15 ml met 10 ml steriel gedeïoniseerd water (1 x 10-1 verdunning). Schud de buis horizontaal gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Neem onder een laminaire stromingskast, voordat de suspensie bezinkt, 1 ml van de 1 x 10-1 verdunning met een steriele pipet en breng deze over in een 9 ml gedeïoniseerd water blanco (1 x 10-2 verdunning). Vortex het grondig.</li>
		<li>Voordat de suspensie bezinkt, neemt u 1 ml van de 1 x 10-2 verdunning met een steriele pipet en brengt u deze over in een blanco water van 9 ml gedeïoniseerd water (1 x 10-3 verdunning). Vortex het grondig.</li>
	</ol></li>
	<li>Plating van bodemverdunningen op selectieve media.<ol>
<li>Werk onder een laminaire stroomkast en verzamel 100 μL van de 1 x 10-3 verdunning met behulp van een micropipette met een steriel punt en breng het over op een humus agar petrischaal. Doe dit voor minimaal 4 of 5 petrischaaltjes.</li>
		<li>Verdeel de verdunning gelijkmatig over het oppervlak van de petrischaal met behulp van een steriele L-vormige celstrooier.</li>
		<li>Laat het 10-15 min aan de lucht drogen onder de laminaire flowkast.</li>
		<li>Herhaal stap 1.4.1.-1.4.3. met behulp van lignocellulose petrischalen.</li>
		<li>Incubeer bij 25 °C in het donker gedurende maximaal 15 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolatie van schimmelkolonies groeide van selectieve media naar groeimedia.<ol>
<li>Controleer vanaf 3 dagen na bereiding dagelijks de bereide selectieve media petrischalen op eventuele schimmelkoloniegroei gedurende maximaal 15 dagen.</li>
		<li>Controleer alle aanwezige schimmelkolonies op overeenkomsten. Bereid indien nodig een dia voor die onder een lichtmicroscoop kan worden waargenomen. OPMERKING: Het doel is om het hoogste aantal schimmelkolonies te isoleren, maar het is noodzakelijk om te voorkomen dat steeds dezelfde schimmelstam van verschillende platen wordt geïsoleerd, dus deze controle is erg belangrijk. Zoek naar kolonies met verschillende macro- en micromorfologie.</li>
		<li>Isoleer onder een laminaire stroomkast of bij een Bunsen-brander elke gekozen schimmelstam door voorzichtig een klein deel van het mycelium uit de kolonie te verwijderen met een steriele inentingsnaald en over te brengen naar een nieuwe MEA-petrischaal. OPMERKING: In deze fase is het erg belangrijk om delicaat en nauwkeurig te zijn, omdat er een hoog risico is op besmetting door de andere schimmelkolonies die aanwezig zijn in de originele petrischaal. Als er meer dan één schimmelstam op de geënte MEA-plaat groeit, herhaalt u stap 1.5.3.</li>
		<li>Incubeer bij 25 °C in het donker gedurende 7 dagen. Dit zijn de schimmelstammen die verder getest moeten worden op specifieke recalcitrante stoffen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Groeiproeven op recalcitrante stoffen
<ol><li>Groeitest op vaseline.<ol>
<li>Breng 20 ml vloeibare BH (3,26 g/l BH) over in injectieflacons van 50 ml en steriliseer ze door deze gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C.</li>
		<li>Breng 7 ml gedeïoniseerd water over in glazen injectieflacons van 15 ml en voeg enkele stukjes gebroken glazen afdekplaten toe aan elke injectieflacon.</li>
		<li>Steriliseer ze door ze gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C.</li>
		<li>Voeg onder de laminaire flowkast 1 ml vaseline toe aan elke injectieflacon bh van 50 ml met behulp van een steriele pipet. Bewaar enkele injectieflacons met alleen BH als negatieve controle.</li>
		<li>Verwijder onder de laminaire flowkast het mycelium op het oppervlak van het medium uit de MEA-platen met de gekozen schimmelstammen (bereid bij stap 1.5.3.) met behulp van een steriele naald en breng het over in glazen injectieflacons van 15 ml met de gebroken dekplaten.</li>
		<li>Roer elke injectieflacon gedurende 2 minuten op een vortexmixer, zodat de gebroken dekmantels het blokje van de schimmelkolonie kunnen snijden, waardoor een schimmelsuspensie ontstaat.</li>
		<li>Ent elke injectieflacon met vaseline met 200 μL schimmelsuspensie. Maak twee replicaties voor elke schimmelstam.</li>
		<li>Voor de negatieve controle, doe 200 μL schimmelsuspensie in flacons met alleen vloeibare BH. Bewaar bovendien een paar injectieflacons met vaseline zonder schimmelinenting om te controleren op besmetting in het medium.</li>
		<li>Incubeer de injectieflacons bij 25 °C in het donker en controleer ze na 15 dagen en 30 dagen vanaf het entmateriaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Groeitest op gebruikte motorolie.<ol>
<li>Doe 3,26 g BH en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (BHA).</li>
		<li>Leg de BHA in petrischaaltjes onder een laminaire flowkast.</li>
		<li>Wanneer het is gestold, breng dan 500 μL gebruikte motorolie over op de BHA Petrischalen en verdeel het gelijkmatig over de plaatoppervlakken met behulp van een steriele L-vormige celstrooier.</li>
		<li>Ent elke gebruikte motorolie BHA-plaat met elke schimmelstam en verzamel het mycelium van de platen die zijn bereid bij stap 1.5.3. Werk op een Bunsen-brander of onder een laminaire stromingskap om besmetting te voorkomen. Maak twee replicaties voor elke schimmelstam.</li>
		<li>Voor de negatieve controle, ent de petrischalen alleen met BHA. Bewaar bovendien een paar gebruikte BHA Petri-schalen met motorolie zonder schimmelinenting om te controleren op verontreiniging in het medium.</li>
		<li>Incubeer de petrischaaltjes bij 25 °C in het donker en controleer ze na 15 dagen en 30 dagen vanaf het entmateriaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Groeitest op kunststoffen.<ol>
<li>Breng 200 μL schimmelsuspensie (stappen 2.1.5.-2.1.6.) over in een 96-microwellplaat. Maak drie replicaties van de combinatie schimmelstam-plastic.</li>
		<li>Voeg aan elke put met de schimmelsuspensie 10 mg van een ander soort plastic poeder toe (polyethyleentereftalaat - PET, polyvinylchloride - PVC, polyethyleen met hoge dichtheid - HDPE, polystyreen - PS, polyurethaan - PUR).</li>
		<li>Voor de negatieve controle, in plaats van het plastic poeder toe te voegen, voegt u 200 μL gesteriliseerde BH-oplossing toe aan de put met de schimmelsuspensie. Vul bovendien voor elk type plastic poeder een put met 200 μL gesteriliseerde BH-oplossing en 10 mg van elk plastic stof om te controleren op verontreiniging van het medium.</li>
		<li>Incubeer de microwellplaten bij 25 °C in het donker en controleer ze na 15 dagen en 30 dagen vanaf het entmateriaal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kwalitatieve enzymatische tests
<ol><li>Kwalitatieve ligninolytische enzymen colorimetrische test.<ol>
<li>Doe 27 g aardappeldextrosebouillon (PD) en 15 g agar in 1 l gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (PDA).</li>
		<li>Wanneer het medium een beetje is afgekoeld maar nog steeds vloeibaar is, voegt u galluszuur (5 g/L) toe onder een laminaire stromingskap en plaatst u het medium in petrischalen.</li>
		<li>Ent de PDA + galluszuurplaten met elke schimmelstam en verzamel het mycelium uit de platen die zijn bereid bij stap 1.5.3. Werk op een Bunsen-brander of onder een laminaire stromingskap om besmetting te voorkomen.</li>
		<li>Bereid als negatieve controles petrischalen met alleen PDA (geen galluszuur) en en ent ze in met de schimmelstammen (één voor elke schimmelstam), evenals een petrischaal met PDA + galluszuur en geen schimmelinenting.</li>
		<li>Incubeer de petrischaaltjes bij 25 °C in het donker en controleer ze na 7 dagen vanaf het entmateriaal.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwalitatieve laccases colorimetrische test.<ol>
<li>Doe 27 g PD en 15 g agar in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaaf het gedurende 20 minuten bij 121 °C (PDA).</li>
		<li>Wanneer het medium een beetje is afgekoeld maar nog steeds vloeibaar is, voeg je guaiacol (400 μL /L) toe onder een laminaire stroomkap en plaats je het in petrischalen.</li>
		<li>Ent de PDA + guaiacol-platen met elke schimmelstam en verzamel het mycelium van de platen die zijn bereid bij stap 1.5.3. Werk op een Bunsen-brander of onder een laminaire stromingskap om verontreiniging te voorkomen.</li>
		<li>Als negatieve controles, bereid petrischalen met alleen PDA (geen guaiacol) en ent ze in met de schimmelstammen (één voor elke schimmelstam), evenals een petrischaal met PDA + guaiacol en geen schimmelinenting.</li>
		<li>Incubeer de petrischaaltjes bij 25 °C in het donker en controleer ze na 7 dagen vanaf het entmateriaal.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwalitatieve proteasen test.<ol>
<li>Bereid het YES-medium door toevoeging van K2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) en gelatine/pepton (0,02 g/L) tot gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Plaats het YES-medium gedurende 10 minuten op een magneetroerder (geen warmte) met een magnetische roerstaaf in het medium.</li>
		<li>Wanneer alle zouten in het medium zijn opgelost, brengt u 5 ml van de oplossing over in steriele glazen injectieflacons van 20 ml en autoclaaft u deze gedurende 20 minuten bij 121 °C.</li>
		<li>Bereid voor de negatieve controle ongeveer 20 ml steriele glazen injectieflacons met 5 ml BH-oplossing en autoclaaf ze gedurende 20 minuten bij 121 °C.</li>
		<li>Breng onder een laminaire stroomkast 200 μL schimmelsuspensie (stappen 2.1.5.-2.1.6.) voor elke stam over naar de YES medium gesteriliseerde injectieflacons (maak ten minste 2 replicaties per schimmelstam). Voeg voor elke schimmelstam 200 μL van dezelfde schimmelsuspensie toe aan bh-gesteriliseerde injectieflacons om een negatieve controle te hebben.</li>
		<li>Incubeer de injectieflacons bij 25 °C in het donker gedurende 21 dagen en controleer ze om de 7 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwalitatieve esterasen test.<ol>
<li>Bereid het Medium Tween 80 door pepton (10 g/L), NaCl (5 g/L), CaCl2 (0,1 g/L) en 10 ml Tween 80 tot 1 L gedeïoniseerd water toe te voegen.</li>
		<li>Plaats het Tween 80 medium gedurende 10 min op een magneetroerder (geen hitte) met een magneetroerbalk in het medium.</li>
		<li>Wanneer alles in het medium is gesmolten, breng dan 5 ml van de oplossing over in steriele glazen injectieflacons van 20 ml en autoclaaf ze gedurende 20 minuten bij 121 °C.</li>
		<li>Bereid voor de negatieve controle ongeveer 20 ml steriele glazen injectieflacons met 5 ml BH-oplossing en autoclaaf ze gedurende 20 minuten bij 121 °C.</li>
		<li>Breng onder een laminaire stroomkast 200 μL schimmelsuspensie (stappen 2.1.5.-2.1.6.) voor elke stam over naar de Tween 80 medium gesteriliseerde injectieflacons (maak ten minste 2 replicaties per schimmelstam). Voeg voor elke schimmelstam 200 μL van dezelfde schimmelsuspensie toe aan bh-gesteriliseerde injectieflacons voor negatieve controle.</li>
		<li>Incubeer de injectieflacons bij 25 °C in het donker gedurende 21 dagen en controleer ze om de 7 dagen.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De rijke biodiversiteit van de bodem is een overvloedige bron van schimmels die tal van metabolische vermogens bezitten, waarvan sommige potentiële kandidaten voor bioremediatie kunnen zijn. Selectieve mediatests (sectie 1 van het protocol) zijn eenvoudig uit te voeren en effectieve methoden voor het isoleren van schimmels die kunnen groeien op natuurlijke complexe polymeren als hun enige koolstofbron. Schimmels kunnen extracellulaire, niet-specifieke hydrolasen en oxidoreductasen30 produceren, zo...

De bodem is een fundamenteel onderdeel van het leven op aarde en is de basis van vele ecosystemen. De mineralen, organische stof en micro-organismen in de bodem kunnen als één systeem worden beschouwd, met nauwe associaties en interacties tussen hen. De interacties van deze verbindingen hebben een belangrijke invloed op terrestrische processen, milieukwaliteit en de gezondheid van ecosystemen1. Bodemverontreiniging levert wereldwijd ernstige milieuproblemen op. De willekeurige, langdurige en overmatige toepassing van recalcitrante en giftige stoffen, zoals pesticiden, aardolieproducten, kunststoffen en andere chemicaliën, heeft ernstige gevolgen voor de bodemecologie en kan als gevolg daarvan de bodemmicrobiota veranderen. Microbiële gemeenschappen in de bodem bestaan uit een breed scala aan organismen in verschillende fysiologische toestanden, waarvan de meerderheid bacteriën en schimmels zijn. Veel van de verontreinigingen in de bodem hebben stabiliteit op middellange tot lange termijn en hun persistentie kan leiden tot de ontwikkeling van adaptieve mechanismen waarmee de micro-organismen recalcitrante stoffen als voedingsstoffen kunnen gebruiken 2,3. Deze micro-organismen kunnen daarom in aanmerking komen voor bioremediatietechnieken.
Bioremediatie probeert de effecten van vervuiling te verminderen door micro-organismen en hun enzymen te gebruiken voor de afbraak of omzetting van afval in minder toxische of niet-toxische verbindingen. Verschillende soorten archaea, bacteriën, algen en schimmels bezitten dit bioremediatievermogen4. Als gevolg van hun specifieke biologisch afbreekbare acties zijn schimmels vooral veelbelovende organismen voor bioremediatie. Ze kunnen verschillende substraten aanvallen met behulp van hun hyphal-netwerk, waardoor ze efficiënter de bodemmatrix kunnen binnendringen dan andere micro-organismen. Bovendien kunnen ze ontoegankelijke interstices bereiken waar verontreinigingen moeilijk te verwijderen zijn5, en ze kunnen ook lage vochtniveausoverleven 6. Bovendien synthetiseren schimmels verschillende cassettes van niet-specifieke enzymen, meestal om natuurlijke recalcitrante stoffen zoals cellulose, lignine en humuszuren af te breken. Degenen die het doelsubstraat missen, kunnen betrokken zijn bij de afbraak van een breed scala aan recalcitrante verontreinigende stoffen, zoals koolwaterstoffen, kunststoffen en pesticiden 7,8,9,10. Daarom, hoewel veel schimmelsoorten al zijn gemeld als bioremediatiemiddelen, is er een toenemende interesse in het verkennen van soorten die nog niet zijn bestudeerd om kandidaten te selecteren voor de bioremediatie van recalcitrante verontreinigende stoffen. De soorten waarvan al bekend is dat ze bioremediatie-eigenschappen hebben, behoren tot de phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 en Mucoromycota. Van de geslachten Penicillium en Aspergillus is bijvoorbeeld bekend dat ze betrokken zijn bij de afbraak van alifatische koolwaterstoffen13, verschillende plastic polymeren 16,17,18, zware metalen 19 en kleurstoffen20. Evenzo hebben studies uitgevoerd op basidiomycetenschimmels, zoals Phanerochaete chrysosporium en Trametes versicolor, hun betrokkenheid bij de oxidatie van recalcitrante materialen zoals aromatische koolwaterstoffen13 en kunststoffen21 aangetoond. Een ander voorbeeld van schimmels die betrokken zijn bij de biologische afbraakprocessen zijn de zygomyceten Rhizopus spp., Mucor spp. en Cunninghamella spp.22,23. In het bijzonder is Cunninghamella in staat om aromatische koolwaterstoffen te oxideren en wordt het beschouwd als een modelorganisme voor het bestuderen van de ontgifting van producten uit een breed scala aan xenobiotica13.
Er zijn verschillende schimmelenzymen betrokken bij de belangrijkste afbraakprocessen van recalcitrante materialen 24,25, zoals esterase, laccase, peroxidase en protease. Laccases zijn koperhoudende oxidaties die in de cel worden geproduceerd en vervolgens worden uitgescheiden, die de oxidatie van een verscheidenheid aan fenolische en aromatische verbindingen mogelijk maken. Ze kunnen ortho- en paradifenolen, de aminogroepbevattende fenolen, lignine en de arylgroepbevattende diaminesafbreken 26. Peroxidasen gebruiken waterstofperoxide als mediator om lignine en andere aromatische verbindingen af te breken. Er zijn veel verschillende peroxidasen, maar degenen met het grootste potentieel om giftige stoffen af te breken zijn lignineperoxidase en mangaanperoxidase27.
Esterasen en proteasen behoren tot de groep van extra- of ectocellulaire enzymen, die buiten hun cellen van oorsprong werken, maar er nog steeds aan gebonden zijn. Deze enzymen kunnen de hydrolyse van grote recalcitrante moleculen katalyseren tot kleinere. Vanwege hun lage substraatspecificiteit kunnen deze enzymen een sleutelrol spelen bij de bioremediatie van verschillende verontreinigende stoffen, zoals textielkleurstoffen, effluenten die vrijkomen uit de pulp- en papierindustrie en leerlooien, aardolieproducten, kunststoffen en pesticiden 28,29,30.
Een aantal screeningsmethoden om te selecteren op bioremediatieve schimmelstammen zijn al gepubliceerd. Agarmedium op basis van stro is bijvoorbeeld gebruikt om te screenen op witrotschimmels met een hoog potentieel in de afbraak van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's)31; en kleine stukjes rottend hout zijn op moutextract agar (MEA) geplaatst om houtrotschimmels te isoleren32. De meeste methoden die al zijn voorgesteld, selecteren echter zeer specifieke schimmels op hun activiteit van belang. Dit onderzoek stelt een bredere aanpak voor voor het selecteren van bodemschimmels met een breder scala aan acties. De methode is gebaseerd op de initiële plating van seriële verdunningen van bodemmonsters op een medium dat is gewijzigd met humuszuren of lignocellulose gemengd met antibiotica om schimmels te selecteren met het vermogen om deze natuurlijke recalcitrante stoffen af te breken. Humuszuren en lignocellulose zijn in feite stoffen die extreem resistent zijn tegen biologische afbraak, omdat ze zeer complexe moleculaire structuren hebben, en dit stelt hen in staat om uitstekende indicatoren te zijn van het afbreekbare vermogen van de geteste schimmels33,34. Vervolgens worden de schimmels die in de eerste tests zijn geselecteerd, gescreend om die te identificeren met het potentieel om specifieke verontreinigende stoffen zoals vaseline, gebruikte motorolie en kunststoffen af te breken. Ten slotte worden kwalitatieve enzymatische tests uitgevoerd om schimmelstammen te detecteren die enzymen kunnen produceren die betrokken zijn bij de biologische afbraakprocessen van recalcitrante stoffen. Voor dit doel worden protease- en esterasetests uitgevoerd, terwijl galluszuur en guaiacol worden gebruikt als indicatoren voor laccase- en andere ligninolytische enzymproductie35,36. Deze substraten worden gebruikt omdat er een sterke correlatie is gevonden tussen het vermogen van schimmels om ze te oxideren tot hun bruingekleurde vorm en het bezit van ligninolytisch vermogen 37,38,39.
Door deze protocollen is het mogelijk om schimmelstammen met een hoog degraderend potentieel en een breed werkingsspectrum rechtstreeks uit bodemmonsters te isoleren. De isolatie van deze schimmelstammen kan helpen bij het vinden van nieuwe kandidaten voor bioremediatiedoeleinden.

<table><tbody><tr><td>96 microwell plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>Bushnell-Haas Broth</td><td>Fluka</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Chloroamphenicol</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>Chlortetracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001451</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot;2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.2 &micro;m</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>gallic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>Glass cover slips</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>Glass vials 15 mL</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>High-density polyethylene (HDPE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>Humic acids</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lignocellulose</td><td>/</td><td>/</td><td>Gesteriliseerd bioethanol productie afval</td></tr><tr><td>L-shaped cell spreader</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stirrer</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>Malt Extract Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &mu;L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 200&nbsp; &mu;L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot;4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot;2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene terephthalate (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum (Paraffin liquid)</td><td>A.C.E.F</td><td>009661</td><td></td></tr><tr><td>Potato Dextrose Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331651</td><td></td></tr><tr><td>Polyurethane (PUR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF20677923</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl chloride (PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>Sterile falcon tube</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Sterile glass vials 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>Sterile point 1000&nbsp; &mu;L</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>Sterile point 200&nbsp; &mu;L</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>Sterile polyethylene bags</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>sterile syringe</td><td>Rays</td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Used engine oil</td><td>/</td><td>/</td><td>complexe mengsel van koolwaterstoffen, motoradditieven en metalen, geleverd door een Italiaans particulier bedrijf</td></tr><tr><td>Vials 50 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en screening van bodembiodiversiteit voor schimmels die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

Milieuvervuiling is een toenemend probleem en het identificeren van schimmels die betrokken zijn bij het bioremediatieproces is een essentiële taak. De bodem herbergt een ongelooflijke diversiteit aan microbieel leven en kan een goede bron zijn van deze bioremediatieve schimmels. Dit werk heeft tot doel bodemschimmels met bioremediatiepotentieel te zoeken door gebruik te maken van verschillende screeningstests. Minerale cultuurmedia aangevuld met recalcitrante stoffen als enige koolstofbron werden gebruikt als groeitests. Eerst werden bodemverdunningen op petrischalen verguld met mineraal medium gewijzigd met humuszuren of lignocellulose. De groeiende schimmelkolonies werden geïsoleerd en getest op verschillende substraten, zoals complexe mengsels van koolwaterstoffen (vaseline en gebruikte motorolie) en poeders van verschillende plastic polymeren (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kwalitatieve enzymatische tests werden geassocieerd met de groeitests om de productie van esterasen, laccases, peroxidasen en proteasen te onderzoeken. Deze enzymen zijn betrokken bij de belangrijkste afbraakprocessen van recalcitrant materiaal en hun constitutieve secretie door de onderzochte schimmelstammen zou het potentieel kunnen hebben om te worden benut voor bioremediatie. Meer dan 100 stammen werden geïsoleerd en getest, en verschillende isolaten met een goed bioremediatiepotentieel werden gevonden. Kortom, de beschreven screeningstests zijn een eenvoudige en goedkope methode om schimmelstammen met bioremediatiepotentieel uit de bodem te identificeren. Bovendien is het mogelijk om de screeningstests voor verschillende verontreinigende stoffen aan te passen aan de vereisten, door andere recalcitrante stoffen toe te voegen aan minimale kweekmedia.

De selectieve mediamethoden (sectie 1 van het protocol) maakten het mogelijk om de rijke biodiversiteit van de bodem te screenen en de schimmels met een hoog bioremediatiepotentieel te selecteren. Met de humuszuur- en lignocellulosemedia werden meer dan 100 schimmelstammen geïsoleerd. Deze schimmels produceerden enzymen die betrokken zijn bij de biologische afbraak van natuurlijke recalcitrante materialen, die een chemische structuur hebben die lijkt op veel verontreinigende stoffen. De schimmelstammen geïsoleerd met de ...

Hier presenteren we een protocol voor het screenen van bodembiodiversiteit om te zoeken naar schimmelstammen die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen. Ten eerste worden schimmelstammen die kunnen groeien op humuszuren of lignocellulose geïsoleerd. Hun activiteit wordt vervolgens getest, zowel in enzymatische assays als op verontreinigende stoffen zoals koolwaterstoffen en kunststoffen.

Isolatie en screening van bodembiodiversiteit voor schimmels die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Dit protocol is belangrijk omdat het schimmelstammen met een hoog afbraakpotentieel rechtstreeks uit bodemmonsters isoleert om te worden beschouwd als kandidaten voor bioremediatiedoeleinden. Dit protocol is een goedkope screening om schimmels met bioremediatiepotentieel te vinden. Bovendien geeft het resultaten die gemakkelijk te interpreteren zijn.Omdat deze techniek betrekking heeft op het hanteren van micro-organismen, is het erg belangrijk om steriliteit te werken met behulp van een laminaire flowkast of een Bunsen-brander om besmetting te voorkomen. Om te beginnen, bemonster de grond van belang en zeef de grond met behulp van een gaas van twee millimeter om wortels en plantenresten te verwijderen. Voeg onder een laminaire stromingskast een gram van de gezeefde grond toe aan een steriele buis van 15 milliliter.Voeg vervolgens 10 milliliter steriel gedeïoniseerd water toe om een verdunning van 10 tot min één te maken. Schud de tube horizontaal gedurende 30 minuten. Voordat de suspensie bezinkt, neemt u een milliliter van 10 tot de min één verdunning met een steriele pipet en brengt u deze over in een negen milliliter gedeïoniseerd water blanco om 10 tot de min twee verdunning te maken.Vortex de suspensie grondig. Maak op dezelfde manier een 10 tot de min drie verdunning van een 10 tot de min twee verdunningsbuis. Verzamel voor het platen van bodemverdunningen op selectieve media 100 microliter van de 10 tot de min drie verdunning met behulp van een micropipette met een steriel punt en breng deze over op een humus agar petrischaal.Verdeel de verdunning gelijkmatig over het schaaloppervlak met behulp van een steriele, wegwerpbare, L-vormige celstrooier. Bereid vier tot vijf van dergelijke gerechten. Bereid op dezelfde manier lignocellulosegerechten van een verdunningsbuis van 10 tot min drie.Laat de gerechten 10 tot 15 minuten aan de lucht drogen voordat je 15 dagen in het donker bij 25 graden Celsius broedt. Controleer alle aanwezige schimmelkolonies op overeenkomsten. Bereid indien nodig een dia voor die onder een lichtmicroscoop kan worden waargenomen.Isoleer onder een laminaire stroomkast of bij een Bunsen-brander elke gekozen schimmelstam door voorzichtig een klein deel van het mycelium uit de kolonie te verwijderen met een steriele inentingsnaald. Breng de geïsoleerde kolonie over in een nieuw moutextract agar, of MEA, gerecht. Breng 20 milliliter Bushnell Haas, of BH-medium, over in glazen injectieflacons van 50 milliliter.Breng zeven milliliter gedeïoniseerd water over in injectieflacons van 15 milliliter en voeg stukjes gebroken glazen afdeksels toe aan elke injectieflacon. Steriliseer de injectieflacons door gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius. Om de groei op vaseline te testen, voegt u één milliliter vaseline toe aan elke BH-injectieflacon van 50 milliliter met behulp van een steriele pipet onder de laminaire stroomkast.Bewaar enkele injectieflacons met alleen BH als negatieve controle. Verwijder het mycelium op het oppervlak van het medium van de MEA-plaat met de gekozen schimmelstam met behulp van een steriele naald en breng het over in een glazen injectieflacon van 15 milliliter met de gebroken afdeksels. Roer de injectieflacon gedurende twee minuten op een vortexmixer, zodat het gebroken deksel het blokje van de schimmelkolonie kan doorsnijden, waardoor een suspensie ontstaat.Ent elke injectieflacon met vaseline met 200 microliter suspensie. Maak twee replicaties voor elke schimmelstam. Voeg voor de negatieve controle 200 microliter schimmelsuspensie toe aan de injectieflacon die alleen BH-medium bevat.Bewaar ook de injectieflacon met vaseline zonder schimmelinenting om te controleren op besmetting in het medium. Incubeer de injectieflacons bij 25 graden Celsius in het donker en observeer ze na 15 en 30 dagen vanaf het entmateriaal. Om de groei op gebruikte motorolie te testen, brengt u 500 microliter gebruikte motorolie over op de BHA Petrischaal en verdeelt u de olie gelijkmatig.Ent vervolgens de plaat met schimmelstam door het mycelium uit MEA-platen te verzamelen. Om de groei op kunststoffen te testen, brengt u 200 microliter schimmelsuspensie over in een 96-microwellplaat. Maak drie replicaties van de combinatie schimmelstam-plastic.Voeg 10 milligram van een ander plastic poeder toe aan elke put met de schimmelsuspensie. Voeg voor de negatieve controle 200 microliter BH-medium toe aan de put met de schimmelsuspensie. Vul bovendien voor elk plastic poeder een put met 200 microliter BH-oplossing en 10 milligram van elk plastic stof om te controleren op verontreiniging.Incubeer de platen bij 25 graden Celsius in het donker en observeer ze na 15 en 30 dagen. Voor kwalitatieve laccases calorimetrische test, bereid een liter aardappel dextrose agar, of PDA, en autoclaaf gedurende 20 minuten. Na het autoclaveren, wanneer het medium is afgekoeld maar nog steeds vloeibaar is, voegt u 400 microliter guaiacol toe onder een laminaire stroomkap en plaatst u het in petrischalen.Ent de PDA guaiacolplaat met schimmelstam door het mycelium uit de MEA-plaat te verzamelen. Bereid voor negatieve controles PDA-platen voor met elke schimmelstam en één plaat met PDA en guaiacol. Incubeer de platen bij 25 graden Celsius in het donker en observeer ze na zeven dagen.Bereid voor de kwalitatieve esterasentest een liter Tween 80-medium voor. Plaats het medium vervolgens op een magneetroerder zonder te verhitten met een roerstaaf in het medium. Na 10 minuten, wanneer alles is gesmolten, breng je vijf milliliter van het medium over in steriele injectieflacons en autoclaaf van 20 milliliter.Voeg 200 microliter schimmelsuspensie toe aan de Tween 80 medium gesteriliseerde injectieflacon. Voeg voor de negatieve controle vijf milliliter bh-medium met autoclaven toe aan een injectieflacon van 20 milliliter. Voeg vervolgens 200 microliter schimmelsuspensie toe aan de injectieflacon.Incubeer de injectieflacons bij 25 graden Celsius in het donker gedurende 21 dagen en observeer ze om de zeven dagen. Het percentage schimmelstammen dat kan groeien op vaseline, gebruikte motorolie en plastic poeders als hun enige koolstofbron met verschillende gradaties van succes werd geëvalueerd. Het vermogen van schimmels om vaseline te exploiteren werd beoordeeld als het verschil in koloniegroei tussen gecontroleerde BH en het bevatten van vaseline.Bijna 75% van de geteste stammen was in staat om vaseline als enige koolstofbron te gebruiken en 21% vertoonde maximale groei. Ook de groei voor platen die alleen BHA bevatten en in aanwezigheid van motorolie werd gemonitord. Bijna 90% van de soorten groeide op gebruikte motorolie, waarbij 39% maximale groei liet zien.De vorming van een roodbruine halo rond de schimmelkolonie duidde op een hogere productie van laccases en andere ligninolytische enzymen. Ongeveer 60% van de schimmels was in staat om laccases te produceren. Bovendien produceerde 17% van de stammen een intense donkere halo rond de kolonie in het guaiacol-medium.Esterases activiteit werd beoordeeld door de vorming van een wit neerslag in Tween 80 medium. Bijna 60% van de stammen vertoonde esterasenactiviteit en 13% vertoonde een hogere neerslagvorming. Dit protocol kan worden aangepast om te screenen op schimmels die elke verontreinigende stof kunnen afbreken door de recalcitrante stof van belang toe te voegen aan een minimaal kweekmedium.

isolation-screening-from-soil-biodiversity-for-fungi-involved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Villela, H. D. M., et al. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the isolation of pollutant-degrading marine bacteria through serial dilution, colony selection, and growth in EE2-containing medium. By using EE2 as the sole carbon source, the protocol identifies bacterial strains capable of metabolizing this environmental pollutant.

Screening Marine Bacteria for the Isolation of Pollutant-Degrading Strains

Plastic folies label "biologisch afbreekbaar" zijn commercieel beschikbaar voor gebruik in de landbouw als mulch. Grondbewerking vertegenwoordigt een aantrekkelijke verwijdering methode, maar degradatie onder veldomstandigheden wordt slecht begrepen. Het doel van deze studie was werkwijzen voor het isoleren van natieve bodemschimmels en bacteriën die plastic mulch films koloniseren na grafveld ontwikkelen.

Isolatie van de Native Soil Micro-organismen met Potentieel voor Breaking Down Biologisch afbreekbaar plastic mulch films gebruikt in de landbouw

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).

Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

De isolatie van zware metaalresistente microben uit geothermische bronnen is een hot topic voor de ontwikkeling van bioremediatie en milieumonitoring biosystemen. Deze studie biedt een methodologische benadering voor het isoleren en identificeren van zware metaaltolerante bacteriën uit warmwaterbronnen.

Bioprospectie van extremofiele micro-organismen om milieuvervuiling aan te pakken

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Dit protocol beschrijft het ontwerp en het gebruik van een isolatiechip (iChip) voor in situ kweek van recalcitrante bodemmicroben in hun natuurlijke omgeving. Het beschrijft ook de in situ kweek van antimicrobieel producerende bodembacteriën. Het protocol kan worden aangepast om bacteriën te herstellen uit diverse niches met andere gewenste eigenschappen.

In situ Isolatie en kweek van weerbarstige bodembacteriën met behulp van een isolatiechip (iChip)

Deze video toont een procedure voor het isoleren van intacte protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis. Gezien het feit dat de geïsoleerde protoplasten intact blijven gedurende minstens 96 uur en worden geïsoleerd van zaailingen in plaats van een-maand-oude volwassen planten, deze procedure versnelt assays die intact protoplasten.

Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana</em

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Ontdek een protocol voor het isoleren van schimmels uit bodemmonsters voor bioremediatie van verontreinigingen. Deze methode identificeert schimmelstammen die koolwaterstoffen en plastics kunnen afbreken.

Isolatie en screening van bodembiodiversiteit voor schimmels die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen

Meer video's verkennen