Name: Labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Ontdek labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline met behulp van second harmonic generation microscopie. Deze methode biedt nieuwe inzichten in oligodendrocietfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) door middel van de volgende subsidies: infrastructuren 226450 tot VP-CIO, infrastructuren 255277 tot V.P. en FORDECYT-PRONACES/194171/2020 tot V.H. We erkennen de steun van Juvenal Hernández Guevara bij CIO bij het maken van video's.

Alle beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de wetten en codes die zijn goedgekeurd in de zevende titel van de verordening van de algemene gezondheidswet met betrekking tot gezondheidsonderzoek van de Mexicaanse regering (NOM-062-ZOO-1999) en in overeenstemming met de aanbevelingen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Experimental Animals en werden goedgekeurd door het institutionele comité voor bio-ethiek in onderzoek van de Universidad de Guanajuato en Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.
1. Microscoop instellingen
<ol><li>Schakel het microscopiesysteem in.</li>
	<li>Schakel de gepulseerde laser in om te garanderen dat deze klaar is om te lassen op een optimaal en stabiel vermogensniveau na de extractie en bereiding van het monster.</li>
	<li>Stem de laser af op 810 nm. Om tissulaire microtubuli te bestuderen, wordt 10% -20% van het beschikbare laservermogen gebruikt, wat in het beschreven systeem overeenkomt met 13-26 mW gemeten op het achterste brandpuntsvlak van het objectief.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de microscoop is uitgelijnd (aanvullend bestand 1), met het doel dat zal worden gebruikt voor de SHG-beeldvorming. OPMERKING: Dit is belangrijk omdat, in de commerciële opstelling die in dit werk wordt gebruikt, de detectie wordt uitgevoerd in de transmissiemodus en via de condensor.</li>
	<li>Verwijder ongewenste filters uit het optische detectiepad (figuur 1A).</li>
	<li>Zorg ervoor dat het membraan van de condensor volledig is geopend om ervoor te zorgen dat er op dit niveau geen licht onnodig wordt gestopt.</li>
	<li>Bereid een 25x/0.8 numeriek diafragma (NA) olie-onderdompelingsobject voor met een kleine druppel dompelolie in de lens. OPMERKING: Dit doel werd gebruikt om het beste overeen te komen met de condensor NA, die 0,55 was (idealiter NAcond≥ NAobj).</li>
</ol>2. Microscoop voorcontroles
OPMERKING: Voer de voorlopige microscoopcontroles eenmaal uit, tenzij de instelling wordt gewijzigd.
<ol><li>Afbeelding droog maïszetmeel ingeklemd tussen glazen dia's met SHG-parameters om SHG-afbeeldingen te genereren die de laserpolarisatierichting onthullen. Volg de stappen die worden gerapporteerd in aanvullend bestand 2, met uitzondering van het laservermogen, dat minder dan 5% is voor maïszetmeel.</li>
	<li>Maak een afbeelding van schaarse maïszetmeelkorrels en markeer de oriëntatie van de SHG-lobben in het x-y-vlak. Deze oriëntatie komt overeen met de laseroriëntatie (figuur 2A).</li>
	<li>Neem als controle een andere afbeelding van hetzelfde monster en steek in het optische pad een halve golfplaat (positie weergegeven in figuur 1A) om de oscillatierichting van de laser te wijzigen. Het resulterende beeld toont gedraaide SHG-signaallobben (figuur 2B, C).</li>
	<li>Als u een ander type bandpassfilter voor de SHG gebruikt, moet u ervoor zorgen dat deze optimale transmissie-eigenschappen heeft door de afbeeldingen (figuur 2D, E) en de signaalintensiteiten pixel voor pixel te vergelijken langs een lijnscan (figuur 2F).</li>
</ol>3. Weefselextractie
OPMERKING: Gebruik altijd schoon gereedschap om de chirurgische ingrepen uit te voeren.
<ol><li>Gebruik taiepratten van 6-12 maanden oud en Sprague-Dawley-controles (WT) die overeenkomen met de leeftijd.</li>
	<li>Verdoof de dieren met een i.p. injectie van een mengsel van ketamine-xylazine (0,125 mg/Kg en 5 mg/Kg) verdund in een 0,9% steriele NaCl oplossing.<ol><li>Controleer de pijnreflexen en ga alleen verder als ze afwezig zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Offer het dier via onthoofding.</li>
	<li>Zodra het hoofd is geïsoleerd, opent u de botten van het schedelgewelf voorzichtig langs de middellijn, beginnend bij het meest caudale punt bovenaan naar de neus, van de orbitale holtes naar de middellijn en vervolgens van het meest caudale punt tot onder de hersenen en het cerebellum. OPMERKING: Botsnijders en Rongeurs zorgen voor een goede verwijdering van de hoofdbotten zonder de hersenstructuren te beschadigen.</li>
	<li>Laat de hersenen en het cerebellum los uit het bot. De twee hemisferen konden worden gescheiden. Als de hemisferen zijn verdeeld, gebruik dan de ene helft voor SHG-beeldvorming en fixeer de andere helft in 3,7% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 20 minuten in een chemische kap voor daaropvolgende sectie en kleuring.</li>
</ol>4. Vibratome sectie
<ol><li>Bereid een vibratome bufferbak gevuld met warme (37 °C) Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).</li>
	<li>Bevestig de hersenen aan de monsterplaat met behulp van cyanoacrylaatlijm via een stuk afplaktape. Het meest caudale deel /gebied komt in contact met de lijm, zodat de bruikbare coronale secties uit het tegenovergestelde, rostrale gedeelte kunnen worden gesneden.<ol><li>Laat ~ 10 s voor de lijm polymeriseren om een effectieve bevestiging van het monster te verkrijgen. OPMERKING: De beste resultaten worden verkregen wanneer de hersenen zo zijn georiënteerd dat het mes "van boven naar beneden" snijdt in plaats van "van links naar rechts" (figuur 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de monsterplaat over op de magnetische steun in de bufferlade.</li>
	<li>Begin met het snijden van secties van 300-500 μm totdat de geproduceerde plakjes het hele oppervlak van de hersenen omvatten.</li>
	<li>Verminder op dit punt de dikte van de sectie tot 160 μm.</li>
	<li>Zodra een volledige sectie van 160 μm is gesneden ter hoogte van het corpus callosum, herstelt u deze met een gemodificeerde glazen Pasteur-pipet met een grote, gevlamde opening (figuur 1C).</li>
	<li>Breng het over in een schone petrischaal met nieuwe warme HBSS of rechtstreeks op de glazen ondersteuning voor microscopie (coverslip of glasbodemschaal). OPMERKING: Voor de beschreven experimentele omstandigheden is het toevoegen van een coverslip boven het monster schadelijk voor de beeldvorming.</li>
</ol>5. Breng over naar de microscoop
<ol><li>Als de microscoop zich in een andere kamer bevindt, bereid dan een geïsoleerde doos voor met verwarmde gelpakketten om de weefselsecties over te brengen met behoud van de temperatuur. De doos dient ook om de secties warm te houden totdat ze worden afgebeeld.</li>
	<li>Leg het monster onder de microscoop en zorg ervoor dat het goed onder het doel wordt geplaatst door directe observatie door de oculairen met doorgelaten licht. OPMERKING: Het doel is om de voorspelde emitterende structuren uit te lijnen met de oscillatierichting van de laser om het uitgezonden (en dus gedetecteerde) SHG-signaal te maximaliseren.</li>
	<li>Verwijder de overtollige HBSS zodat een dunne vloeibare film het hele monster bedekt. Controleer de vloeistoffilm om de paar minuten visueel om overmatige verdamping en droging van het monster te voorkomen. OPMERKING: In de beschreven omstandigheden wordt een sectie niet langer dan 20 minuten gebruikt. Het drogen van het monster veroorzaakt drastische artefactuele effecten (aanvullende figuur 1A). In plaats van meer HBSS toe te voegen, wordt periodiek weken van de sectie in warm, vers medium aanbevolen als langere beeldvormingstijden nodig zijn. Het gebruik van perfusiekamers en lijm of laagsmeltende agarose om het weefsel te immobiliseren wordt ook aanbevolen wanneer langere experimenten moeten worden uitgevoerd.</li>
	<li>Bereid de microscoopfase voor op niet-gescande beeldvorming, waaronder het sluiten van alle deuren van de donkere incubatiekamer of het bedekken van de incubatiekamer met een zwarte nylon polyurethaan-gecoate stof.</li>
</ol>6. Beeldvorming
<ol><li>Selecteer de beeldmodus "niet-gedescand" langs het transmissiepad. Op deze manier wordt de opvang van het zwakke SH-signaal van tubuline geoptimaliseerd.</li>
	<li>Selecteer de doelstelling LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.</li>
	<li>Stel een laservermogen in tussen 13 mW en 26 mW, met een pixel dwell-tijd van 12,6 μs. Maak afbeeldingen die niet groter zijn dan 512 pixels x 512 pixels, met snelheid 5 en gemiddeld 2, voor een gemiddelde acquisitietijd van ongeveer 15 s. OPMERKING: Het gebruik van hogere laservermogens en/of langere verblijftijden kan het monster beschadigen (aanvullende figuur 1B).</li>
	<li>Maak eerst foto's met een 485 nm short-pass filter (SP485) en voeg in een tweede stap een scherp 405 nm bandpass filter (BP405; Figuur 3). Volg de stappen die worden beschreven in Aanvullend dossier 2. OPMERKING: Pseudo-brightfield-beelden kunnen door dezelfde detector worden gemaakt met behulp van het resterende laserlicht van een zichtbare lijn (405 nm of 488 nm lasers werken het beste).</li>
</ol>7. Verwerking van het cerebellum
<ol><li>Snijd eerst het cerebellum met een scalpel in twee hemisferen en lijm ze vervolgens op de vibratomondersteuning door het middelste gedeelte (het platte deel verkregen na het snijden).</li>
	<li>Sectie en afbeelding van het cerebellum op dezelfde manier als werd beschreven voor de hersenen (160 μm secties, dezelfde vibratome instellingen, hetzelfde blad, dezelfde microscoop instellingen, enz.). OPMERKING: Vanwege de anatomie van het cerebellum is de oriëntatie op het moment van sectie niet kritisch; in de meeste plakjes die buiten het oppervlak worden gegenereerd, zal er folia tot ver in de witte stof worden gesneden.</li>
</ol>

<ol><li>Palmiter, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+ablation+in+transgenic+mice+by+cell-specific+expression+of+a+toxin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene.</a> Cell. 50 (3), 435-443 (1987).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+the+type+II+isotype+of+beta-tubulin.+Preparation+of+isotypically+altered+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).</li>
<li>Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+monoclonal+antibody+specific+for+the+class+IV+isotype+of+beta-tubulin.+Purification+and+assembly+of+alpha+beta+II%2C+alpha+beta+III%2C+and+alpha+beta+IV+tubulin+dimers+from+bovine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+%CE%B2v+tubulin+in+the+cochlea+and+cultured+cells+with+a+novel+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).</li>
<li>Cross, A. R., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinky+microtubules%3A+Bending+and+breaking+induced+by+fixation+in+vitro+with+glutaraldehyde+and+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).</li>
<li>Van Steenbergen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+understanding+of+label-free+second+harmonic+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy of living cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Yu, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+microtubule+polarity+in+spindles+with+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation.</a> Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).</li>
<li>Bancelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+microtubules+polarity+in+mitotic+spindles+in+situ+using+Interferometric+Second+Harmonic+Generation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 6758(2017).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+polarity+microtubule+assemblies+imaged+in+native+brain+tissue+by+second-harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).</li>
<li>Psilodimitrakopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+effective+orientation+of+the+SHG+source+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons.</a> Optics Express. 17 (16), 14418(2009).</li>
<li>Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+imaging+reveals+cytoskeletal+deficit+predisposing+the+retinal+ganglion+cell+axons+to+atrophy+in+DBA%2F2J%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).</li>
<li>Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ABC+tubulinopathy+revealed+by+label-free+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy.</a> Scientific Reports. 12, 14417(2022).</li>
<li>Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taiep+rat%3A+A+myelin+mutant+with+an+associated+oligodendrocyte+microtubular+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect.</a> Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).</li>
<li>Duncan, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+Tubb4a+gene+leads+to+microtubule+accumulation+with+hypomyelination+and+demyelination%3A+Tubb4a+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation.</a> Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).</li>
<li>Garduno-Robles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+features+in+a+rat+model+of+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).</li>
<li>Lopez-Juarez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+impairment+in+H-ABC+tubulinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).</li>
<li>Alata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+evaluation+of+cerebellar+signs+of+H-ABC+tubulinopathy+in+a+patient+and+in+the+taiep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model.</a> Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).</li>
<li>Parodi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy%3A+From+fundamentals+to+applications+in+live+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).</li>
<li>Lefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomedical+multiphoton+microscopy+and+its+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).</li>
<li>vander Knaap, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+syndrome+characterized+by+hypomyelination+with+atrophy+of+the+basal+ganglia+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).</li>
<li>Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-dependent+optical+second-harmonic+imaging+of+a+rat-tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon.</a> Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
<li>Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+tubulin+code%3A+From+the+tubulin+molecule+to+neuronal+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

SHG-microscopie maakt deel uit van een groep niet-lineaire optische technieken, waaronder twee-foton excitatiemicroscopie, derde harmonische generatie microscopie en coherente anti-Stokes Raman verstrooiingsmicroscopie, die hebben bijgedragen aan het uitbreiden van het scala aan toepassingen van conventionele optische microscopie naar de levenswetenschappen20.
In het bijzonder hebben de belangrijkste sterkte en zwakte van SHG-microscopie betrekking op dezelfde toestand:...

De optische beeldvorming van cytoskeletale structuren in weefsels en orgaanpreparaten is geen gemakkelijke taak. Cytoskeletale filamenten zijn alomtegenwoordig, dus als generieke kleuring wordt uitgevoerd, bijvoorbeeld tegen alfa-tubuline of bèta-actine of mogelijk keratine in een epitheelmonster, zal het signaal waarschijnlijk vrij homogeen over het monster worden verdeeld. Om de kleuring te beperken tot een meer betekenisvolle subset van cellulaire componenten, kan men transgene muizen gebruiken met gerichte expressie1 of van plan zijn om isovormspecifieke antilichamen te gebruiken. Hoewel er maar heel weinig van deze laatste op de markt zijn (en er maar heel weinig bestaan 2,3,4), kan een transgeen diermodel beschikbaar zijn. Het moet echter door het laboratorium worden verworven en op de juiste manier worden gehuisvest, met alle kosten die met het proces gemoeid zijn. Bepaalde antilichamen of chemicaliën, bijvoorbeeld fluorofoor-geconjugeerde geneesmiddelen zoals falloïdine of paclitaxel, kunnen gedeeltelijk of volledig onverenigbaar zijn met gebruik in levende cellen of weefsels, waardoor hun toepasbaarheid beperkt blijft tot alleen studies van vaste monsters.
In het geval van tubuline moet rekening worden gehouden met een bijkomend aspect, namelijk de gevoeligheid van het polymeer voor fixatie. Conventionele chemische fixatie met formaldehyde staat erom bekend dat het niet geschikt is om de integriteit van microtubuli optimaal te behouden5. Bovendien bevestigt een recent rapport dat formaldehyde-crosslinking subtiele veranderingen in de ultrastructuur van de microtubule induceert, vergelijkbaar met wat er gebeurt met de binding van sommige geneesmiddelen of fysiologische moleculen zoals GTP6.
De directe visualisatie van microtubuli in niet-gekleurde, niet-gefixeerde monsters is daarom vaak wenselijk. Om dit te bereiken, is een technische oplossing tweede harmonische generatie (SHG) microscopie7, die is gebaseerd op het vermogen van bundels parallelle microtubuli om als harmonoforen te fungeren en om frequentieverdubbeld licht uit te zenden wanneer het goed wordt verlicht met een intense, gepulseerde infraroodlaser. Hoewel een sterker en stabieler tweede harmonisch signaal kan worden gegenereerd uit collageen en myosine, de enige andere twee biologische materialen waarvan bekend is dat ze in staat zijn tot frequentieverdubbeling, is het signaal van tubuline tot nu toe vooral gebruikt om mitotische spindelherschikkingen 8,9,10 en axonale microtubulimorfologie 11,12,13 te bestuderen.
In dit werk introduceren we een nieuw gebruik van SHG-microscopie als een diagnostisch hulpmiddel om weefsels van het centrale zenuwstelsel (CZS) die zijn aangetast door tubuline bèta 4 A (TUBB4A) tubulinopathie te onderscheiden van hun gezonde tegenhangers14. Sommige van de mutaties die optreden in deze overwegend neurale isovorm van tubuline, zoals die welke hypomyelinisatie en atrofie van de basale ganglia en het cerebellum (H-ABC) veroorzaken, induceren microtubuli-overvulling in de oligodendrocyten15,16; de cytoskeletale veranderingen zijn op hun beurt geassocieerd met stroomafwaartse effecten zoals dysmyelinisatie, met diepgaande aantasting van de motorische en sensorische paden 16,17,18,19. Het taiep murine-model dat in dit werk wordt gebruikt, toont abnormaal microtubuligehalte in de oligodendrocyten en recapituuleert de meeste sensorisch-motorische symptomen van H-ABC-patiënten17. Het protocol legt uit hoe structuren kunnen worden afgebeeld als het corpus callosum en het cerebellum, die meestal sterk gemyeliniseerd zijn en die ernstig zijn aangetast bij menselijke patiënten en bij de taiep rat19, om de verschillen in SH-signalen tussen gezonde en mutante weefsels te benadrukken.

<table><tbody><tr><td>405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter&nbsp;</td><td>Semrock</td><td>FF01-405/10-25</td><td>32 mm diameter, met behuizingring</td></tr><tr><td>Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td><td>5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Dik&nbsp;</td></tr><tr><td>Blades voor vibratome</td><td>elke commerciële; b.v. Wilkinson Sword</td><td></td><td>&nbsp;Klassieke roestvrijstalen dubbelzijdige scheermessen</td></tr><tr><td>Celcultuur schalen, 35 mm</td><td>elke commerciële; b.v. Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>Omgekeerde microscoop, gebruikte objectief is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Koeler</td><td>elke commerciële</td><td></td><td>Elke geïsoleerde, polystyreen doos kan werken, om het monster op ongeveer 37 &deg;C te houden</td></tr><tr><td>Corn stach</td><td>b.v. Maizena</td><td></td><td>Uit de supermarkt</td></tr><tr><td>Dekvlakken #1.5</td><td>elke commerciële</td><td></td><td>Rechthoekig</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>b.v. Loctite</td><td></td><td>Om de hersenen aan het afdektape te lijmen</td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>fine science tools</td><td>11412-11</td><td>Om weefselsecties te manipuleren door ze vanuit de hersenvliezen te hanteren</td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>fine science tools</td><td>14370-22</td><td>Om de huid te snijden&nbsp;</td></tr><tr><td>Fijne schaar met gebogen punt</td><td>fine science tools</td><td>14061-09</td><td>Om langs de middenlijn te snijden</td></tr><tr><td>Formaldehyde 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Om 1:10 te verdunnen in PBS</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>fine science tools</td><td>16000-14</td><td>Om het bot te snijden</td></tr><tr><td>Gel packs</td><td>elke commerciële</td><td></td><td>Voorverwarmd tot 37 &deg;C, om de temperatuur binnen de koeler te helpen behouden</td></tr><tr><td>Glas Pasteur pijpje, gemodificeerd</td><td>elke commerciële</td><td></td><td>Om het weefselsegment over te brengen</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td>Kan worden bereid uit poeders</td></tr><tr><td>Kelly hemostats</td><td>fine science tools</td><td>13018-14</td><td>Om het bot te scheiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Afdektape</td><td>elke commerciële</td><td></td><td>Om het oppervlak van de monsterplaat te beschermen</td></tr><tr><td>NDD module, type C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1410-101</td><td>Om het signaal te detecteren, lichtverlies te verminderen. Bevat de 000000-1935-163 filter set met de SP485</td></tr><tr><td>Offset bot knippers</td><td>fine science tools</td><td>16101-10</td><td>Om het bot te snijden</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td>Kan worden bereid uit poeders of tabbladen</td></tr><tr><td>Gepulsaalde laser</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Vision II</td><td>680&ndash;1080 nm instelbare laser</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>elke commerciële</td><td></td><td>Rechte kling met scherpe punt</td></tr><tr><td>Standaard patroon pincetten</td><td>fine science tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Vannas veer schaar</td><td>fine science tools</td><td>15018-10</td><td>Om de hersenvliezen te snijden die verbonden blijven aan zowel de plak die is verkregen door vibratome snijden als het segment dat aan de monsterplaat is vastgelijmd.</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>elke commerciële; b.v. Leica</td><td>VT1200</td><td></td></tr></tbody></table>

labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

De bevredigende visualisatie van cytoskeletale componenten in de hersenen is een uitdaging. De alomtegenwoordige verdeling van de netwerken van microtubuli, microfilamenten en intermediaire filamenten in alle neurale weefsels, samen met de variabiliteit in de uitkomsten van fluorescente eiwitfusiestrategieën en hun beperkte toepasbaarheid op dynamische studies van antilichamen en geneesmiddelen als chromofoorvoertuigen, maken klassieke optische benaderingen niet zo effectief als voor andere eiwitten. Wanneer tubuline moet worden bestudeerd, is de labelvrije generatie van tweede harmonischen een zeer geschikte optie vanwege de niet-centrosymmetrische organisatie van het molecuul. Deze techniek, wanneer geconjugeerd aan microscopie, kan kwalitatief de volumetrische verdeling van parallelle bundels microtubuli in biologische monsters beschrijven, met als bijkomend voordeel dat het werkt met verse weefsels die niet-gefixeerd en niet-gepermeabiliseerd zijn. Dit werk beschrijft hoe tubuline kan worden afgebeeld met een commerciële tweede harmonische generatie microscopie-opstelling om microtubuli in de met tubuline verrijkte structuren van de oligodendrocyten te markeren, zoals bij hypomyelinisatie met atrofie van de basale ganglia en cerebellum (H-ABC) tubulinopathie, een recent beschreven myelinestoornis.

De beelden die met deze methodologie worden verkregen, hebben een intrinsiek laag achtergrondniveau vanwege het zeer beperkte aantal harmonoforen in biologische weefsels, wat een van de belangrijke voordelen van de methode is.
Wanneer de vezels van het corpus callosum in beeld worden gebracht, zijn vezelachtige korte structuren en afgeronde elementen consistent te vinden in het taiepbrein (figuur 3B), terwijl het corpus callosum van het controlebrein een ...

In dit artikel presenteren we een protocol om microtubule-geladen oligodendrocyten te detecteren in een model van tubulinopathie door middel van een eenvoudige, innovatieve tweede harmonische generatie microscopiebenadering.

Labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

Second-Harmonic Generation imaging van biologische monsters is een optische techniek die de visualisatie van niet-centrosymmetrische moleculen en hun assemblages mogelijk maakt zonder de noodzaak van een tag of een kleurstof. De beelden die met deze methode worden gegenereerd, hebben een lage achtergrond, omdat zeer weinig biologische moleculen als een harmonale kracht kunnen fungeren. Dit protocol beschrijft de toepassing van de techniek voor diagnostische beeldvorming van Tubulin beta-4A in het taiep diermodel.Tubulinopathieën zijn recent beschreven ziekten. Om deze reden is er een beperkte hoeveelheid informatie beschikbaar over de basismechanismen die ten grondslag liggen aan de pathofysiologie op cellulair niveau. Om te beginnen, schakelt u de pulslaser in om te garanderen dat deze klaar is om te lase op een optimaal en stabiel vermogensniveau.Om tissulaire microtubuli te bestuderen, wordt 10 tot 20% van het beschikbare laservermogen gebruikt, wat in het beschreven systeem overeenkomt met 13 tot 26 milliwatt gemeten op het achterste brandpuntsvlak van het objectief. Draai de laser voorafgaand aan de beeldvorming op 810 nanometer. Zorg er vervolgens voor dat de microscoop koehler-uitgelijnd is met het doel dat wordt gebruikt voor de tweede harmonische generatie of SHG-beeldvorming.Verwijder ongewenste filters uit het optische detectiepad en zorg ervoor dat het condensormembraan volledig is geopend en er geen licht onnodig wordt gestopt. Bereid een olie-onderdompelingsobjectief van 25x bij 0,8 numerieke opening voor met een kleine druppel dompelolie in de lens. Volg de stappen die in de tabel hier worden vermeld, behalve het laservermogen dat minder dan 5% is voor maïzena.Afbeelding droge maïzena ingeklemd tussen glazen dia's. met SHG-parameters om SHG-beelden te genereren, onthullen ze de laserpolarisatierichting. Leg één afbeelding vast van schaarse maïzenakorrels en markeer de oriëntatie van de SHG-lobben in het XY-vlak dat overeenkomt met de laserpolarisatieoriëntatie.Neem voor de controle nog een afbeelding van hetzelfde monster dat een halve golfplaat in het optische pad steekt om de oscillatierichting van de laser te wijzigen. Het resulterende beeld geeft gedraaide SHG-signaallobben weer. Als u een ander bandpass-filter voor de SHG gebruikt, moet u ervoor zorgen dat deze optimale transmissie-eigenschappen heeft door de afbeeldingen en de signaalintensiteiten pixel voor pixel langs de scanlijn te vergelijken.Bereid een vibratome bufferbak gevuld met een warme Hanks'Balanced Salt Solution of HBSS. Bevestig de hersenen aan de monsterplaat met behulp van cyanoacrylaatlijm via een stuk afplaktape. Het meest caudale deel maakt contact met de lijm, zodat de bruikbare coronale secties uit het tegenovergestelde rostrale gedeelte kunnen worden gesneden.Breng de monsterplaat over op de magnetische steun in de bufferlade. Begin met het snijden van secties van 300 tot 500 micron totdat de plakjes het hele hersenoppervlak omvatten. Verminder vervolgens de dikte van de sectie tot 160 micron.Zodra een sectie van 160 micron is gesneden ter hoogte van het corpus callosum, herstelt u het met een gemodificeerde glazen Pasteur-pipet met een grote flensopening. Breng de sectie over naar een schone petrischaal met nieuwe warme HBSS of rechtstreeks op de afdekslip of glazen bodemschaal voor microscopie. Plaats het monster onder de microscoop en plaats het op de juiste manier onder het objectief door directe observatie door de oculairen met doorgelaten licht.Verwijder de overtollige HBSS zodat een dunne vloeibare film het hele monster bedekt. Controleer de vloeistoffilm om de paar minuten visueel om overmatige verdamping en droging van het monster te voorkomen. Bereid de microscoopfase voor op niet-gescande beeldvorming, waaronder het sluiten van alle deuren van de donkere incubatiekamer of het bedekken van de incubatiekamer met een zwarte nylon polyurethaan gecoate stof.Selecteer de niet-gedescande beeldmodus langs het transmissiepad. Op deze manier wordt de opvang van het zwakke SH-signaal van tubuline geoptimaliseerd. Selecteer vervolgens het doel.Stel vervolgens een laservermogen in met een pixel-dwell-tijd van 12,6 microseconden. Maak foto's die niet groter zijn dan 512 bij 512 pixels met snelheid vijf en gemiddeld twee voor een gemiddelde acquisitietijd van 15 seconden. Leg eerst beelden vast met een 485 nanometer shortpass-filter en voeg in een tweede stap een scherp 405 nanometer bandpass-filter toe.Snijd het cerebellum met een scalpel in twee hemisferen en bevestig ze aan de vibratomenondersteuning door het middelste gedeelte. Sectie en afbeelding van het cerebellum met behulp van dezelfde vibratome, mes en microscoop instellingen als beschreven voor de hersenen. Wanneer de vezels van het corpus callosum in beeld worden gebracht, worden vezelachtige korte structuren en afgeronde elementen waargenomen in de taiep-hersenen.Daarentegen vertoont het corpus callosum van het controlebrein een veel heterogener en isotroop signaal in het hele hersengebied. De oorsprong van het differentiële signaal ligt specifiek in het fenomeen tweede harmonische generatie, omdat het toevoegen van het smalle bandpass-filter alleen de niet-specifieke signaalintensiteit van de controlebeelden vermindert, terwijl dit lage diffuse signaal selectief wordt verwijderd rond de soma-achtige en de korte langwerpige structuren in de taiep-beelden die altijd intens SH-licht genereren. In cerebellair controleweefsel van witte stof werd de volledige afwezigheid van SH-signaal waargenomen.De Purkinje-cellen zijn nauwelijks zichtbaar bij gebruik van het short pass-filter en de langwerpige en afgeronde structuren blijven bestaan in het SH-beeld van het taiepweefsel. Een cruciale stap om het beste beeld te verkrijgen, is om weefselsecties zo dun mogelijk te snijden. Bovendien vereist het werken met acute weefselsecties snelle protocollen om weefselverslechtering te voorkomen.Daarom is het cruciaal om het optische systeem vooraf in te stellen en te controleren. Het tweede harmonische signaal van microtubuli is zwakker dan het tweede harmonische signaal van zetmeel. Daarom moet er meer laservermogen worden gebruikt voor het in beeld brengen van microtubuli.Het laservermogen moet voorzichtig worden verhoogd, omdat, aangezien een hoog numeriek diafragmadoel wordt gebruikt voor beeldvorming, de intensiteit bij het monster snel zou toenemen Met beeldvorming van de tweede harmonische generatie worden de pathologische veranderingen in de centrale myelinomatica van het tubulinopathische model snel en gemakkelijk geïdentificeerd. Mogelijke toepassingen van deze techniek zijn onder meer het gebruik ervan voor de studie van de basismechanismen van H-ABC tubulinopathie en voor de beoordeling van farmacologische therapieën om patiënten te behandelen. Op de lange termijn heeft de techniek het potentieel om een aanvullend diagnostisch hulpmiddel te worden dat intracranieel of op nieuwe biopsieën kan worden gebruikt.

label-free-non-linear-optics-for-study-tubulin-dependent-defects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we describe the interference reflection microscopy (IRM) technique to visualize microtubules growing on a coverslip surface in the presence of a suitable buffer. Upon illumination with incident light, the coverslip-buffer interface and buffer-microtubule interface reflect light, which combines to create an interference pattern, enabling the visualization of microtubules as high-contrast images against a bright background.

Interference Reflection Microscopy for Label-Free Visualization of Microtubule Dynamics

Source: Piazza, V., et al., Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the procedure for imaging microtubule abnormalities in a rat brain tissue slice using a two-photon excitation microscope. It employs second harmonic generation (SHG) signals to detect tubulin defects and reduced myelin production.

Second Harmonic Generation Imaging in a Rat Model to Study Tubulin Defects

We presenteren een protocol dat gebruikmaakt van twee-foton excitatie time-lapse microscopie om gelijktijdig de dynamica van axon- en myeline-verwondingen in real time te visualiseren. Dit voorgestelde protocol maakt studies mogelijk van zowel intrinsieke als extrinsieke factoren die het lot van centrale gemyeliniseerde axonen na verwonding kunnen beïnvloeden en kunnen bijdragen aan permanente klinische handicaps.

Een Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Immunolabeling methoden voor het analyseren van verschillende populaties van microtubuli in de ontwikkelende hersenen van de zebravis zijn hier beschreven, die over het algemeen van toepassing zijn op andere weefsels. Het eerste protocol schetst een geoptimaliseerde methode voor immunolabeling stabiele en dynamische microtubuli. Het tweede protocol biedt een methode om beeld en kwantificeren van ontluikende microtubuli specifiek.

Gebruik van Immunolabeling voor het analyseren van ontluikende, stabiele en dynamische microtubuli in de zebravis Embryo

Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor imaging-myelinated axonen in een segment van de vaste hersenen met behulp van een label-vrije nanoschaal imaging techniek gebaseerd op spectrale reflectometrie.

Spectrale Reflectometric microscopie op Myelinated axonen In Situ

Hier presenteren we een robuuste en gedetailleerde methode van microtubulus dynamica analyse in cellen gesynchroniseerd in tijdens met behulp van Live-cel spinnen schijf confocale microscopie en MATLAB gebaseerde beeldverwerking.

Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Dit protocol is gewijd aan de microtubule plus-end visualisatie door EB3-eiwittransfectie om hun dynamische eigenschappen in primaire celkweek te bestuderen. Het protocol werd geïmplementeerd op menselijke primaire huidfibroblasten verkregen van patiënten met de Ziekte van Huntington.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Dit artikel presenteert een protocol voor de vorming van microtubule-assemblages in de vorm van tactoïden met behulp van MAP65, een plantaardige microtubule crosslinker, en PEG als een crowding agent.

Zelfassemblage van Microtubule Tactoids

Ontdek labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline met behulp van second harmonic generation microscopie. Deze methode biedt nieuwe inzichten in oligodendrocietfunctie.

Labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline

Meer video's verkennen