Name: Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Leer natuurlijke transformatie en motiliteitsanalyse van de filamenteuze cyanobacterie Phormidium lacuna. Deze methode opent nieuwe mogelijkheden voor genetisch onderzoek binnen de orde Oscillatoriales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door het Karlsruher Institute of Technology.

<ol><li>Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+and+cyanobacteria+as+enzyme+biofactories%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research-Biomass+Biofuels+and+Bioproducts%22%5BJournal%5D)">Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories.</a> Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).</li>
<li>Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+New+Genetic+Toolkits+and+Their+Role+for+Ethanol+Production+in+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Energies%22%5BJournal%5D)">Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria.</a> Energies. 12 (18), 3515(2019).</li>
<li>Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+approaches+to+deciphering+natural+transformation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1259(2019).</li>
<li>Tandeau de Marsac, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+molecular+cloning+in+cyanobacteria%3A+cloning+of+an+Anacystis+nidulans+met+gene+using+a+Tn901-induced+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant.</a> Gene. 20 (1), 111-119 (1982).</li>
<li>Porter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation in cyanobacteria.</a> Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).</li>
<li>Joset, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+Synechocystis+PCC+6714+and+6803%3A+preparation+of+chromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA.</a> Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).</li>
<li>Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+Synechococcus+sp+strains+PCC-7942+and+PCC-6301+by+interspecies+conjugation+and+chromosomal+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination.</a> Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).</li>
<li>Matsunaga, T., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+marine+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in marine cyanobacteria.</a> Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).</li>
<li>Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+inactivation+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002+and+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobium+tepidum+using+in+vitro-made+DNA+constructs+and+natural+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation.</a> Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).</li>
<li>Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+transformation+of+the+thermophilic+cyanobacterium%2C+Thermosynechococcus+elongatus+BP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.</a> Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).</li>
<li>Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVioque%2C+A+%22Transgenic+Microalgae+as+Green+Cell%22">Transgenic Microalgae as Green Cell</a>. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> Plos One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+as+a+tool+to+transfer+the+plasmid+pRL489+in+Oscillatoria+MKU+277%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277.</a> Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).</li>
<li>El Semary, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+electroporation-induced+transformation+in+Microcystis+aeruginosa+PCC7806%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologie+Agronomie+Societe+et+Environnement%22%5BJournal%5D)">Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806.</a> Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).</li>
<li>Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+the+filamentous+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> PLoS One. 15 (6), 0234440(2020).</li>
<li>Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+gene-transfer+in+marine+cyanobacteria+-+Synechococcus+Sp%2C+Synechocystis+Sp+and+Pseudanabaena+Sp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).</li>
<li>Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+and+conjugal+transfer+of+foreign+gGenes+into+the+filamentous+multicellular+cyanobacteria+%28Subsection+V%29+Fischerella+and+Chlorogloeopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis.</a> Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).</li>
<li>Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protectant+medium+preserving+bacterial+viability+after+freeze+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying.</a> Microbiological Research. 236, 126454(2020).</li>
<li>Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+2+regulates+the+expression+of+motility-related+genes+through+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).</li>
<li>Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyanobacterial+phytochrome+Cph2+inhibits+phototaxis+towards+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light.</a> Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).</li>
<li>Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+type+IV+pilus-dependent+motility+by+chemosensor-like+elements+in+Synechocystis+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).</li>
<li>Guillard, R. R., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial seawater.</a> Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual.+3rd+edition%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTAB+DNA+extraction+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">CTAB DNA extraction buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).</li>
<li>Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+genomic+DNA+extraction+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria.</a> World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).</li>
<li>French, C. S., Milner, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disintegration+of+bacteria+and+small+particles+by+high-pressure+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion.</a> Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%2C+a+laboratory+manual.+2nd+ed%22">Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Lamparter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+type+IV+pili+and+phytochrome+in+gliding+motility%2C+lateral+motility+and+phototaxis+of+the+cyanobacterium+Phormidium+lacuna%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Nies, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li>
<li>Kachel, B., Mack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Synechococcus+sp.+strain+PCC+7002+for+the+photoautotrophic+production+of+light-sensitive+riboflavin+%28vitamin+B2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2).</a> Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).</li>
<li>Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalogue+of+algal+and+cyanobacterial+strains+of+culture+collection+of+autotrophic+organisms+at+Trebon%5BTitle%5D)+AND+%22Algological+Studies%22%5BJournal%5D)">Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon.</a> Algological Studies. 63, 59-112 (1992).</li>
<li>Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+cyanobacterial+mutants+lacking+the+manganese-stabilizing+polypeptide+of+photosystem-ii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).</li>
<li>Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+cultural+properties+and+characterization+of+the+pigment+in+Nostoc+sp%2C+a+cyanobacterium+unusually+rich+in+c-phycoerythrin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin.</a> Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).</li>
<li>Schlosser, U. G., Friedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additions+to+the+culture+collection+of+algae+at+Gottingen+since+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia%22%5BJournal%5D)">Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997.</a> Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).</li>
<li>Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intensity+and+quality+of+light+on+phycocyanin+production+by+a+marine+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+042902%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).</li>
<li>Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kanamycin+resistance+as+a+selectable+marker+for+plastid+transformation+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%3A+MGG%22%5BJournal%5D)">Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco.</a> Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).</li>
<li>Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+expression+of+the+chimeric+chalcone+synthase-NptII+gene+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells.</a> EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).</li>
<li>Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+fluorescence+dynamics+of+single+molecules+of+a+green+fluorescent+protein%3A+One-+versus+two-photon+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation.</a> Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).</li>
<li>Taton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+and+darkness+control+natural+competence+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria.</a> Nature Communications. 11 (1), 1688(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Hoewel veel soorten cyanobacteriën beschikbaar zijn uit kweekcollecties 32,33,34,35,36, is er nog steeds vraag naar nieuwe cyanobacteriën uit het wild omdat deze soorten zijn aangepast aan specifieke eigenschappen. P. lacune werd verzameld uit rotsspoelen en is aangepast aan variaties van zoutconcentraties en temperatuur30. Sta...

Cyanobacteriën zijn prokaryote organismen die fotosynthese gebruiken als energiebron 1,2. Het onderzoek richt zich steeds meer op cyanobacteriële soorten. Verschillende cyanobacteriën kunnen worden getransformeerd met DNA3. Genen kunnen bij deze soorten worden uitgeschakeld of overexpressie krijgen. De transformatie is echter beperkt tot enkele soorten 4,5,6,7,8,9,10,11, en het kan moeilijk zijn om transformatie vast te stellen in stammen uit kweekcollecties of het wild 8. Stammen van de filamenteuze soort Phormidium lacuna (figuur 1) werden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen, waarin omgevingsomstandigheden, zoals zoutconcentraties of temperatuur, in de loop van de tijd fluctueren. Deze filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden gebruikt als modelorganismen voor de orde Oscillatoriales12 waartoe ze behoren.
Tijdens proeven met genoverdracht door elektroporatie13,14 werd ontdekt dat P. lacune kan worden getransformeerd door natuurlijke transformatie15. In dit proces wordt DNA op natuurlijke wijze opgenomen door sommige cellen. In vergelijking met andere transformatiemethoden 16,17 heeft natuurlijke transformatie het voordeel dat er geen extra hulpmiddelen nodig zijn die de procedure kunnen bemoeilijken. Elektroporatie vereist bijvoorbeeld de juiste cuvetten, intacte draden en selectie van de juiste spanning. P. lacune is momenteel het enige Oscillatoriales-lid dat vatbaar is voor natuurlijke transformatie. Omdat het oorspronkelijke protocol is gebaseerd op elektroporatieprotocollen, bevatte het nog steeds verschillende wasstappen die mogelijk onnodig zijn. Verschillende benaderingen werden getest om het protocol te vereenvoudigen, wat leidde tot het hier gepresenteerde transformatieprotocol.
De genoomsequentie is essentieel voor verdere moleculaire studies op basis van gen knock-out of overexpressie. Hoewel genoomsequenties binnen korte tijd kunnen worden verkregen met sequencingmachines van de volgende generatie, kan de extractie van DNA moeilijk zijn en afhankelijk van de soort. Bij P. lacune werden verschillende protocollen getest. Vervolgens werd een op gemodificeerde cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) gebaseerde methode vastgesteld, wat resulteerde in een aanvaardbare zuiverheid van DNA en DNA-opbrengsten van elke zuiveringscyclus voor voortgezet werk in het laboratorium. Het genoom van vijf stammen zou met dit protocol gesequenced kunnen worden. De volgende logische transformatiestap was het vaststellen van eiwitexpressie in P. lacune.
De sfGFP die in dit protocol als markereiwit wordt gebruikt, kan met elke fluorescentiemicroscoop worden gedetecteerd. Alle promotors die werden getest, konden worden gebruikt voor P. lacuna sfGFP-expressie. Het toenemende aantal stammen dat voortkomt uit transformatie heeft geleid tot de behoefte aan een methode voor het opslaan van de culturen. Dergelijke methoden zijn vastgesteld voor Escherichia coli en vele andere bacteriën18. In standaardprotocollen worden glycerolculturen bereid, overgebracht in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C. Deze methode vereist slechts een paar stappen en is zeer betrouwbaar voor die soorten waarvoor het is vastgesteld. Het standaardprotocol was niet haalbaar voor P. lacune omdat levende cellen niet in alle gevallen konden worden teruggevonden. Toen glycerol echter na het ontdooien werd verwijderd, overleefden cellen van alle onderzoeken. Eenvoudige methoden worden gepresenteerd voor de analyse van de beweeglijkheid van P. lacune, die kan worden gecombineerd met knock-out mutagenese om type IV pili of de rol van fotoreceptoren te onderzoeken. Deze testen verschillen van die van eencellige cyanobacteriën 19,20,21 en kunnen ook nuttig zijn voor andere Oscillatoria.

```html
<table><tbody><tr><td>Autoclave 3870 ELV</td><td>Tuttnauer</td><td>3870 ELV</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>OttoNorwald</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 Freshwater Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>BG-11 medium</td><td>Merck</td><td>73816-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Merck</td><td>10043-35-3</td><td>H3BO3</td></tr><tr><td>Calciumchloridedihydraat</td><td>Carl Roth</td><td>10035-04-8</td><td>CaCl2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Cell culture flasks Cellstar met filterschroefdop, steriel, 250 mL</td><td>Greiner</td><td>658190</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flasks Cellstar met filterschroefdop, steriel, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>601975</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge LYNX 4000</td><td>Thermo Scientific</td><td>75006580</td><td>en rotor</td></tr><tr><td>Centrifuge microstar 17</td><td>VWR International</td><td>N/A</td><td>voor maximaal 13.000 rpm</td></tr><tr><td>Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>57-09-0</td><td>C19H42BrN</td></tr><tr><td>Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1</td><td>PanReac AppliChem</td><td> A1935</td><td></td></tr><tr><td>Kobalt(II)chloride hexahydraat</td><td>Merck</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Koper(II)sulfaat pentahydraat</td><td>Merck</td><td>7758-99-8</td><td>&nbsp;CuSO4 &middot; 5 H2O</td></tr><tr><td>D(+)-Biotine</td><td>Carl Roth</td><td>58-85-5</td><td>&nbsp;C10H16N2O3S</td></tr><tr><td>DNA ladder 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N3231</td><td></td></tr><tr><td>Elektrische pipetteringshulp middel accujet-pro S</td><td>Brand GmbH</td><td>26360</td><td>voor pipettering 1-25 mL</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>C2H6O</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur disodiumzout dihydraat</td><td>Carl Roth</td><td>6381-92-6</td><td>EDTA-Na2 &middot; 2 H2O</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop ApoTome</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>French Pressure Cell Press</td><td>American Instrument Company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gel documentatie systeem Saffe Image</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelektroforese systeem Mupid-One/-exu</td><td>ADVANCED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaswerk, verschillend</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>56-81-5</td><td>C3H8O3</td></tr><tr><td>IJzer(III)chloride hexahydraat</td><td>Merck</td><td>10025-77-1</td><td>&nbsp;FeCl3 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinesulfaat</td><td>Carl Roth</td><td>25389-94-0</td><td>C18H36N4O11 &middot; H2SO4</td></tr><tr><td>Lauroylsarcosina, natriumzout (Sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>137-16-6</td><td>C15H28NO3 &middot; Na</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Carl Roth</td><td>X964.4</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbron, fluorescentiebuis L18W/954 daglicht</td><td>OSRAM</td><td></td><td>cultuur van cyanobacteriën</td></tr><tr><td>Lichtbron, LED paneel XL 6500K 140 W</td><td>Bloom Star</td><td>N/A</td><td>cultuur van cyanobacteriën, tot 1.000 &micro;mol m-2 s-1</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Carl Roth</td><td>7791-18-6</td><td>MgCl2 &middot; 6 H2O</td></tr><tr><td>Mangaan(II)chloride tetrahydraat</td><td>Serva</td><td>13446-34-9</td><td>MnCl2 &middot; 4 H2O</td></tr><tr><td>Microscoop DM750</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi prep plasmide extractie kit NucleoBond Xtra Midi kit</td><td>Macherey-NAGEL GmbH &amp; Co. KG</td><td>REF740410.50</td><td></td></tr><tr><td>Minicomputer Raspberry Pi 4 +</td><td>Conrad Electronics</td><td>2138863-YD</td><td>voor time-lapse opname</td></tr><tr><td>Oculair camera EC3</td><td>Leica</td><td></td><td>voor continue opname tot 30 s</td></tr><tr><td>Oculair camera MikrOkular Full HD</td><td>Bresser</td><td></td><td>voor time-lapse opnames, gekoppeld aan Raspberry Pi minicomputer</td></tr><tr><td>Petrischalen polystyrol, 100 mm x 20 mm</td><td>Merck</td><td>P5606-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen polystyrol, 60 mm x 15 mm</td><td>Merck</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Fotometer Nanodrop ND-1000</td><td>Peqlab Biotechnologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotometer Uvikon XS</td><td>Goebel Instrumentelle Analytik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 100-1.000 &micro;L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman 10-100 &micro;L</td><td>Gilson</td><td>SKU: FA10004M</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof pipetten 10 mL, sterieel</td><td>Greiner</td><td>607107</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof buis, sterieel, 15 mL</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof buis, sterieel, 50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumbromide</td><td>

natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium phormidium

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteriën zijn de focus van fundamenteel onderzoek en biotechnologische projecten waarin zonne-energie wordt gebruikt voor de productie van biomassa. Phormidium lacuna is een nieuw geïsoleerde filamenteuze cyanobacterie. Dit artikel beschrijft hoe nieuwe filamenteuze cyanobacteriën kunnen worden geïsoleerd uit mariene rotsspoelen. Het beschrijft ook hoe DNA kan worden geëxtraheerd uit filamenten en hoe de genomen kunnen worden gesequenced. Hoewel transformatie is vastgesteld voor veel eencellige soorten, wordt het minder vaak gemeld voor filamenteuze cyanobacteriën. Een vereenvoudigde methode voor de natuurlijke transformatie van P. lacune wordt hier beschreven. P. lacuna is het enige lid van de orde Oscillatoriales waarvoor natuurlijke transformatie is vastgesteld. Dit artikel laat ook zien hoe natuurlijke transformatie wordt gebruikt om superfolder groen fluorescerend eiwit (sfGFP) tot expressie te brengen. Een endogene cpcB-promotor induceerde ongeveer 5 keer sterkere expressie dan cpc560, A2813 of psbA2-promotors van Synechocystis sp. PCC6803. Verder werd een methode voor de cryopreservatie van P. lacuna en Synechocystis sp.CPP 6803 vastgesteld en worden methoden beschreven voor het beoordelen van de beweeglijkheid in een vloeibaar medium en op agar- en plastic oppervlakken.

Volgens de bovengenoemde methoden werden 5 verschillende stammen van P. lacune geïsoleerd uit rotsspoelen en gesequenced (figuur 1 en tabel 1). Alle culturen waren steriel na ~1 jaar subculturering behalve P. lacuna HE10JO. Deze stam is nog steeds besmet met Marivirga atlantica, een mariene bacterie. Tijdens daaropvolgende Helgoland-excursies werden andere filamenteuze cyanobacteriën geïsoleerd uit rotspoelen, die verschillen van P. lacune...

Phormidium lacuna is een filamenteuze cyanobacterie die werd geïsoleerd uit mariene rotspoelen. Dit artikel beschrijft de isolatie van filamenten uit natuurlijke bronnen, DNA-extractie, genoomsequencing, natuurlijke transformatie, expressie van sfGFP, cryoconservatie en motiliteitsmethoden.

Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Dit protocol beschrijft hoe filamenteuze cyanobacterie die tot oscillatoriales behoort, kan worden getransformeerd door natuurlijke transformatie. Het laat ook zien hoe verschillende soorten beweging kunnen worden bestudeerd. Natuurlijke transformatie is de eenvoudigste transformatietechniek, als het werkt.Alleen DNA, cellen en groeimedium zijn nodig. Tot nu toe kon geen enkel ander oscillatoriales-lid worden getransformeerd door natuurlijke transformatie. We hopen dat onze studies andere groepen stimuleren om andere oscillatoria te proberen.Maak voor transformatie een goede, gezond uitziende cultuur en een goede DNA-voorbereiding. Gebruik voor bewegingsstudies altijd een met echografie behandelde cultuur. De behandeling moet vers zijn.De procedure wordt gedemonstreerd door Nora Weber, een technicus van mijn laboratorium. Begin met het inenten van 50 milliliter vloeibaar F2-medium in elk van de twee kolven van 250 milliliter met één milliliter P.lacuna filamenten uit een lopende cultuur. Kweek in wit licht onder agitatie gedurende ongeveer vijf dagen bij 25 graden Celsius.Homogeniseer na vijf dagen 100 milliliter P.lacuna celluspensie bij 10.000 RPM gedurende drie minuten en meet de optische dichtheid bij 750 nanometer. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende 15 minuten bij 6.000 keer G.Verwijder het supernatant en suspensie de pellet in 800 microliter van de resterende vloeistof en extra F2 + medium. Neem acht F2+Bacto agar platen met 120 microgram per milliliter kanamycine en pipetteer 10 microgram DNA in het midden van elke agarplaat.Pipetteer onmiddellijk 100 microliter van de celsuspensie bovenop het DNA. Houd de agarplaat zonder deksel op de schone bank om de overtollige vloeistof te laten verdampen. Sluit het bord en kweek het twee dagen in wit licht bij 25 graden Celsius.Verdeel na twee dagen de filamenten van elke agarplaat over verschillende verse F2 + Bacto-agarplaten met 120 microgram per milliliter kanamycine met een inentingslus. Kweek de platen in wit licht bij 25 graden Celsius en controleer de culturen regelmatig onder een microscoop. Identificeer na 14 tot 28 dagen de dode bruinachtige filamenten en zoek naar getransformeerde filamenten onder de microscoop.De getransformeerde filamenten zien er gezond en groen uit en zijn anders dan de bulk van filamenten. Breng elk getransformeerd filament over in kolven van 50 milliliter met 10 milliliter F2+medium met 250 microgram per milliliter kanamycine. Kweek in wit licht bij 25 graden Celsius op een shaker en observeer de groei gedurende maximaal vier weken.Breng de filamenten terug naar het agarmedium dat 250 microgram per milliliter kanamycine bevat en wacht tot de filamenten zijn gegroeid. Verhoog vervolgens de kanamycineconcentratie opnieuw om de segregatie te versnellen. Voor GFP-expressie observeert u afzonderlijke filamenten met een fluorescentiemicroscoop bij 40X of 63X vergroting en legt een helder veld transmissiebeeld en een fluorescentiebeeld vast.Cultiveer P.lacune in F2-medium onder 50 RPM horizontale agitatie in wit licht gedurende ongeveer vijf dagen totdat de geschatte optische dichtheid bij 750 nanometer 0,35 wordt. Bewaar het monster bij vier graden Celsius. Homogeniseer de filamenten met ultrageluid gedurende één minuut bij maximaal vermogen en cyclus van één.Meet de optische dichtheid op 750 nanometer en breng acht milliliter van het medium met P.lacuna over in een petrischaaltje van zes centimeter. Wacht een paar minuten totdat het monster op kamertemperatuur is en bedek de petrischaal met cellofaanfolie. Plaats een microscoopglaasje op de X-Y tafel van een standaard microscoop met een camera.Schakel het microscooplicht in en verplaats een 4X of 10X objectief in het pad van het licht. Plaats vervolgens de petrischaal bovenop de dia. Pas afzonderlijke filamenten of filamentbundels aan met de X-, Y- en Z-bewegingen van de tafel.Observeer de bewegingen van afzonderlijke filamenten of bundels en registreer de bewegingen met een standaard microscoopcamera. Zorg ervoor dat de objectieflens de vloeistof niet raakt. Pipetteer 0,5 milliliter van een oplossing met P.lacuna op het Bacto agar-oppervlak van een petrischaaltje van zes centimeter.Laat de vloeistof het oppervlak binnendringen. Sluit na ongeveer 20 minuten de petrischaal en observeer de beweging van de filamenten op het oppervlak met behulp van een 4X of 10X objectief. Leg de timelapse-opnames vast met een oculaire camera en een minicomputersysteem.De filamenten moeten eerst met het oog worden scherpgesteld en vervolgens door de oculaire camera. Zorg ervoor dat het tijdsinterval tussen de volgende afbeeldingen vijf seconden tot één minuut is. Programmeer het Linux-script van de minicomputer om de timelapse-opname te regelen.Bereid LED-houders voor waar de vijf millimeter LED's zijn gemonteerd om een gebied van 20 millimeter vierkant van onder naar boven te bestralen. Meet en pas de LED-intensiteiten aan. Zorg ervoor dat de hele instelling zich in een donkere kamer of een gesloten, donkere container bevindt.Plaats acht milliliter van het medium met P.lacuna in een petrischaaltje van zes centimeter, sluit de petrischaal met het deksel en plaats deze op een LED-houder zodat de LED zich in het midden van de petrischaal bevindt. Maak na meestal twee dagen een foto van de petrischaal met een smartphonecamera die direct op de positie van de lichtbehandeling is gericht. Gebruik een houder en een wit vel als achtergrond om voor elke foto dezelfde afstand en lichtomstandigheden te garanderen.Open de ImageJ-software, klik op Bestand, Openen en selecteer het bestand. Klik vervolgens op Enter. Selecteer de rechte knop en druk op de linkermuisknop om een lijn te trekken van het ene uiteinde van de petrischaal naar het andere uiteinde.Zorg ervoor dat de lijn door het midden van de cirkel van filamenten loopt. Klik op Analyseren en meten om de lengte van de petrischaal te zien. Klik vervolgens op Profiel analyseren en plotten in het menu ImageJ.Schat een gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit buiten de cirkel en een andere gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit binnen de cirkel. Plaats de muisaanwijzer op de Y-positie tussen deze waarden om de X-waarden van beide zijden van de cirkel te schatten. Noteer beide waarden en bereken het verschil.Selecteer vervolgens de rechte knop en teken een lijn met de middelste maximale waarde van de pixelintensiteit. Klik ten slotte op Analyseren en vervolgens op Meten om de lengte van de binnenste celcirkel te krijgen. Integratie en segregatie van insert na de transformatie van P.lacuna met PAK1 wordt hier getoond.Een PCR-test met buitenste primers ongeveer een week na de transformatie heeft meestal twee banden op de elektroforesegel, één met de grootte van de wild-type band en één langzamer migrerende band die het inbrengen van de weerstandscassette aangeeft. Hier vertegenwoordigen de banen 1 tot en met 4 PCR-producten van filamenten na zeven dagen, 11 dagen, 14 dagen en 17 dagen van de isolatie van een resistent filament, en baan 5 vertegenwoordigt PCR-product van wild-type. In het zevendaagse monster is de insert aanwezig in een kleine fractie van de chromosomen.Deze fractie neemt toe tot 17 dagen, waar geen wild-type band zichtbaar is; dat wil zeggen, de segregatie is voltooid. Deze afbeelding vertegenwoordigt de vector pMH1 voor sfGHP-expressie onder controle van endogene phycocyanine bètapromotor. P.lacuna homologe sequentie, pUC19 vector backbone en insert met sfGFP en kanamycine resistentie worden hier getoond.In pMH1 wordt het sfGHP-gen drie priemgetallen van het phycocyanine bèta-gen geplaatst; daarom wordt het aangedreven door de endogene cpc bètapromotor. Fluorescentiebeelden van P.lacuna wild-type filamenten en na transformatie met PAK1, PAK2, PAK3 en pMH1 worden hier getoond. De expressie van sfGFP wordt aangestuurd door de cpc 560 promotor, de a2813 promotor, de psbA2S promotor, of de endogene cpc beta promotor.De hier gepresenteerde samengevoegde afbeeldingen tonen de beweeglijkheid van Phormidium lacune. De beweging op het agaroppervlak wordt hier weergegeven. Het tijdsinterval was één minuut.De beweging in het vloeibare medium wordt hier gepresenteerd. Het tijdsinterval was 10 seconden. Natuurlijke transformatie is een eenvoudige methode.Meng plasmide-DNA met een resistentiecassette in homologe sequenties met de cellen en laat de cellen groeien op een medium met antibiotica. Genen kunnen worden geïnactiveerd en eiwitten kunnen overexpressie krijgen. Dit is belangrijk voor elk fundamenteel onderzoek en voor biotechnische studies.In eencellige cyanobacteriën waar ook natuurlijke transformatie is vastgesteld, kwamen moleculaire studies over fotosynthese of fotoreceptoren, et cetera, aan bod.

natural-transformation-protein-expression-cryoconservation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Weber, N. et. al., Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a focused LED-based assay for studying phototaxis in filamentous cyanobacteria. The bacteria migrate toward the light source, forming a dense accumulation at the illuminated center, which is visualized and quantified through pixel intensity analysis of the captured image.

Phototaxis Assay of Filamentous Cyanobacteria Using Focused Light Illumination

Source: Weber, N., et al., Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)This video describes a procedure for performing natural transformation in filamentous cyanobacteria using plasmid DNA to achieve stable GFP expression and antibiotic resistance through homologous recombination.

Natural Transformation and GFP Expression in the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Source: Weber, N., et al., Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the procedure to assess gliding motility in Phormidium lacuna by homogenizing filament cultures to create a uniform suspension, preparing a Petri plate assay setup over a microscope slide, and visualizing filament movement.

Gliding Motility in Phormidium lacuna Filaments

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Dit protocol wordt beschreven hoe de voorbijgaande verdichting van het DNA in cyanobacteriën visualiseren. Synchrone teelt, toezicht door fluorescentie microscopie, snelle invriezen, en hoge spanning cryo-Elektronentomografie worden gebruikt. Een protocol voor deze methodologieën wordt gepresenteerd, en toekomstige toepassingen en ontwikkelingen worden besproken.

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.

Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën

Leer natuurlijke transformatie en motiliteitsanalyse van de filamenteuze cyanobacterie Phormidium lacuna. Deze methode opent nieuwe mogelijkheden voor genetisch onderzoek binnen de orde Oscillatoriales.

Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium

Meer video's verkennen