Snijden van de embryonale kip auditieve hersenstam om tonotopische gradiënten en microcircuits te evalueren

Deze methode verwerft levende plakjes van de auditieve hersenstam van de kip die een grotere gradiënt van frequentiegebied in hetzelfde segment omvat. Deze plakjes zijn geschikt voor elektrofysiologische en anatomische experimenten met een grotere tonotopische as. Deze methodologie zal helpen om de ontwikkeling van microcircuits in de auditieve hersenstam te begrijpen.

Hoewel de anatomie specifiek is voor de kip, hebben andere vogelsoorten zoals kwartels en zangvogels een vergelijkbare anatomie. Steriliseer om te beginnen de eieren met 70% ethanol en incubeer ze bij 38 graden Celsius en 50% vochtigheid. Stel vervolgens de borrelsnelheid voor de ACSF zo in dat de pH 7,2 tot 7,4 is met een osmolaliteit tussen 300 en 310 milliosmolar per liter.

Meng vervolgens vijf gram agarose in 100 milliliter dACSF. Los de agarose volledig op met behulp van een waterbad of magnetron totdat de agarose begint te borrelen. Giet de gesmolten agarose in een petrischaaltje tot een dikte van vijf millimeter en houd op kamertemperatuur om in te stellen.

Sluit na het instellen de petrischaal af en bewaar op vier graden Celsius. Snijd de agarose in kastblokken voor gebruik op het moment van dissectie. Reinig eerst het dissectiegebied met 70% ethanol.

Lijm het ondersteunende of schuine agaroseblok op de vibratomebak. Plaats het ei onder een fel licht en lokaliseer de met lucht gevulde ruimte aan de grotere of rondere kant van het ei, kraak vervolgens de schaal over de met lucht gevulde ruimte en leg de membraanzak bloot. Maak een zachte incisie in de zak om de snavel bloot te leggen.

Trek met een scalpel voorzichtig de nek en het hoofd uit het ei. Reinig na onthoofding de kop met gekoelde dACSF. Houd het hoofd stabiel in gekoelde dACSF en maak een rostrocaudale incisie.

Start de incisie achter en tussen de ogen en volg de lengte van de geoogste nek. Scheid de huid om de schedel bloot te leggen. Snijd de schedel achter het oog in middenlijn tot laterale richting.

Herhaal dit voor beide hemisferen. Snijd het rostrale deel van de schedel door het mes achter de ogen te plaatsen en een snelle snede te maken. Dompel het hoofd vervolgens onder in een schaal van gekoelde dACSF.

Maak met behulp van een kleine schaar middellijn tot laterale incisies in het caudale gebied van de schedel om de hersenen te scheiden zonder weefselschade te veroorzaken. Leg de hersenstam en het cerebellum voorzichtig bloot. Trek het dorsale gebied van de hele schedel in.

Verwijder de hersenstam en leg deze bloot door mild te borstelen met een fijne verfkwast. Gebruik een gebogen tang om de hersenstam te reinigen van verbindend weefsel en bloedvaten. Scheid de hersenstam van het cerebellum door de steeltjes af te snijden en de bloedvaten voorzichtig te verwijderen.

Trim de hersenstam van extra bloedvaten. Plaats eerst het vibratomeblad langs de horizontale as. Voor coronale plakjes lijmt u de hersenstam op een snijbak aan de rostrale kant, waarbij u de rostrocaudal-as verticaal houdt.

Voor sagittale plakjes houdt u de laterale mediale as verticaal. Voor horizontale plakjes lijmt u de ventrale kant en houdt u de dorsale ventrale as verticaal. Om het acute hoekige sagittale horizontale vlak te bereiken, lijmt u de ventrale kant van de hersenstam zodanig dat de ventrale dorsale as verticaal is op het agaroseblok van het hypotenusaoppervlak.

Lijm het tegenoverliggende oppervlak van het agaroseblok tegenover de snijbak en houd de rostrocaudal-as evenwijdig aan de bladrand. Als alternatief voor het snijden van vibratomen dompel je de geïsoleerde hersenstam onder in 4%laag smeltpunt agarose bij 40 graden Celsius in een petrischaaltje van 35 bij 10 millimeter. Nadat de agarose is stollen, snijdt u het kast agaroseblok met een scherp scheermesje.

Lijm het agaroseblok aan de rostrale kant en houd de rostrocaudal-as van de hersenstam verticaal. Neem coronale plakjes totdat het NM-gebied wordt gezien. Verwijder het agaroseblok van de lijm met een scherp mes.

Plaats met een fijne naald voorzichtig 0,5 microliter toluidineblauwe kleurstof op de NM om de kernen te spotten. Monteer dit blok opnieuw op de snijlade voor sagittale of horizontale plakjes. Identificeer de kernen met betrekking tot het gekleurde gebied en sectie de hersenstam.

Plaats na het snijden de 200 tot 300 micron sequentieel verzamelde plakjes in een gesneden kamer met ACSF om gedurende één uur bij kamertemperatuur te balanceren. Coronale delen van hersenstamweefsel van een E19 tot 21 kippenembryo vertegenwoordigen de relatieve isofrequentiegebieden van de auditieve hersenstamkernen van het laagste tot het hoogste karakteristieke frequentie auditieve gebied. De afferente gehoorzenuwvezels en de bifurcatie van NM-axonen waren zichtbaar.

Nucleus angularis werd ook waargenomen. In rostrale secties bevindt de superieure olivaire kern zich langs het ventrale laterale gebied van de coronale plak. In sagittale secties werden NM en nucleus laminaris of NL geïdentificeerd waar de gehoorzenuwvezels het cluster van neuronen binnendrongen.

De superieure olivaire kern werd geïdentificeerd in het rostrolaterale gebied. Auditieve gebieden met lage en hoge karakteristieke frequenties uit NM en NL langs de rostrocaudal-as werden gezien. Het meest mediale segment toonde de ipsilaterale en contralaterale axonale plukjes en het eindpunt van het auditieve gebied.

In de horizontale segmenten werden NM en NL geïdentificeerd in de richting van de middellijn en neuronen werden verspreid langs de laterale mediale as. Plakjes van het hersenstamweefsel in een scherpe hoek vanuit een horizontaal vlak toonden de auditieve hersenstamkernen over een grote diagonale spread. Vergrote beelden toonden de tonotopische as van de auditieve kernen langs de rostromediële tot caudolaterale as.

Zorg ervoor dat het hele proces wordt uitgevoerd in ijsgekoelde dACSF continu bubbeld met koolhydraatzuurstof. Dit protocol wordt gebruikt voor onderzoekers die anatomische en biofysische eigenschappen onderzoeken van het ontwikkelen van hersenstammicrocircuits, met name de relatie tussen de belangrijkste auditieve kernen.