Natuurlijke transformatie, eiwitexpressie en cryoconservatie van de lacune van de filamenteuze cyanobacterium Phormidium

Dit protocol beschrijft hoe filamenteuze cyanobacterie die tot oscillatoriales behoort, kan worden getransformeerd door natuurlijke transformatie. Het laat ook zien hoe verschillende soorten beweging kunnen worden bestudeerd. Natuurlijke transformatie is de eenvoudigste transformatietechniek, als het werkt.

Alleen DNA, cellen en groeimedium zijn nodig. Tot nu toe kon geen enkel ander oscillatoriales-lid worden getransformeerd door natuurlijke transformatie. We hopen dat onze studies andere groepen stimuleren om andere oscillatoria te proberen.

Maak voor transformatie een goede, gezond uitziende cultuur en een goede DNA-voorbereiding. Gebruik voor bewegingsstudies altijd een met echografie behandelde cultuur. De behandeling moet vers zijn.

De procedure wordt gedemonstreerd door Nora Weber, een technicus van mijn laboratorium. Begin met het inenten van 50 milliliter vloeibaar F2-medium in elk van de twee kolven van 250 milliliter met één milliliter P.lacuna filamenten uit een lopende cultuur. Kweek in wit licht onder agitatie gedurende ongeveer vijf dagen bij 25 graden Celsius.

Homogeniseer na vijf dagen 100 milliliter P.lacuna celluspensie bij 10.000 RPM gedurende drie minuten en meet de optische dichtheid bij 750 nanometer. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende 15 minuten bij 6.000 keer G.Verwijder het supernatant en suspensie de pellet in 800 microliter van de resterende vloeistof en extra F2 + medium. Neem acht F2+Bacto agar platen met 120 microgram per milliliter kanamycine en pipetteer 10 microgram DNA in het midden van elke agarplaat.

Pipetteer onmiddellijk 100 microliter van de celsuspensie bovenop het DNA. Houd de agarplaat zonder deksel op de schone bank om de overtollige vloeistof te laten verdampen. Sluit het bord en kweek het twee dagen in wit licht bij 25 graden Celsius.

Verdeel na twee dagen de filamenten van elke agarplaat over verschillende verse F2 + Bacto-agarplaten met 120 microgram per milliliter kanamycine met een inentingslus. Kweek de platen in wit licht bij 25 graden Celsius en controleer de culturen regelmatig onder een microscoop. Identificeer na 14 tot 28 dagen de dode bruinachtige filamenten en zoek naar getransformeerde filamenten onder de microscoop.

De getransformeerde filamenten zien er gezond en groen uit en zijn anders dan de bulk van filamenten. Breng elk getransformeerd filament over in kolven van 50 milliliter met 10 milliliter F2+medium met 250 microgram per milliliter kanamycine. Kweek in wit licht bij 25 graden Celsius op een shaker en observeer de groei gedurende maximaal vier weken.

Breng de filamenten terug naar het agarmedium dat 250 microgram per milliliter kanamycine bevat en wacht tot de filamenten zijn gegroeid. Verhoog vervolgens de kanamycineconcentratie opnieuw om de segregatie te versnellen. Voor GFP-expressie observeert u afzonderlijke filamenten met een fluorescentiemicroscoop bij 40X of 63X vergroting en legt een helder veld transmissiebeeld en een fluorescentiebeeld vast.

Cultiveer P.lacune in F2-medium onder 50 RPM horizontale agitatie in wit licht gedurende ongeveer vijf dagen totdat de geschatte optische dichtheid bij 750 nanometer 0,35 wordt. Bewaar het monster bij vier graden Celsius. Homogeniseer de filamenten met ultrageluid gedurende één minuut bij maximaal vermogen en cyclus van één.

Meet de optische dichtheid op 750 nanometer en breng acht milliliter van het medium met P.lacuna over in een petrischaaltje van zes centimeter. Wacht een paar minuten totdat het monster op kamertemperatuur is en bedek de petrischaal met cellofaanfolie. Plaats een microscoopglaasje op de X-Y tafel van een standaard microscoop met een camera.

Schakel het microscooplicht in en verplaats een 4X of 10X objectief in het pad van het licht. Plaats vervolgens de petrischaal bovenop de dia. Pas afzonderlijke filamenten of filamentbundels aan met de X-, Y- en Z-bewegingen van de tafel.

Observeer de bewegingen van afzonderlijke filamenten of bundels en registreer de bewegingen met een standaard microscoopcamera. Zorg ervoor dat de objectieflens de vloeistof niet raakt. Pipetteer 0,5 milliliter van een oplossing met P.lacuna op het Bacto agar-oppervlak van een petrischaaltje van zes centimeter.

Laat de vloeistof het oppervlak binnendringen. Sluit na ongeveer 20 minuten de petrischaal en observeer de beweging van de filamenten op het oppervlak met behulp van een 4X of 10X objectief. Leg de timelapse-opnames vast met een oculaire camera en een minicomputersysteem.

De filamenten moeten eerst met het oog worden scherpgesteld en vervolgens door de oculaire camera. Zorg ervoor dat het tijdsinterval tussen de volgende afbeeldingen vijf seconden tot één minuut is. Programmeer het Linux-script van de minicomputer om de timelapse-opname te regelen.

Bereid LED-houders voor waar de vijf millimeter LED's zijn gemonteerd om een gebied van 20 millimeter vierkant van onder naar boven te bestralen. Meet en pas de LED-intensiteiten aan. Zorg ervoor dat de hele instelling zich in een donkere kamer of een gesloten, donkere container bevindt.

Plaats acht milliliter van het medium met P.lacuna in een petrischaaltje van zes centimeter, sluit de petrischaal met het deksel en plaats deze op een LED-houder zodat de LED zich in het midden van de petrischaal bevindt. Maak na meestal twee dagen een foto van de petrischaal met een smartphonecamera die direct op de positie van de lichtbehandeling is gericht. Gebruik een houder en een wit vel als achtergrond om voor elke foto dezelfde afstand en lichtomstandigheden te garanderen.

Open de ImageJ-software, klik op Bestand, Openen en selecteer het bestand. Klik vervolgens op Enter. Selecteer de rechte knop en druk op de linkermuisknop om een lijn te trekken van het ene uiteinde van de petrischaal naar het andere uiteinde.

Zorg ervoor dat de lijn door het midden van de cirkel van filamenten loopt. Klik op Analyseren en meten om de lengte van de petrischaal te zien. Klik vervolgens op Profiel analyseren en plotten in het menu ImageJ.

Schat een gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit buiten de cirkel en een andere gemiddelde waarde voor de pixelintensiteit binnen de cirkel. Plaats de muisaanwijzer op de Y-positie tussen deze waarden om de X-waarden van beide zijden van de cirkel te schatten. Noteer beide waarden en bereken het verschil.

Selecteer vervolgens de rechte knop en teken een lijn met de middelste maximale waarde van de pixelintensiteit. Klik ten slotte op Analyseren en vervolgens op Meten om de lengte van de binnenste celcirkel te krijgen. Integratie en segregatie van insert na de transformatie van P.lacuna met PAK1 wordt hier getoond.

Een PCR-test met buitenste primers ongeveer een week na de transformatie heeft meestal twee banden op de elektroforesegel, één met de grootte van de wild-type band en één langzamer migrerende band die het inbrengen van de weerstandscassette aangeeft. Hier vertegenwoordigen de banen 1 tot en met 4 PCR-producten van filamenten na zeven dagen, 11 dagen, 14 dagen en 17 dagen van de isolatie van een resistent filament, en baan 5 vertegenwoordigt PCR-product van wild-type. In het zevendaagse monster is de insert aanwezig in een kleine fractie van de chromosomen.

Deze fractie neemt toe tot 17 dagen, waar geen wild-type band zichtbaar is; dat wil zeggen, de segregatie is voltooid. Deze afbeelding vertegenwoordigt de vector pMH1 voor sfGHP-expressie onder controle van endogene phycocyanine bètapromotor. P.lacuna homologe sequentie, pUC19 vector backbone en insert met sfGFP en kanamycine resistentie worden hier getoond.

In pMH1 wordt het sfGHP-gen drie priemgetallen van het phycocyanine bèta-gen geplaatst; daarom wordt het aangedreven door de endogene cpc bètapromotor. Fluorescentiebeelden van P.lacuna wild-type filamenten en na transformatie met PAK1, PAK2, PAK3 en pMH1 worden hier getoond. De expressie van sfGFP wordt aangestuurd door de cpc 560 promotor, de a2813 promotor, de psbA2S promotor, of de endogene cpc beta promotor.

De hier gepresenteerde samengevoegde afbeeldingen tonen de beweeglijkheid van Phormidium lacune. De beweging op het agaroppervlak wordt hier weergegeven. Het tijdsinterval was één minuut.

De beweging in het vloeibare medium wordt hier gepresenteerd. Het tijdsinterval was 10 seconden. Natuurlijke transformatie is een eenvoudige methode.

Meng plasmide-DNA met een resistentiecassette in homologe sequenties met de cellen en laat de cellen groeien op een medium met antibiotica. Genen kunnen worden geïnactiveerd en eiwitten kunnen overexpressie krijgen. Dit is belangrijk voor elk fundamenteel onderzoek en voor biotechnische studies.

In eencellige cyanobacteriën waar ook natuurlijke transformatie is vastgesteld, kwamen moleculaire studies over fotosynthese of fotoreceptoren, et cetera, aan bod.