Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

Ons protocol opent nieuwe mogelijkheden om te onderzoeken hoe replicatie plaatsvindt op beschadigd DNA. De technieken kunnen de vorming en reparatie van enkelstrengs DNA-hiaten detecteren, tegenover de DNA-laesie. Het S1-nuclease splijt het enkelstrengs DNA en maakt de detectie van postreplicatieve hiaten mogelijk.

Deze aanpak werd voor het eerst gebruikt door Dr. Meneghini en Dr. Cordiero-Stone in de jaren 1970 in Brazilië en onlangs door ons aangepast aan de DNA-vezeltest. Het gebruik van de hier beschreven techniek om de vorming en reparatie van post-replicatieve hiaten te bestuderen, kan inzicht geven in het mechanisme van DNA-reparatie en replicatiestressrespons die de integriteit van het genoom behouden. Voor beide hier beschreven protocollen, de S1-vezel en de gap-filling assays, is het cruciaal om alle controles op te nemen om een nauwkeurige interpretatie van de gegevens te garanderen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Davi J.Martins, een promovendus uit ons lab, en Dr.Annabel Quinet, een medewerker die deze technieken eerder ontwikkelde toen hij in onze groep werkte. Om te beginnen, adem de kweekmedia op en voeg onmiddellijk de kweekmedia met 20-micromolaire IDU-media toe aan de cellen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende precies 20 minuten.

Was vervolgens de cellen snel twee keer met voorverwarmd PBS en bestraal ze met 20 joule per vierkante meter UV-C. Gebruik onbehandelde cellen als besturingselementen. Voeg onmiddellijk de media met 200-micromolaire CldU toe aan de cellen en incubeer ze bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende precies 60 minuten.

Was daarna de cellen twee keer met voorverwarmd PBS en permeabiliseer ze met de CSK 100-buffer gedurende twee tot 10 minuten volgens de cellijn bij kamertemperatuur. Na CSK-permeabilisatie kunnen de kernen met bijna geen cytoplasma worden gezien in vergelijking met die vóór de permeabilisatie. Giet PBS voorzichtig langs de zijkant van elke put om de kernen met PBS te wassen.

Was vervolgens de kernen met S1-buffer. Incubeer de kernen in de S1-buffer met 20 eenheden per milliliter S1-nuclease en zonder het S1-nuclease gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Zuig vervolgens de S1-buffer op en voeg 0,1% BSA toe in PBS.

Schraap de kernen en breng ze over in een ongeveer geannoteerde buis van 1,5 milliliter. Houd de buizen de hele tijd op ijs. Centrifugeer de kernen op ongeveer 4.600 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Resuspendeer de pellets in PBS in een concentratie van ongeveer 1.500 cellen per microliter. Plaats de buisjes op ijs en ga onmiddellijk over tot DNA-vezelvoorbereiding door het verspreiden van het protocol. Annoteer de microscoopglaasjes met een carbonpotlood en leg ze plat op een dienblad.

Tik op de onderkant van de buis om homogenisatie te garanderen en voeg twee microliter cellen toe aan de bovenkant van de bijbehorende dia. Voeg zes microliter van de lysisbuffer toe en lyseer de cellen door ongeveer vijf keer op en neer te pipetteren. Gebruik de pipetpunt om de druppel iets naar de bodem van de glijbaan te trekken en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de kernen te lyseren.

Kantel de glijbaan op ongeveer 20 tot 40 graden en laat de druppel zich met een constante lage snelheid naar de bodem van de glijbaan verspreiden. Laat de glijbaan 10 tot 15 minuten drogen bij kamertemperatuur in het donker. Dompel ze vervolgens onder in een pot met de vers bereide fixatieoplossing en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om DNA op de dia's te fixeren.

Was de dia's tweemaal met PBS gedurende vijf minuten en denatureer het DNA met vers bereid 2,5 molair cloridrinezuur gedurende 40 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's drie keer met PBS gedurende vijf minuten en blok met 5% BSA die eerder 30 tot 60 minuten was opgewarmd bij 37 graden Celsius. Tik voorzichtig op het papier om de overtollige vloeistof van de dia's te verwijderen.

Voeg druppelsgewijs 30 microliter primaire antilichamen toe aan de dia's en plaats er een afdekslip op. Incubeer gedurende 1 tot 1,5 uur bij kamertemperatuur in een donkere, vochtige kamer. Plaats de dia's één tot twee minuten in een pot met PBS en verwijder vervolgens voorzichtig de afdekslipjes.

Was met PBST drie keer vijf minuten in een pot en plaats de dia's in PBS. Verwijder de overtollige vloeistof door zachtjes op een papier te tikken en voeg druppelsgewijs 30 microliter van de secundaire antilichamen toe aan de dia's. Leg er een afdekslip op.

Incubeer gedurende 45 tot 60 minuten bij kamertemperatuur in een donkere en vochtige kamer. Herhaal de stappen voor het wassen van de dia's en het verwijderen van het overtollige PBS nogmaals en voeg 20 microliter van het montagereagens druppelsgewijs toe aan de dia's. Plaats er een hoeslip op en vermijd bubbels.

Plaats een druppel dompelolie in de buurt van de bovenkant van de dia waar de cellen zijn gelyseerd. Gebruik het groene kanaal en zoek de groene stippen op de achtergrond om de focus te vinden. Open de Leica Application Suite software, klik op Acquire en selecteer het groene kanaal.

Pas de instellingen van het groene kanaal aan vóór de analyse. Ga vervolgens naar het rode kanaal en pas de instellingen aan. Zoek de belangrijkste concentratie vezels en ga naar de randen om de goed verspreide, niet-overlappende, individuele vezels te vinden.

Gebruik slechts één kanaal om de gebieden voor de foto's te selecteren en mogelijke vertekeningen te voorkomen. Klik op het pictogram Overlay verwerven en pas de software aan voor de juiste microscoopvergroting. Maak ongeveer 15 tot 20 foto's per dia naast de hele dia bij het groene kanaal en vervolgens bij het rode kanaal.

De twee kanalen zijn nu samengevoegd en de gemaakte overlay wordt verplaatst naar een unieke map. Het is mogelijk om de vezels te zien met rode en groene kleuren. Open de ImageJ-software, klik met de linkermuisknop op het vijfde pictogram, selecteer de tweede optie en selecteer vervolgens het gereedschap Gesegmenteerde lijn.

Klik met de linkermuisknop om het exacte pad van het rode of groene traktaat te tekenen en klik met de rechtermuisknop om de tekening te stoppen. Druk op de M-knop op het toetsenbord om de lengte te meten. Houd voor de S1-vezel de rode en groene traktaatmetingen voor elke vezel bij en meet rode en groene traktaatlengtes van ten minste 150 vezels uit verschillende afbeeldingen.

Een S1-vezel wordt getoond in deze representatieve afbeeldingen. Controle-ontluikend DNA-kanaal zonder de openingen en ongevoelig voor splitsing door de S1-nuclease wordt hier getoond. DNA-tractus positief voor gaten die door het S1-nuclease werden gesplitst, resulteerde in een kortere CldU-tractuslengte.

Een differentieel etiketteringsschema dat uitgebreid in het tekstmanuscript wordt beschreven, kan worden uitgevoerd om gap-filling events te labelen. In deze assay, genaamd gap-filling assay, komen langere IDU-tracks met ten minste één CldU-patch of minder CldU-patches overeen met een lage gap-filling density. Kortere IDU-tracts, met ten minste één CldU-patch, en langere IDU-tracts met meer CldU-patches, komen overeen met een hoge gap-filling density.

De permeabilisatiestap van dit protocol is cruciaal voor het S1-nuclease om in te werken op de hiaten die zijn gevormd tijdens de replicatie van beschadigd DNA. De S1-nuclease kan ook worden gebruikt in het komeettestprotocol om de hiaten te detecteren die zijn gevormd tijdens de replicatie van beschadigd DNA dat na de behandeling blijft bestaan. De S1-vezeltest maakte de weg vrij voor het nieuwe paradigma dat post-replicatieve hiaten kwetsbaarheid voor kanker kunnen veroorzaken, met name bij borst- en eierstokkankers met mutaties in BRCA1- en 2-genen.