Meting van weefsel non-heem ijzergehalte met behulp van een bathofenanthroline-gebaseerde colorimetrische assay

Hier hebben we een protocol gegeven voor het meten van de niet-heemgehaltes in dierlijke weefsels. Met behulp van een eenvoudige gevestigde colorimetrische test die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in de meeste laboratoria. De Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay vereist geen geavanceerde vaardigheden of zeer dure apparatuur en kan worden aangepast aan microplaatformaat voor een hogere monsterdoorvoer en kosteneffectiviteit.

Dit protocol is geschikt voor het detecteren van veranderingen in weefselijzerniveaus in verschillende experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzerefficiëntie. Begin met het snijden van een weefselmonster van 10 tot 100 gram met een scalpelmesje. Weeg het nauwkeurig in een analytische balans over een klein stukje parafilm.

Gebruik een plastic pincet om het stukje weefsel in een 24 well plaat te plaatsen. Laat het 48 uur drogen op een standaard incubator bij 65 graden Celsius. U kunt het waadstukje weefsel met een pincet in een ijzervrije teflonbeker plaatsen en drogen in de magnetronvergistingsoven van het laboratorium.

Plaats elk gedroogd stukje weefsel over een klein stukje paraform in een analytische balans en weeg het nauwkeurig. Breng elk gedroogd stukje weefsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg een deel van het zuurmengsel toe aan de buis en sluit deze.

Bereid een zuur blanco op dezelfde manier, behalve dat het weefsel hier wordt weggelaten. Incubeer de buisjes bij 65 graden celsius gedurende 20 uur om het weefsel te verteren. Gebruik na afkoeling tot kamertemperatuur een micropipet met plastic tips om 500 microliter van het heldere zuurextract over te brengen in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Bereid chromogeenreacties direct voor in de vlakke bodem 96-well, heldere onbehandelde polystyreen microplaten. Geïncubeerde kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Meet de absorptie van monsters in een plaatlezer bij een golflengte van 535 nanometer tegen een gedeïoniseerde waterreferentie.

Bepaling van niet-heemijzer door de cuvette en 96-well microplate gebaseerde colorimetrische assays worden hier getoond. De correlatie tussen op cuvette gebaseerde en op microplaat gebaseerde niet-heemijzerniveaus in 55 weefselmonsters van zes maanden oude mannelijke zwarte, zes muizen, waaronder lever, milt, hart, longen en beenmerg worden hier getoond. De hoge correlatie tussen de twee methodologieën geeft aan dat de op microplaat gebaseerde methode een geldig alternatief is voor de oorspronkelijke op cuvette gebaseerde methode.

Ten slotte werden de niet-heemijzergehalten gekwantificeerd met de op microplaten gebaseerde methode na zure vertering van monster afkomstig van dezelfde weefsels met een mengsel van zoutzuur en trichloorazijnzuur of zoutzuur alleen. De hoge correlatie laat zien dat trichloorazijnzuur kan worden uitgestoten door de zure vertering. De representatieve afbeelding toont de niet-heemijzergehalten in de lever, milt, hart en alvleesklier van mannelijke zwarte zes wilde type muizen en mannelijke hepcidine knock-out muizen op zwarte zes genetische achtergrond gemeten met Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay.

De verstoring van hepcidine leidt tot een hemochromatose zoals ijzerafzetting fenotype met ernstige hepatische, pancreas- en cardiale ijzeraccumulatie en miltijzerdepletie. Hepatische niet-heemijzergehalten in juveniele vrouwelijke Europese zeebaars na experimentele ijzermodulatie worden hier getoond. Het ijzergehalte in de lever nam enorm toe bij met ijzer behandelde dieren.

Terwijl bloedarmoede een milde vermindering van de ijzervoorraden in de lever veroorzaakte. De representatieve afbeeldingen tonen de niet-heemijzergehalten in een maand oude Drosophila gemeten met een bathophenanthroline-gebaseerde colorimetrische test. De resultaten tonen het niet-heemijzergehalte in elke pool van 20 vliegen of het geschatte ijzergehalte van elke vlieg.

Rekening houdend met een gemiddeld gewicht van 0,64 milligram per vlieg. Vergeet tijdens het proberen van deze procedure niet om alle glasslijtage grondig te reinigen en laat de metalen laboratoriummaterialen niet in contact komen met een reagens of oplossing vanwege het risico op besmetting.