Evaluatie van auditieve hersenstamrespons bij kippenbroedjes

Dit protocol combineert een klinisch relevante methodologie met een gerenommeerd dieronderzoeksmodel. Het zal helpen bij het beantwoorden van vragen over auditieve ontwikkeling en verfijning en functionele veranderingen in het gehoor na genetische manipulatie. Deze techniek is niet-invasief, dus het vereist geen operatie en kan worden gecombineerd met aanvullende experimenten.

Ook duurt het slechts ongeveer een uur om op te treden. Deze methode kan worden gebruikt op elke kleine vogelsoort. Vergelijkende fysiologie is dus relatief eenvoudig.

De kip ABR kan ook het effect op het functionele gehoor evalueren na genetische manipulatie. Begin met het verkrijgen van bevruchte kippeneieren met witte beenhoorn. Incubeer vervolgens het ei bij 38 graden Celsius en een luchtvochtigheid van 50% gedurende 21 dagen vóór de gewenste testdatum.

Zodra het ei is uitgekomen, weeg je het dier door het voorzichtig in een grote weegboot te plaatsen. Plaats het dier na anesthesie-injectie terug in de couveuse. Controleer vervolgens of de nek slap is en knijp in de teen van het dier met een tang.

Bepaal als volgende stap het geslacht van de kip met behulp van de vleugelveren. Breng later ontharingscrème aan met een wattenstaafje op het hoofd- en nekgebied, vooral in de buurt van de ooropening voor de vogel. Gebruik nu 70% isopropylalcoholdoekjes om veren, eventuele resterende ontharingscrème en de huid op het hoofd en de nek af te vegen.

Steriliseer ook de subdermale elektroden en rectale sonde met behulp van een 70% isopropylalcoholdoekje. Plaats het dier in een geluidsisolatie en elektrisch afgeschermde kamer, zodat de omgeving minimaal elektrisch en akoestisch geluid heeft voor de beste opnames. Gebruik een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van dieren op peil te houden.

Plaats nu de rectale sonde en bevestig het hoofd van het dier op zijn plaats of laat de snavel tegen een voorwerp rusten om ongewenste bewegingen te voorkomen. Zorg er vervolgens voor dat de temperatuurregelkamer de temperatuur van het dier tussen 37 en 41 graden Celsius houdt. Gebruik drie roestvrijstalen, zilverchloride naaldelektroden als referentie,actieve en common ground elektroden.

Plaats elke elektrode subdermaal twee tot drie millimeter in het hoofd, maar niet diep genoeg om de schedel binnen te dringen, en steek vervolgens de elektrode uit de huid, waardoor de punt bloot komt te liggen. Voor eenkanaalsopname plaatst u de actieve elektrode boven de schedel op de middellijn tot aan de gehoorgang. Plaats de referentie-elektrode achter het oor waar de stimulus zal worden toegediend en plaats de grondelektrode achter het contralaterale oor in de nek.

Controleer nu de elektrode-impedantie. Zorg ervoor dat de totale elektrode-impedantie niet hoger is dan vijf kilo ohm. Houd ook de interelectrode impedantie onder de drie kilo ohm.

Voor ABR-opname moet u, afhankelijk van de hardware en software van de acquisitie, de juiste geluidsniveaus kalibreren voor de gebruikte stimulusfrequenties. Verplaats nu het geluidstransducerapparaat naar het actieve oor van het dier en plaats het op een ondiepe diepte van twee millimeter in de gehoorgang. Controleer ten slotte het dier tijdens het testen.

Als de resultaten er abnormaal of afwezig uitzien, verplaatst u de geluidstransducer in de gehoorgang. Open eerst de software om ABR-opnames te verkrijgen. Stel de boven- en ondergrenzen voor artefactafwijzing in op ongeveer 25 microvolt, zodat dier, beweging of geluid tijdens een sweep die sweep uitsluit van de analyse.

Verzamel ten minste 1024 sweeps om een grote gemiddelde respons te verkrijgen die kan worden gedaan in twee opnames van elk 512 sweeps. Dit zorgt ervoor dat de respons prikkels oproept en herhaalbaar is. Stel in de versterkerinstellingen van de software de versterking in op 100.000, het laagdoorlaatfilter op 3.000 Hertz en het hoogdoorlaatfilter op 100 Hertz.

Stel de stimuluspresentatiesnelheid in tussen 10 en 20 stimuli per seconde en de tijdsduur van de klikprikkel op 100 microseconden. Stel vervolgens de bemonsteringsfrequentie in op 40 kilohertz, 25 microseconden voor de gegevens met de beste resolutie en stel de stimuluspolarisatie in op afwisselend. Als u 512 sweeps registreert, combineer dan twee afzonderlijke tests om een 1.024 sweepgemiddelde te creëren en blijf opnemen met lagere en lagere intensiteiten totdat het opgeroepen potentieel niet langer kan worden geïdentificeerd.

Verlaag de stimulusintensiteit met stappen van vijf decibel geluidsdrukniveau om de laagste stimulusintensiteit te vinden die een opgeroepen reactie oproept. Definieer de ABR-drempel als de laagste stimulusintensiteit die een detecteerbare opgeroepen respons oproept. Na het euthanaseren en onthoofden van het dier en het experiment door het verwarmingskussen, de rectale sonde en zilverchloride-elektroden met 70% isopropylalcoholdoekjes te reinigen, moet u ervoor zorgen dat alle verworven sporen zijn opgeslagen.

Dit cijfer vertegenwoordigt de klik-ABR. Golf I pieklatentie steeg met ongeveer 0,3 milliseconden voor elke 20 decibel afname van de stimulusintensiteit. Wave I presenteerde ook de grootste piekamplitude en de laagste pieklatentievariabiliteit van alle golfvormpieken.

De grafiek toont de toonuitbarsting die ABR oproept. De beste respons was te zien bij 1.000 Hertz. De figuur toont aan dat als de lichaamstemperatuur niet wordt gehandhaafd, de latentie-intensiteitsfuncties van de ABR zeer variabel en vaak onnauwkeurig zijn.

De figuur laat zien dat ABRs geregistreerd van jongen van minder dan drie uur oud, gelabeld als P1, pieklatenties hebben die aanzienlijk zijn verlengd en piekamplitudes verminderd in vergelijking met oudere jongen, gelabeld als P2. De figuur vergelijkt 75 decibel geluidsdrukniveau kliksporen in hetzelfde dier met verschillende referentie-elektrodeplaatsingen. Golf II piek amplitude voor de mastoïde plaatsing trad op één milliseconde na de golf II piek voor de nek plaatsing. Dit tijdsverschil weerspiegelt waarschijnlijk de locaties van ABR neurale generatie ten opzichte van de plaatsing van de elektrode.

De reacties tussen de twee oren waren vergelijkbaar met kleine veranderingen in piekamplitudes, waarschijnlijk als gevolg van de positionering van de oortelefoon. De latentie van het linker- en rechteroor die gelijkwaardig zijn, ondersteunt de even gezonde functie van beide oren- en hersenstamhelften in de broedkip. De juiste plaatsing van de geluidstransducer kan onderscheid maken tussen goed en geen resultaat.

De kip ABR moet robuust zijn met een goede signaal-ruisverhouding. Alle vragen die door ABR-studies bij andere vogelsoorten worden behandeld, kunnen op de kip worden toegepast. Ook moleculair fysiologisch onderzoek bij embryonale kip kan deze in vivo methodologie omvatten.