Name: Meting van weefsel non-heem ijzergehalte met behulp van een bathofenanthroline-gebaseerde colorimetrische assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Leer een colorimetrische assay met bathofenanthroline om non-heem ijzer in dierlijke weefsels te meten. Deze methode is eenvoudig, kosteneffectief en geschikt voor high-throughput analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door nationale fondsen via FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., in het kader van het project UIDB/04293/2020.

C57BL/6 muizen werden commercieel aangekocht en hepcidine-null (Hamp1−/−) muizen op een C57BL/6 achtergrond8 waren een vriendelijk geschenk van Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankrijk). Dieren werden gehuisvest in de i3S-dierenfaciliteit onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden, in een temperatuur- en lichtgecontroleerde omgeving, met vrije toegang tot standaard knaagdier chow en water. Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax) werd gekocht van een commerciële viskwekerij en gehuisvest in de ICBAS-dierenfaciliteit, in een temperatuur- en lichtgecontroleerde omgeving, en dagelijks ad libitum gevoed met standaard zeebaarsvoer. Alle procedures met gewervelde dieren zijn goedgekeurd door de i3S Animal Ethics Committee en de nationale autoriteit, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informatie over commerciële reagentia, apparatuur en dieren wordt vermeld in de tabel met materialen.
1. Oplossingsvoorbereiding
OPMERKING: Hanteer en bereid alle reagentia en oplossingen voor met ijzervrij glaswerk of plastic wegwerpartikelen. Sta niet toe dat metalen laboratoriummaterialen (bijv. roestvrijstalen spatels) in contact komen met een reagens of oplossing, vanwege het risico op ijzerverontreiniging. Zorg ervoor dat herbruikbaar glaswerk ijzervrij is. Was de materialen gedurende 30-60 minuten met het juiste laboratoriummiddel, spoel met gedeïoniseerd water, week een nacht in een 37% salpeterzuuroplossing verdund 1:3 met gedeïoniseerd water, spoel opnieuw met gedeïoniseerd water en laat drogen.
<ol><li>Zuurmengsel: Voeg 10 g trichloorazijnzuur toe aan 82,2 ml 37% zoutzuur in een glazen fles, los grondig op en stel het uiteindelijke volume in op 100 ml met gedeïoniseerd water. Schud voor gebruik. Als alternatief, gebruik slechts 37% zoutzuur voor weefselvertering. OPMERKING: De oplossing is ten minste 2 maanden stabiel wanneer deze wordt bewaard in donkerbruine glazen reagensflessen. LET OP: Zoutzuur en trichloorazijnzuur zijn corrosief en geconcentreerde vormen geven giftige zure dampen af. Draag te allen tijde beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van zuren. Vermijd het inademen ervan en hanteer altijd zuren onder een zuurkap.</li>
	<li>Verzadigd natriumacetaat: Voeg 228 g watervrij natriumacetaat toe aan 400 ml gedeïoniseerd water in een glazen fles en roer 's nachts bij kamertemperatuur. Laat de oplossing rusten en een dag neerslaan. Als er geen neerslag optreedt, blijf dan kleine hoeveelheden natriumacetaat toevoegen. Bewaar de oplossing in een glazen fles.</li>
	<li>Chromogeenreagens: Voeg voor de bereiding van 1 ml chromogeenreagens 1 mg 4,7-difenyl-1,10-fenanthroline disulfonzuur dinatriumzout toe aan 500 μL gedeïoniseerd water en 10 μL geconcentreerd (100%) thioglycolzuur en los grondig op. Vul het uiteindelijke volume aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water. OPMERKING: Bereid zoveel chromogeenreagens als nodig is. De oplossing is 1 maand stabiel wanneer deze wordt beschermd tegen licht.</li>
	<li>Werkend chromogeenreagens (WCR): Voeg 1 volume van het chromogeenreagens toe aan 5 volumes verzadigd natriumacetaat en 5 volumes gedeïoniseerd water. OPMERKING: Deze oplossing moet vers worden bereid op de dag van gebruik.</li>
	<li>Standaardoplossing voor voorraadijzer: Om een 20 mM stockijzeroplossing te bereiden, plaatst u 111,5 mg carbonylijzerpoeder in een maatkolf van 250 ml met 5.480 μL 37% zoutzuur. Laat een nacht oplossen bij kamertemperatuur (of incubeer in een kokend waterbad). Maak vervolgens de oplossing aan tot een eindvolume van 100 ml met gedeïoniseerd water. OPMERKING: De standaardoplossing kan voor onbepaalde tijd worden bewaard wanneer deze wordt opgeslagen in een goed afgesloten vat.</li>
	<li>Working Iron Standard Solution (WISS): Voeg 13,5 μL 37% zoutzuur toe aan 500 μL gedeïoniseerd water. Voeg 10 μL van de Stock Iron Standard Solution toe en vul het uiteindelijke volume aan tot 1 ml met gedeïoniseerd water (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; gemeten met AAS). OPMERKING: De werkoplossing moet op de dag van gebruik vers worden bereid.</li>
</ol>2. Drogen van monsters
<ol><li>Snijd een weefselmonster van 10-100 mg met een scalpelmesje. Weeg het nauwkeurig in een analytische/precisiebalans over een klein stukje parafilm (Fresh Weight).</li>
	<li>Plaats het stukje weefsel met behulp van een plastic pincet in een 24-wells plaat (ongelidd om waterverdamping mogelijk te maken) en laat het drogen op een standaard incubator bij 65 °C gedurende 48 uur.</li>
	<li>U kunt ook een magnetronvergistingsoven in het laboratorium gebruiken voor het drogen van weefselmonsters. Plaats met een plastic pincet het gewogen stuk tissue in een ijzervrije teflonbeker en droog het in de magnetron. Stel de bedrijfsparameters in volgens de handleiding van het instrument. OPMERKING: Als referentie worden de bedrijfsparameters voor het drogen van levermonsters met behulp van de specifieke digestieoven (zie Tabel met materialen) weergegeven in tabel 1.</li>
	<li>Plaats met behulp van een plastic pincet elk gedroogd stukje weefsel over een klein stukje parafilm in een analytische / precisiebalans en weeg het nauwkeurig (Drooggewicht).</li>
</ol>3. Monster zure spijsvertering
<ol><li>Breng met behulp van een plastic pincet elk gedroogd stuk weefsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 1 ml van het zuurmengsel toe en sluit de microcentrifugebuis. Bereid een zuur blanco op dezelfde manier, behalve dat het weefsel wordt weggelaten. LET OP: Het zuurmengsel is corrosief en geeft giftige dampen af. Draag beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van het zuurmengsel. Vermijd het inademen en behandel het altijd onder een zuurkast.</li>
	<li>Verteer de weefsels door de microcentrifugebuizen gedurende 20 uur in een incubator bij 65 °C te incuberen.</li>
	<li>Breng na afkoeling tot kamertemperatuur 500 μL van het heldere (gele) zuurextract (supernatant) over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een micropipette met plastic uiteinden. Als het niet mogelijk is om een duidelijk supernatant te verkrijgen, voer dan een korte centrifugatiespin uit. LET OP: Het bovennatuurlijk is zeer zuur. Draag beschermende kleding, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische spatbril bij het hanteren van de supernatanten. Hanteer ze altijd onder een zuurkast. OPMERKING: Op dit punt kunnen de zure extracten onmiddellijk worden gebruikt voor de colorimetrische test of worden ingevroren bij -20 °C voor later gebruik. Ontdooi bevroren monsters volledig tot kamertemperatuur en vortex ze voor gebruik.</li>
</ol>4. Kleurontwikkeling
<ol><li>Bereid chromogeenreacties zoals aangegeven in tabel 2 in microcentrifugebuizen van 1,5 ml of, voor een hogere doorvoer, rechtstreeks in de vlakke bodem, heldere, onbehandelde polystyreenmicroplaten met 96 putten. Bereid alle reacties (zuur blanco, standaard en monster) ten minste in tweevoud voor.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min.</li>
</ol>5. Absorptiemeting
<ol><li>Meet de absorptie van monsters in een spectrofotometer of plaatlezer bij een golflengte van 535 nm tegen een gedeïoniseerde waterreferentie. Platen kunnen ongelidd of afgedekt worden gelezen. Verwijder in de dekselbehuizing eventuele condensatie die ontstaat als gevolg van het vrijkomen van zure dampen uit het deksel vlak voor de meting om mogelijke interferentie met de absorptiemeting te voorkomen. OPMERKING: De optische absorptie van de zuur blanco afgelezen tegen gedeïoniseerd water (referentie) moet minder dan 0,015 zijn; de optische absorptie van de standaard en de monsters moet tussen 0,100 en 1,000 liggen. Voor monsters met een zeer hoog of zeer laag ijzergehalte moeten de volumes zuurextract (supernatant) en diH2O mogelijk worden aangepast (tabel 2): als de absorptie groter is dan 1,0, gebruik dan een kleiner monstervolume (supernatant); wanneer de absorptie lager is dan 0,1, gebruik dan een hoger volume van het supernatant. Het monstervolume (Vsmp) wordt in aanmerking genomen bij de berekening van het weefselijzergehalte van elk monster (zie stap 6).</li>
</ol>6. Berekening van het weefselijzergehalte
<ol><li>Bereken het ijzergehalte van niet-heemweefsel met de volgende vergelijking: Weefselijzer (μg/g droog weefsel) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63469/63469eq01v2.jpg"> AT = absorptie van het testmonster AB = absorptie van zuur blank AS = absorptie van standaard Fes = ijzerconcentratie van WISS (μg Fe/ml) W = gewicht van de droge stof (g) Vsmp = monstervolume (variabel volume supernatant in tabel 2 omgerekend naar ml) Vf = eindvolume van het zuurmengsel na incubatie gedurende de nacht bij 65 °C (overeenkomend met het zuurvolume plus het volume droge stof in ml; als de monstergewichten niet significant verschillen, ga dan uit van een constant volume ≈ 1 ml) Vstd = ijzerstandaardvolume (volume WISS in tabel 2 omgerekend naar ml) Vrv = eindreactievolume (totaal volume in tabel 2 omgerekend naar ml)</li>
</ol>

<ol><li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+carpet+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li>
<li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+and+anemia%3A+A+tight+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).</li>
<li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anemia+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li>
<li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+homeostasis%3A+Lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).</li>
<li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li>
<li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorrence%2C+JD+%22Methods+in+Haematology%22">Methods in Haematology</a>. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).</li>
<li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li>
<li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li>
<li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297(2010).</li>
<li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li>
<li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li>
<li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels wordt verstrekt, met behulp van een aanpassing van de op bathofenanthroline gebaseerde colorimetrische test die oorspronkelijk werd beschreven door Torrance en Bothwell5,6. De kritische stappen van de methode zijn het drogen van weefselmonsters; eiwitdenaturatie en afgifte van anorganisch ijzer door zure hydrolyse; reductie van ijzer (Fe3 +) tot de ijzertoestand (Fe2 +...

IJzer is een essentiële micronutriënt, die nodig is voor de functie van eiwitten die betrokken zijn bij cruciale biologische processen zoals zuurstoftransport, energieproductie of DNA-synthese. Belangrijk is dat zowel ijzeroverschot als ijzertekort zeer schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid en dat weefselijzerniveaus nauwkeurig worden gereguleerd. Abnormale ijzerabsorptie via de voeding, ijzertekort, herhaalde bloedtransfusies en chronische ontsteking zijn veel voorkomende oorzaken van ijzergerelateerde aandoeningen die miljarden mensen wereldwijd treffen1,2,3.
Experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -tekort zijn instrumenteel geweest om onze kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase4 te bevorderen. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang die de afgelopen twee decennia is geboekt, blijven veel belangrijke aspecten ongrijpbaar. In de komende jaren zal de nauwkeurige meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels een cruciale stap blijven om het onderzoek op het gebied van ijzerbiologie te bevorderen.
De meeste laboratoria kwantificeren weefselijzer met atomaire absorptiespectroscopie (AAS), inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS), of een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantrontrolinereagens. Dit laatste is gebaseerd op de oorspronkelijke methode beschreven door Torrance en Bothwell meer dan 50 jaar geleden5,6. Hoewel vervolgens een variant van deze methode werd ontwikkeld met ferrozine als alternatief voor bathofenanthroline7, blijft dit laatste het meest geciteerde chromogene reagens in de literatuur.
De gekozen methode is vaak afhankelijk van de beschikbare expertise en infrastructuur. Hoewel AAS en ICP-MS gevoeliger zijn, blijft de colorimetrische test veel gebruikt omdat het de volgende belangrijke voordelen biedt: i) het sluit de bijdrage uit van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen; ii) het vereist geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur; en iii) de oorspronkelijke test op basis van cuvette kan worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. De colorimetrische benadering die in dit werk wordt gepresenteerd, wordt routinematig gebruikt om veranderingen in weefsel niet-heemijzerniveaus te kwantificeren in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort, van knaagdieren tot vissen en fruitvlieg. Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde, colorimetrische test die de meeste laboratoria gemakkelijk te implementeren zouden moeten vinden.

<table><tbody><tr><td>96 well UV transparante plaat</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>Kern</td><td>ABJ 220-4M</td><td></td></tr><tr><td>Watervrij natriumacetaat</td><td>Merck</td><td>106268</td><td></td></tr><tr><td>Bathophenantroline sulfonaat (4,7-Difenyl-1,10-fenantroline disulfonzuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1375</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen (Mus musculus)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl ijzerpoeder, &ge;99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp cuvettes in polymethylmethacrylaat (PMMA)</td><td>VWR</td><td>634-0678P</td><td></td></tr><tr><td>Dubbel gedestilleerd, steriel water</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie microplaat lezer</td><td>BioTek Instruments</td><td>FLx800</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Microgolfspijsverteringsoven en witte teflonbekers</td><td>CEM</td><td>MDS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Salpeterzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>15687290</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>ED115</td><td></td></tr><tr><td>Knaagdierenvoer</td><td>Harlan Laboratories</td><td>2014S</td><td>Teklad Global 14% Eiwit Knaagdier Onderhoudsvoer bevattende 175 mg/kg ijzer</td></tr><tr><td>Zeebaars (Dicentrarchus labrax)</td><td>Sonrionansa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeebaarsvoer</td><td>Skretting</td><td>L-2 Alterna 1P</td><td></td></tr><tr><td>Enkelstraals UV-Vis spectrofotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV mini 1240</td><td></td></tr><tr><td>Thioglycolzuur</td><td>Merck</td><td>100700</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur</td><td>Merck</td><td>100807</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van weefsel non-heem ijzergehalte met behulp van een bathofenanthroline-gebaseerde colorimetrische assay

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

IJzer is een essentiële micronutriënt. Zowel ijzerstapeling als tekort zijn zeer schadelijk voor de mens en het weefselijzergehalte wordt fijn gereguleerd. Het gebruik van experimentele diermodellen van ijzerstapeling of -deficiëntie is van groot belang geweest voor het bevorderen van de kennis van de mechanismen die betrokken zijn bij de systemische en cellulaire regulatie van ijzerhomeostase. De meting van het totale ijzergehalte in dierlijke weefsels wordt gewoonlijk uitgevoerd met atomaire absorptiespectroscopie of met een colorimetrische test op basis van de reactie van niet-heemijzer met een bathofenantronlinereagens. Al vele jaren wordt de colorimetrische test gebruikt voor het meten van het niet-heemijzergehalte in een breed scala aan dierlijke weefsels. In tegenstelling tot atomaire absorptiespectroscopie, sluit het de bijdrage van heemijzer afgeleid van hemoglobine in rode bloedcellen uit. Bovendien vereist het geen geavanceerde analytische vaardigheden of zeer dure apparatuur en kan het dus gemakkelijk in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd. Ten slotte kan de colorimetrische test op cuvette-basis zijn of worden aangepast aan een microplaatformaat, waardoor een hogere monsterdoorvoer mogelijk is. Het huidige werk biedt een goed ingeburgerd protocol dat geschikt is voor de detectie van veranderingen in weefselijzerniveaus in een verscheidenheid aan experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzertekort.

Cuvette versus 96-well microplate vergelijking De meting van weefsel niet-heemijzer door reactie met een bathofenantronline-reagens dat oorspronkelijk door Torrance en Bothwell is beschreven5,6 is gebaseerd op het gebruik van een spectrofotometer voor absorptiemeting. Daarom zijn de volumes die worden gebruikt in de chromogeenreactie compatibel met de grootte van een gewone spectrofotometer cuvette. Het huidige werk beschrijft een methodeaanpa...

Hier wordt een protocol voor het meten van het niet-heemijzergehalte in dierlijke weefsels verstrekt, met behulp van een eenvoudige, gevestigde colorimetrische test die gemakkelijk in de meeste laboratoria kan worden geïmplementeerd.

Meting van weefsel non-heem ijzergehalte met behulp van een bathofenanthroline-gebaseerde colorimetrische assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Hier hebben we een protocol gegeven voor het meten van de niet-heemgehaltes in dierlijke weefsels. Met behulp van een eenvoudige gevestigde colorimetrische test die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in de meeste laboratoria. De Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay vereist geen geavanceerde vaardigheden of zeer dure apparatuur en kan worden aangepast aan microplaatformaat voor een hogere monsterdoorvoer en kosteneffectiviteit.Dit protocol is geschikt voor het detecteren van veranderingen in weefselijzerniveaus in verschillende experimentele diermodellen van ijzerstapeling of ijzerefficiëntie. Begin met het snijden van een weefselmonster van 10 tot 100 gram met een scalpelmesje. Weeg het nauwkeurig in een analytische balans over een klein stukje parafilm.Gebruik een plastic pincet om het stukje weefsel in een 24 well plaat te plaatsen. Laat het 48 uur drogen op een standaard incubator bij 65 graden Celsius. U kunt het waadstukje weefsel met een pincet in een ijzervrije teflonbeker plaatsen en drogen in de magnetronvergistingsoven van het laboratorium.Plaats elk gedroogd stukje weefsel over een klein stukje paraform in een analytische balans en weeg het nauwkeurig. Breng elk gedroogd stukje weefsel over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg een deel van het zuurmengsel toe aan de buis en sluit deze.Bereid een zuur blanco op dezelfde manier, behalve dat het weefsel hier wordt weggelaten. Incubeer de buisjes bij 65 graden celsius gedurende 20 uur om het weefsel te verteren. Gebruik na afkoeling tot kamertemperatuur een micropipet met plastic tips om 500 microliter van het heldere zuurextract over te brengen in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Bereid chromogeenreacties direct voor in de vlakke bodem 96-well, heldere onbehandelde polystyreen microplaten. Geïncubeerde kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Meet de absorptie van monsters in een plaatlezer bij een golflengte van 535 nanometer tegen een gedeïoniseerde waterreferentie.Bepaling van niet-heemijzer door de cuvette en 96-well microplate gebaseerde colorimetrische assays worden hier getoond. De correlatie tussen op cuvette gebaseerde en op microplaat gebaseerde niet-heemijzerniveaus in 55 weefselmonsters van zes maanden oude mannelijke zwarte, zes muizen, waaronder lever, milt, hart, longen en beenmerg worden hier getoond. De hoge correlatie tussen de twee methodologieën geeft aan dat de op microplaat gebaseerde methode een geldig alternatief is voor de oorspronkelijke op cuvette gebaseerde methode.Ten slotte werden de niet-heemijzergehalten gekwantificeerd met de op microplaten gebaseerde methode na zure vertering van monster afkomstig van dezelfde weefsels met een mengsel van zoutzuur en trichloorazijnzuur of zoutzuur alleen. De hoge correlatie laat zien dat trichloorazijnzuur kan worden uitgestoten door de zure vertering. De representatieve afbeelding toont de niet-heemijzergehalten in de lever, milt, hart en alvleesklier van mannelijke zwarte zes wilde type muizen en mannelijke hepcidine knock-out muizen op zwarte zes genetische achtergrond gemeten met Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay.De verstoring van hepcidine leidt tot een hemochromatose zoals ijzerafzetting fenotype met ernstige hepatische, pancreas- en cardiale ijzeraccumulatie en miltijzerdepletie. Hepatische niet-heemijzergehalten in juveniele vrouwelijke Europese zeebaars na experimentele ijzermodulatie worden hier getoond. Het ijzergehalte in de lever nam enorm toe bij met ijzer behandelde dieren.Terwijl bloedarmoede een milde vermindering van de ijzervoorraden in de lever veroorzaakte. De representatieve afbeeldingen tonen de niet-heemijzergehalten in een maand oude Drosophila gemeten met een bathophenanthroline-gebaseerde colorimetrische test. De resultaten tonen het niet-heemijzergehalte in elke pool van 20 vliegen of het geschatte ijzergehalte van elke vlieg.Rekening houdend met een gemiddeld gewicht van 0,64 milligram per vlieg. Vergeet tijdens het proberen van deze procedure niet om alle glasslijtage grondig te reinigen en laat de metalen laboratoriummaterialen niet in contact komen met een reagens of oplossing vanwege het risico op besmetting.

measurement-tissue-non-heme-iron-content-using-bathophenanthroline

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In this video, we describe a colorimetric-based method to determine non-heme iron content in mouse liver tissue. Bathophenanthroline sulfonate is used as the chromogenic substrate in the presence of a reducing agent, which converts ferric iron to chelatable ferrous iron.

Bathophenanthroline Sulfonate-Based Colorimetric Assay: A Simple and Rapid Method for Quantitation of Non-Heme Iron in Mouse Liver Tissue

This video demonstrates an in vitro technique to assess iron bioavailability in complex food sources. The technique combines the simulation of human digestion along with iron uptake by differentiated Caco-2 cells. Intracellular ferritin formation acts as a marker for cellular iron uptake.

Caco-2 Cell Bioassay: An In Vitro Method for Measuring Iron Bioavailability in Complex Food Sources

Veranderde niveaus van intracellulair heem worden geassocieerd met veelvoorkomende ziekten zoals kanker. Daarom is er behoefte aan het meten van de niveaus van heembiosynthese in verschillende cellen. Het doel van dit protocol is om een snelle en gevoelige methode te bieden om de niveaus van heemsynthese in verschillende cellen te meten en te vergelijken.

Meting van Heme Synthesis Levels in zoogdiercellen

Wij presenteren een eenvoudige en betrouwbare protocol voor het meten van ijzergehalte in plantaardige weefsels met behulp van de colorimetrische Pruisisch blauw-methode.

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

We presenteren een assay voor eenvoudige kwantificering van metalen geïntroduceerd voor monsters bereid met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie. De methode maakt gebruik van hydroxynaphthol blauw als de colorimetrische metalen indicator en een UV-VIS-spectrofotometer als de detector.

Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Deze ijzerrorox speciatie methode is gebaseerd op capillaire elektroforese-inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie met monster stapelen in combinatie met korte analyse in een run. De methode analyseert en biedt snel lage limieten van kwantificering voor ijzerredoxsoorten in een breed scala van weefsels en biofluïde monsters.

Opstelling van capillaire elektroforese-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (CE-ICP-MS) voor kwantificering van ijzerrederoxsoorten (Fe(II), Fe(III))

Dit artikel laat zien hoe transferrinegebonden niet-radioactief isotopisch ijzer kan worden bereid en toegediend voor studies van ijzertransport tijdens de zwangerschap van muizen. De benadering voor het kwantificeren van isotopisch ijzer in foetoplacentale compartimenten wordt ook beschreven.

Kwantificeren van ijzertransport over de placenta van de muis in vivo met behulp van niet-radioactieve ijzerisotopen

De Caco-2 cel bioassay voor ijzer (Fe) biologische beschikbaarheid vertegenwoordigt een kosteneffectieve en veelzijdige aanpak om fe biologische beschikbaarheid te beoordelen van voedingsmiddelen, voedingsproducten, supplementen, maaltijden en zelfs dieetregimes. Grondig gevalideerd voor menselijke studies, vertegenwoordigt het de state-of-the-art voor studies van fe biologische beschikbaarheid.

De Caco-2 Cell Bioassay voor het meten van de biologische beschikbaarheid van ijzer in levensmiddelen

We beschrijven een fluorescerende test die snel en goedkoop het vermogen van nieuwe verbindingen om ijzer te cheleren kan bevestigen. De test meet het vermogen van verbindingen om de ijzerbindende activiteit van de zwakke ijzerchelaaterende fluorescerende sonde Calceïne te overtreffen, wat resulteert in een kwantificeerbare toename van de fluorescentie wanneer chelatie optreedt.

Kwantificeerbare en goedkope celvrije fluorescerende methode om het vermogen van nieuwe verbindingen om ijzer te chelaten bevestigen 

Dit protocol presenteert methoden voor het beoordelen van de verdeling en hoeveelheid ijzerafzetting in weefsels, met name de hersenen. Het protocol beschrijft de procedures voor monstervoorbereiding, Perls/DAB-kleuring, beeldopname en gegevensanalyse.

Beoordeling van ijzerafzetting in de hersenen van 5xFAD-muizen door Perls'/DAB-kleuring

In dit werk is het protocol besproken voor het ontwerpen en ontwikkelen van een E-Eye-Enable POCT-apparaat om Fe, Cr, As en F te detecteren in milieumonsters, biologische monsters en voedsel en dranken. Er zijn bijna 2000 monsters getest en de resultaten komen overeen met de gouden standaardtechniek.

TD-DFT Geleide geavanceerde E-Eye Sensing-techniek voor kwantificering ter plaatse van Fe, Cr, F en As in de milieu-, biologische en voedselmonsters

Leer een colorimetrische assay met bathofenanthroline om non-heem ijzer in dierlijke weefsels te meten. Deze methode is eenvoudig, kosteneffectief en geschikt voor high-throughput analyse.

Meting van weefsel non-heem ijzergehalte met behulp van een bathofenanthroline-gebaseerde colorimetrische assay

Meer video's verkennen