Name: In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer de in ovo intravasculaire injectietechniek voor kippenembryo's om exogene materialen zoals plasmiden en PGC's te introduceren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar ontwikkelingsbiologie en genetische transfectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31972547). We waarderen de copyediting door Jing Wang en de voice-over door Malik Donlic aan de Washington State University, USA.

Alle procedures met betrekking tot de verzorging en het gebruik van dieren voldeden aan de richtlijnen van het Amerikaanse National Institute of Health (NIH Pub. No. 85-23, herzien in 1996) en de protocollen voor kippenembryo's werden goedgekeurd door de Laboratory Animal Management and Experimental Animal Ethics Committee van Yangzhou University, China (nr. 201803124).
1. Verzameling en bereiding van bevruchte eieren
OPMERKING: In tegenstelling tot zoogdieren heeft de kip miljoenen follikels in een enkele eierstok, maar slechts een paar van deze follikels zijn volwassen genoeg om te ovuleren. Elke follikel bevat één eicel of kiemcel. Zodra de follikel rijpt en zijn dooier loslaat, wordt deze opgenomen in de trechter van de eileider. Terwijl de follikel de halsbuik van de eileider binnendringt, bindt sperma zich aan het ei in het lichaam van de kip en vormt het calcium in het lichaam van de kip een schaal die het bevruchte ei omhult en een ei met zachte schaal in het lichaam vormt. De calciumschaal wordt geleidelijk dikker totdat het ei is geproduceerd.
<ol><li>Verzamel bevruchte eieren bij een lokale verkoper of instelling, die gedurende 1 week bij 16 °C kunnen worden bewaard. OPMERKING: De hoge opslagtemperatuur zal het embryo helpen zich te ontwikkelen, terwijl de lage temperatuur de levensvatbaarheid van het embryo zal verminderen. De embryo's zullen zich niet ontwikkelen als de bewaartijd te lang is.</li>
	<li>Schrob de eierschaal zacht en langzaam met 75% ethanol voordat u de eieren overbrengt naar de broedmachine.</li>
	<li>Leg de eieren zijwaarts, netjes op een rooster in een broedmachine bij 37,8 °C en 60% luchtvochtigheid. Na 60 uur incubatie (HH stadium 17) zullen embryo's zichtbare bloedvaten ontwikkelen en begint het hart15 te kloppen. OPMERKING: Na 2 dagen incubatie verschijnen kleine primordiale stippen, het vroege stadium van het hart. Dit proces wordt cherrybeading genoemd. Na ~ 2,5 dag worden hart- en andere lichaamssegmenten gevormd met zichtbare bloedvaten.</li>
</ol>2. Voorbereiding vóór injectie
<ol><li>Bereid glazen haarvaten voor die als naalden worden gebruikt. Trek vóór de injectie met behulp van de trekker 90 mm glazen haarvaten met een buitendiameter van 1 mm en een binnendiameter van 0,6 mm. Breek tips met behulp van een tang (de hoek van het glazen capillair is meestal 45 °) en steriliseer de haarvaten onder UV-licht gedurende 2 uur.</li>
	<li>Bereid exogene materialen zoals plasmiden, verpakte lentivirussen en PPC's voor.<ol>
<li>Meng voorzichtig het plasmide pEGFP-N1 (een verbeterde GFP-tot expressie brengende plasmide, 1μg/μL) met liposoom in een verhouding van 1:3 (m/v). Voeg water toe om een uiteindelijke DNA-concentratie van 10 ng/μL te verkrijgen. Laat het DNA-mengsel vóór de injectie gedurende 20 minuten bij 37 °C zitten.</li>
		<li>Ontdooi virussen op ijs vóór injectie. De titer van lentivirus die voor injectie wordt gebruikt, moet meer dan 5 x 106 Tu / ml zijn.</li>
		<li>Verdun ouderlijke of gemodificeerde gonade PPC's (E4.5, HH stadium 24) tot 2.000-5.000 cellen/μL. OPMERKING: Hier hebben we de injectieprocedure met trypan blue getoond.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vensters
<ol><li>Voordat u de embryo's blootstelt, steriliseert u ze door voorzichtig en zacht het oppervlak van de eierschalen af te vegen met 75% alcohol met behulp van een watje, zodat de stompe rand van de eieren grondig wordt gesteriliseerd.</li>
	<li>Tik na de sterilisatie voorzichtig met een tang op het stompe uiteinde om een klein venster (0,5 cm x 0,5 cm) op het oppervlak van de eierschaal te creëren om het embryo bloot te leggen. Verwijder het embryomembraan en leg het ei op de houder onder de dissectiemicroscoop.</li>
</ol>4. Injectie
<ol><li>Zoek naar bloedvaten onder de microscoop en pas de focus van de dissectiemicroscoop aan om het embryo te lokaliseren en zoek vervolgens het bloedvat klaar voor injectie.</li>
	<li>Vul de glazen naald met de exogene oplossing (plasmide, lentivirus of PPC's) langzaam met behulp van een pipet, waarbij luchtbellen in de naald worden vermeden.</li>
	<li>Richt de naald met exogene oplossing op het bloedvat, waarbij de naald parallel aan het bloedvat wordt geïnjecteerd.</li>
	<li>Steek de gevulde naald voorzichtig in het vat en zet de pomp aan om de oplossing uit te werpen (meestal is het geïnjecteerde volume ~ 1-5 μL) onder de microscoop. De luchtpompdruk moet laag genoeg zijn om de vernietiging van bloedvaten te voorkomen, omdat de te hoge luchtdruk de bloedvaten zou beschadigen, wat leidt tot een hoge snelheidsstroom.<ol>
<li>Zodra de exogene oplossing in het vat is geïnjecteerd, moet u ervoor zorgen dat de kleur van het vat verandert in de kleur van de oplossing en zich herstelt tot rood in 2-5 s, wat aangeeft dat de exogene oplossing met succes aan het vat wordt afgeleverd. Op dit punt komt de oplossing de slagader binnen en met het kloppen van het hart wordt het terug naar het embryo gecirculeerd via de slagader en vervolgens naar de ader. OPMERKING: Er zijn twee injectieplaatsen voor vasculaire injectie (figuur 1B): één is het hoofd, waar de exogene oplossing wordt geïnjecteerd vanuit de ader in het hoofd van het embryo en in het hart via de bloedstroom en vervolgens circuleert naar het hele embryo met kloppend hart (figuur 1B, pijl 1). Een andere is via de dorsale aorta van embryobloed; de exogene oplossing wordt geïnjecteerd en verspreidt zich naar het hele embryo (figuur 1B. Pijl 2) met het kloppen van het embryonale hart.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder na de injectie het ei uit de stereomicroscoop en laat 200 μL penicilline-oplossing in de eierschaal vallen. Knip een 3 cm lang stuk medische tape en sluit het raam af. Schraap de tape voorzichtig met een schaar om eventuele luchtbellen eruit te persen en knip vervolgens een ander stuk om de opening over te sluiten.</li>
	<li>Label en plaats het geïnjecteerde ei terug in de incubator en incubeer tot het vereiste ontwikkelingsstadium of uitkomen.</li>
</ol>

<ol><li>Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+embryo+as+a+model+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Chicken embryo as a model in epigenetic research.</a> Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).</li>
<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarnell%2C+DK+%22Developmental+Biology+Protocols%22">Developmental Biology Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).</li>
<li>Fauzia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo%3A+a+preclinical+model+for+understanding+ischemia-reperfusion+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1034(2018).</li>
<li>Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+embryo+as+an+in+vivo+experimental+model+for+drug+testing%3A+Advantages+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations.</a> Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (9), e408(2007).</li>
<li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3792(2012).</li>
<li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55628(2017).</li>
<li>van de Lavoir, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+genetically+modified+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of genetically modified primordial germ cells.</a> Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).</li>
<li>Ballantyne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+primordial+germ+cells+are+bipotent+for+male+or+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827(2021).</li>
<li>Park, T. S., Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+into+primordial+germ+cells+is+an+efficient+tool+for+transgenesis+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+insertion+into+Z+chromosome+of+chicken+primordial+germ+cells+for+avian+sexing+model+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.</a> The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).</li>
<li>Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHan%2C+JY+%22Avian+and+Reptilian+Developmental+Biology%3A+Methods+and+Protocols%22">Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).</li>
<li>Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+chicken+primordial+germ+cells+isolated+from+embryonic+blood+and+production+of+germline+chimaeric+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens.</a> Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization+and+germline+chimera+preparation+of+primordial+germ+cells+from+the+Chinese+Meiling+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken.</a> Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+genes+and+pathways+in+chicken+germ+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBE2I+stimulates+female+gonadal+differentiation+in+chicken+%28Gallus+gallus%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Agriculture%22%5BJournal%5D)">UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos.</a> Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGCS1+promotes+male+differentiation+of+chicken+embryos+by+regulating+the+generate+of+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22All+Life%22%5BJournal%5D)">HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol.</a> All Life. 14 (1), 577-587 (2021).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin1z+induces+the+male+pathway+in+the+chicken+by+down-regulating+Tcf4%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4.</a> Gene. 780, 145521(2021).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+viable+chicken+by+allogeneic+transplantation+of+primordial+germ+cells+induced+from+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 2989(2021).</li>
</ol>

Er werden geen belangenconflicten aangegeven.

De methode van in ovo intravasculaire injectie van kippenembryo's is geoptimaliseerd voor exogene materialen (vector, virale of PPC's) die in het embryo moeten worden overgebracht. Op basis van deze methode construeerden we kippenembryomodellen met stabiele genoverexpressie of interferentie (SpinZ, JUN, UBE2I, enz.) 17,18,19. Deze gevestigde modellen bewijzen de haalbaarheid van deze aanpak. Bovendien hebben we niet al...

Kippenembryo's worden al eeuwenlang op grote schaal gebruikt in ontwikkelings-, immunologische, pathologische en andere biologische toepassingen 1,2,3. Ze hebben veel inherente voordelen ten opzichte van andere diermodellen in de studie van toxicologie en celbiologie4. Kippenembryo's zijn gemakkelijk toegankelijk en kunnen in vitro worden gemanipuleerd en direct worden geobserveerd in elk ontwikkelingsstadium, wat een handig embryo-onderzoeksmodelsysteem biedt.
Over het algemeen hebben de huidige methoden voor het afleveren van kippenembryo's zoals elektrotransfectie en subgerminale holte-injectie beperkingen zoals de vereiste van gespecialiseerde apparatuur en een ontworpen programma, en inefficiëntie als gevolg van de aanwezigheid van dooier en albumine 5,6,7. Hier tonen we een eenvoudige en efficiënte behandelingsmethode voor het afleveren van exogene materialen in kippenembryo's. Dit kan een krachtig hulpmiddel zijn dat wordt gebruikt bij de studie van ontwikkelingsbiologie. De geïnjecteerde materialen verspreiden zich via de bloedcirculatie naar het hele embryo. Tijdens de vroege ontwikkeling van kippenembryo's konden de PPC's door bloed migreren, de genitale richel koloniseren en zich vervolgens ontwikkelen tot gameten, die een waardevol mogelijk pad bieden om exogene materialen af te leveren8. Nu is deze methode op grote schaal gebruikt in de studie van genfunctie, embryo- en ontwikkelingsbiologie en chimere en transgene kippenproductie 9,10,11.
In ovo is intravasculaire injectie in kippenembryo's een gevestigde en veelgebruikte methode 12,13,14. In dit artikel tonen we een uitgebreide beschrijving van dit protocol, inclusief injectiematerialen, plaatsen, dosering en representatieve resultaten.

<table><tbody><tr><td>Fluorescence macro-microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>Narishige</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>12566014</td><td>liposome</td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>pLVX-EGFP lentivirus vector</td><td>Addgene</td><td>128652</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo intravasculaire injectie in kippenembryo's

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

Als een klassiek modelsysteem van embryobiologie is het kippenembryo gebruikt om embryonale ontwikkeling en differentiatie te onderzoeken. Het afleveren van exogene materialen in kippenembryo's heeft een groot voordeel voor het bestuderen van genfunctie, transgene fokkerij en chimaerapreparatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Hier tonen we de methode van in ovo intravasculaire injectie waarbij exogene materialen zoals plasmidevectoren of gemodificeerde primordiale geslachtscellen (PPC's) in vroege ontwikkelingsstadia kunnen worden overgebracht naar donorkippyo's. De resultaten tonen aan dat de intravasculaire injectie via de dorsale aorta en het hoofd het geïnjecteerde materiaal via de bloedsomloop in het hele embryo laat diffunderen. In het gepresenteerde protocol werden de werkzaamheid van exogene plasmide en lentivirale vectorintroductie en de kolonisatie van geïnjecteerde exogene PGB's in de ontvangende gonade bepaald door fluorescentie in de embryo's te observeren. Dit artikel beschrijft gedetailleerde procedures van deze methode, waardoor een uitstekende benadering wordt geboden voor het bestuderen van genfunctie, embryo- en ontwikkelingsbiologie en gonade-chimere kippenproductie. Kortom, dit artikel zal onderzoekers in staat stellen om in ovo intravasculaire injectie van exogene materialen in kippenembryo's met groot succes en reproduceerbaarheid uit te voeren.

We tonen hier de in ovo intravasculaire injectie van kippenembryo's. Een schematisch proces van de intravasculaire injectie is weergegeven in figuur 1; in onze studie gebruikten we verschillende exogene oplossingen om injectie te testen en te verifiëren.
Om de geïnjecteerde materialen beter te visualiseren, werd Trypan Blue (0,4%) als tracer in het embryo geïnjecteerd. De tracer (blauw) werd waargenomen om via de bloedcirculatie naar het hele emb...

Het algemene doel van dit artikel is om te beschrijven hoe te presteren in ovo intracellulaire injectie van exogene materialen in kippenembryo's. Deze aanpak is zeer nuttig om de ontwikkelingsbiologie van kippenembryo's te bestuderen.

In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryo's

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Hallo, ik ben Kai Jin van Yangzhou University. Namens onze onderzoeksgroep ga ik een krachtig hulpmiddel van het kippenembryo presenteren in ontwikkelingsonderzoek. Kippenembryo is een klassiek ontwikkelingsmodel dat is gebruikt om ontwikkeling en differentiatie te onderzoeken, in feite zijn de externe maatregelen van het laboratorium in kippenembryo's een waardevol hulpmiddel voor ontwikkelingsbiologie, zoals gentransfectie, transgene veredeling en het gonadale transmurale preparaat.In ons laboratorium hebben we de mu-type injectiemethoden vastgesteld, maar voor veel onderzoekers is de details van injectie onduidelijk en moeilijk te lijnen. Dus in deze video gaan we de details van vasculaire injectie laten zien tijdens het vroege stadium van de ontwikkeling van kippenembryo's in ovo. Neem gerust contact met ons op als u daarin geïnteresseerd bent.Hier laten we de details van het protocol zien. Verzameling en bereiding van bevruchte eieren. Ten eerste heeft de kip, in tegenstelling tot zoogdieren, miljoenen follikels in een enkele eierstok, maar slechts een paar van deze follikels zijn volwassen genoeg om te ovuleren.Elke follikel bevat één eicel of kiemcel. Zodra de follikel rijpt en zijn dooier loslaat, wordt deze opgenomen in de trechter van de eileider. Terwijl de follikel de halsbuik van de eileider binnendringt, bindt sperma zich aan het ei in het lichaam van de kip en vormt het calcium in het lichaam van de kip een schaal die het bevruchte ei omhult en een zachtschaalei in het lichaam vormt.De calciumschalen worden geleidelijk dikker totdat het ei wordt geproduceerd. Verzamel de bevruchte eicel, academisch embryo-eitjes genoemd en leg ze netjes op een rek in een couveuse bij 37,8 graden Celsius en 60% luchtvochtigheid. De embryo's worden onder geschikte omstandigheden geïncubeerd.Na twee dagen incubaties verschijnen kleine pulserende rode stippen die primordiale harten worden genoemd. Dit proces wordt kersenkloppen genoemd. Na ongeveer 2,5 dag zijn de bloedvaten zichtbaar en hebben zich de hart- en lichaamssegmenten gevormd.Naald- en plasmidepreparaat. We gebruiken glazen haarvaten als naalden. Bereid vóór de injectie glazen haarvaten voor met de buitendiameter van één millimeter en de binnendiameter van 0,6 millimeter.De exogene materialen zijn meestal plasmiden, verpakte lentivirussen en primordiale geslachtscellen, of PPC's. In deze video gebruiken we de trypan blue om het spoor van geïnjecteerde materialen te laten zien. Windowing. Voordat we de embryo's blootstellen, moeten we de embryo's steriliseren om kiembesmetting te voorkomen.Dit wordt gedaan door het oppervlak van de embryo's voorzichtig af te vegen met een 75% alcohol watje op de plaats van de eiopening. Tik na desinfectie voorzichtig met een tang op het stompe uiteinde van de eierschaal en knip voorzichtig een gat van 0,5 centimeter bij 0,5 centimeter op het oppervlak van de eierschaal met de tang om het embryo bloot te leggen. In-ovo intravasculaire injectie.Kijk naar het beeld onder de microscoop, pas de focus van de microscoop aan om eerst het embryo te lokaliseren en vervolgens de bloedvaten van het kippenembryo klaar te maken voor injectie. Richt de naald met de exogene stof op het bloedvat en merk op dat de naald evenwijdig is aan het bloedvat dat wordt geïnjecteerd. Steek de naald voorzichtig in het bloedvat en zet vervolgens de luchtpomp aan.Op dit punt komt de vreemde substantie de slagader binnen en circuleert met het kloppen van het hart terug naar het embryo via de slagader en vervolgens naar de ader. Er zijn twee soorten vasculaire injecties. De ene is een hoofdinjectie waarbij de vreemde stof wordt geïnjecteerd vanuit een ader in het hoofd van het embryo en terugvloeit naar het hart.De andere is een dorsale aorta-injectie waarbij de vreemde stof met het kloppen van het hart naar het embryo circuleert. Met het kloppen van het embryonale hart en de bloedcirculatie kunnen we duidelijk zien dat het vreemde materiaal wordt ontvangen door de haarvaten aan het einde van de slagader, in de ader en vervolgens vanuit de ader terugkeert naar het embryo, wat aangeeft dat het geïnjecteerde vreemde materiaal effectief wordt afgeleverd aan elk deel van het embryo. Verwijder na de injectie het ei uit de stereomicroscoop, knip een drie centimeter lang stuk medische tape met een kleine schaar en bevestig de tape aan de opening.Schraap de tape voorzichtig met de schaar om eventuele luchtbellen eruit te persen en knip vervolgens nog een stuk tape om de opening in een kruis af te sluiten. Na het afsluiten van de opening worden de geïnjecteerde embryo's voorzichtig teruggeplaatst in de couveuse. Hier tonen we de representatieve afbeeldingen van kippenembryo's na injectie.De eerste afbeelding toont het resultaat van lentivirus plasmide-injectie. De groene fluorescentie onder een stereoscopische fluorescentiemicroscoop duidt op de succesvolle expressie van geïnjecteerd plasmide in embryo's. Dit suggereert de haalbaarheid van intravasculaire injectie van plasmiden in kippenembryo's.De tweede afbeelding toont de resultaten van PGC-injectie. De PPC's werden gelabeld met RFP. Op deze foto konden we de geïnjecteerde PPC's zien die hier de rode punten zijn, gelegen in de gonade van de ontvanger.Dit geeft aan dat de donor-PPC's in staat waren om effectief in de gonade van de ontvangers te komen en te koloniseren. Concluderend presenteert dit protocol het proces van in-ovo intravasculaire injectie van exogene materialen, plasmiden of PGB's in kippenembryo's. De hier getoonde methode is gemakkelijk te volgen en te leren en de toepassing op vele gebieden waard.Dit is alles wat ik met jullie wil delen. Ik hoop dat deze aanpak uw werk als een krachtig onderzoeksinstrument bij het instellen van kippenembryo's en de ontwikkelingsbiologie zal vergemakkelijken. Bedankt voor het bekijken van deze video en veel succes met je onderzoek.

in-ovo-intravascular-injection-in-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Kuiken in ovo electroporatie is een techniek die genetische manipulatie van de aviaire embryo mogelijk maakt. Voorkomende toepassingen van deze techniek zijn functionele analyse van genen en vermeende enhancer elementen. Deze video toont neurale buis elektroporatie in HH 10 kippenembryo's. Injectietechniek en de juiste eierbehandeling worden besproken.

In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo&#39;s

In deze paper presenteren we een methode voor het transplanteren van menselijke stamcellen in verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van de kip embryo. Dit zorgt voor...

Xenotransplantatie van menselijke stamcellen in het kippenembryo

Met behulp van fijne punt micropipetten we plasmide DNA injecteren in deelgebieden van de kip somieten of neurale buizen. De concentratie van het plasmide is aangepast aan enkele getransfecteerde cellen te genereren. Vervolgens hebben we laten de cellen zich ontwikkelen tot klonale populaties.

Single Cell Transfectie in kippenembryo&#39;s

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

This video demonstrates the procedure of intravenously injecting cancer cells into the chicken chorioallantoic membrane vasculature to generate a CAM cancer metastasis model. The injected cells eventually form scattered single-cancer cell colonies, allowing for the study of cancer invasion and metastasis.

Intravenous Injection of Cancer Cells into Chicken Chorioallantoic Membrane Vasculature: A Procedure to Establish Chorioallantoic Membrane Cancer Model to Study Cancer Invasion and Metastasis

Ectopische expressie is een techniek om de microRNA's rol in de ontwikkeling van de hersenen toe te lichten. Echter, gericht op specifieke gebieden met behulp van in-ovo elektroporatie is een uitdaging. Hier tonen we een efficiënte manier om selectief electroporate ventrale en dorsale middenhersenen regio.

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan ​​uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

Bij deze methode zijn embryonale cardiale weefsels chirurgisch microdissected, losgekoppeld, fluorescently label en host embryonale weefsels ingeplant. Dit biedt een platform voor het bestuderen van de individu of weefsel niveau developmental organisatie onder ectopische hemodynamische voorwaarden en/of veranderde omgevingen van de paracrine/juxtacrine.

Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Dit protocol beschrijft drie methoden voor het verkrijgen en gebruiken van 5 tot 8 dagen oude kippenembryo's en hun chorioallantoic membrane (CAM) als een in vivo model om contrastverbeterde ultrasone beeldvorming en microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte te bestuderen.

De voorbereiding van Chicken Ex Ovo Embryo's en Chorioallantoic Membrane Vessels als In Vivo Model voor Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging en Microbubble-Gemedieerde Drug Delivery Studies

Kippenembryo's, als klassiek ontwikkelingsmodel, worden in ons lab gebruikt om ontwikkelingscarditoxiciteiten te beoordelen na blootstelling aan verschillende milieuverontreinigingen. Blootstellingsmethoden en vastgestelde morfologische/functionele beoordelingsmethoden worden in dit manuscript beschreven.

Kipembryo gebruiken als een krachtig hulpmiddel bij de beoordeling van ontwikkelingscarditoxiciteiten

Leer de in ovo intravasculaire injectietechniek voor kippenembryo's om exogene materialen zoals plasmiden en PGC's te introduceren. Deze methode ondersteunt onderzoek naar ontwikkelingsbiologie en genetische transfectie.

In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryo's

Meer video's verkennen