Labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline

Second-Harmonic Generation imaging van biologische monsters is een optische techniek die de visualisatie van niet-centrosymmetrische moleculen en hun assemblages mogelijk maakt zonder de noodzaak van een tag of een kleurstof. De beelden die met deze methode worden gegenereerd, hebben een lage achtergrond, omdat zeer weinig biologische moleculen als een harmonale kracht kunnen fungeren. Dit protocol beschrijft de toepassing van de techniek voor diagnostische beeldvorming van Tubulin beta-4A in het taiep diermodel.

Tubulinopathieën zijn recent beschreven ziekten. Om deze reden is er een beperkte hoeveelheid informatie beschikbaar over de basismechanismen die ten grondslag liggen aan de pathofysiologie op cellulair niveau. Om te beginnen, schakelt u de pulslaser in om te garanderen dat deze klaar is om te lase op een optimaal en stabiel vermogensniveau.

Om tissulaire microtubuli te bestuderen, wordt 10 tot 20% van het beschikbare laservermogen gebruikt, wat in het beschreven systeem overeenkomt met 13 tot 26 milliwatt gemeten op het achterste brandpuntsvlak van het objectief. Draai de laser voorafgaand aan de beeldvorming op 810 nanometer. Zorg er vervolgens voor dat de microscoop koehler-uitgelijnd is met het doel dat wordt gebruikt voor de tweede harmonische generatie of SHG-beeldvorming.

Verwijder ongewenste filters uit het optische detectiepad en zorg ervoor dat het condensormembraan volledig is geopend en er geen licht onnodig wordt gestopt. Bereid een olie-onderdompelingsobjectief van 25x bij 0,8 numerieke opening voor met een kleine druppel dompelolie in de lens. Volg de stappen die in de tabel hier worden vermeld, behalve het laservermogen dat minder dan 5% is voor maïzena.

Afbeelding droge maïzena ingeklemd tussen glazen dia's. met SHG-parameters om SHG-beelden te genereren, onthullen ze de laserpolarisatierichting. Leg één afbeelding vast van schaarse maïzenakorrels en markeer de oriëntatie van de SHG-lobben in het XY-vlak dat overeenkomt met de laserpolarisatieoriëntatie.

Neem voor de controle nog een afbeelding van hetzelfde monster dat een halve golfplaat in het optische pad steekt om de oscillatierichting van de laser te wijzigen. Het resulterende beeld geeft gedraaide SHG-signaallobben weer. Als u een ander bandpass-filter voor de SHG gebruikt, moet u ervoor zorgen dat deze optimale transmissie-eigenschappen heeft door de afbeeldingen en de signaalintensiteiten pixel voor pixel langs de scanlijn te vergelijken.

Bereid een vibratome bufferbak gevuld met een warme Hanks'Balanced Salt Solution of HBSS. Bevestig de hersenen aan de monsterplaat met behulp van cyanoacrylaatlijm via een stuk afplaktape. Het meest caudale deel maakt contact met de lijm, zodat de bruikbare coronale secties uit het tegenovergestelde rostrale gedeelte kunnen worden gesneden.

Breng de monsterplaat over op de magnetische steun in de bufferlade. Begin met het snijden van secties van 300 tot 500 micron totdat de plakjes het hele hersenoppervlak omvatten. Verminder vervolgens de dikte van de sectie tot 160 micron.

Zodra een sectie van 160 micron is gesneden ter hoogte van het corpus callosum, herstelt u het met een gemodificeerde glazen Pasteur-pipet met een grote flensopening. Breng de sectie over naar een schone petrischaal met nieuwe warme HBSS of rechtstreeks op de afdekslip of glazen bodemschaal voor microscopie. Plaats het monster onder de microscoop en plaats het op de juiste manier onder het objectief door directe observatie door de oculairen met doorgelaten licht.

Verwijder de overtollige HBSS zodat een dunne vloeibare film het hele monster bedekt. Controleer de vloeistoffilm om de paar minuten visueel om overmatige verdamping en droging van het monster te voorkomen. Bereid de microscoopfase voor op niet-gescande beeldvorming, waaronder het sluiten van alle deuren van de donkere incubatiekamer of het bedekken van de incubatiekamer met een zwarte nylon polyurethaan gecoate stof.

Selecteer de niet-gedescande beeldmodus langs het transmissiepad. Op deze manier wordt de opvang van het zwakke SH-signaal van tubuline geoptimaliseerd. Selecteer vervolgens het doel.

Stel vervolgens een laservermogen in met een pixel-dwell-tijd van 12,6 microseconden. Maak foto's die niet groter zijn dan 512 bij 512 pixels met snelheid vijf en gemiddeld twee voor een gemiddelde acquisitietijd van 15 seconden. Leg eerst beelden vast met een 485 nanometer shortpass-filter en voeg in een tweede stap een scherp 405 nanometer bandpass-filter toe.

Snijd het cerebellum met een scalpel in twee hemisferen en bevestig ze aan de vibratomenondersteuning door het middelste gedeelte. Sectie en afbeelding van het cerebellum met behulp van dezelfde vibratome, mes en microscoop instellingen als beschreven voor de hersenen. Wanneer de vezels van het corpus callosum in beeld worden gebracht, worden vezelachtige korte structuren en afgeronde elementen waargenomen in de taiep-hersenen.

Daarentegen vertoont het corpus callosum van het controlebrein een veel heterogener en isotroop signaal in het hele hersengebied. De oorsprong van het differentiële signaal ligt specifiek in het fenomeen tweede harmonische generatie, omdat het toevoegen van het smalle bandpass-filter alleen de niet-specifieke signaalintensiteit van de controlebeelden vermindert, terwijl dit lage diffuse signaal selectief wordt verwijderd rond de soma-achtige en de korte langwerpige structuren in de taiep-beelden die altijd intens SH-licht genereren. In cerebellair controleweefsel van witte stof werd de volledige afwezigheid van SH-signaal waargenomen.

De Purkinje-cellen zijn nauwelijks zichtbaar bij gebruik van het short pass-filter en de langwerpige en afgeronde structuren blijven bestaan in het SH-beeld van het taiepweefsel. Een cruciale stap om het beste beeld te verkrijgen, is om weefselsecties zo dun mogelijk te snijden. Bovendien vereist het werken met acute weefselsecties snelle protocollen om weefselverslechtering te voorkomen.

Daarom is het cruciaal om het optische systeem vooraf in te stellen en te controleren. Het tweede harmonische signaal van microtubuli is zwakker dan het tweede harmonische signaal van zetmeel. Daarom moet er meer laservermogen worden gebruikt voor het in beeld brengen van microtubuli.

Het laservermogen moet voorzichtig worden verhoogd, omdat, aangezien een hoog numeriek diafragmadoel wordt gebruikt voor beeldvorming, de intensiteit bij het monster snel zou toenemen Met beeldvorming van de tweede harmonische generatie worden de pathologische veranderingen in de centrale myelinomatica van het tubulinopathische model snel en gemakkelijk geïdentificeerd. Mogelijke toepassingen van deze techniek zijn onder meer het gebruik ervan voor de studie van de basismechanismen van H-ABC tubulinopathie en voor de beoordeling van farmacologische therapieën om patiënten te behandelen. Op de lange termijn heeft de techniek het potentieel om een aanvullend diagnostisch hulpmiddel te worden dat intracranieel of op nieuwe biopsieën kan worden gebruikt.