Een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's strippen alleen met versnelde genezing gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor 1

Het doel van deze video is om een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's Stripping Only te beschrijven met versnelde genezing, gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor één. Fuch's Endothelial Corneal Dystrophy, of FECD, is een ziekte die wordt gekenmerkt door een verloren pompfunctie in cornea-endotheelcellen en de overmatige opbouw van collageen en andere extracellulaire matrixeiwitten op het oppervlak van het membraan van Descemet, waardoor cornea-guttae wordt gevormd. De enige bekende behandeling voor FECD is endotheel keratoplastiek in verschillende vormen, die allemaal gepaard gaan met een risico op afstoting en endotheelcelverlies.

Hoewel vooruitgang in oogheelkundige chirurgie deze procedures in staat heeft gesteld om in de loop van de tijd minder invasief te worden, komt elke vorm van transplantatie met het risico van afstoting en de mogelijkheid van levenslang gebruik van steroïden. Descemet's Stripping Only, of DSO, is een experimenteel alternatief waarbij FECD-patiënten met guttae gelokaliseerd in het midden van het hoornvlies de centrale vier millimeter cirkel van Descemet's membraan laten verwijderen zonder transplantaatvervanging. De verwijdering van guttae moedigt gezonde perifere cellen aan om naar binnen te migreren en de endotheelmonolaag te hervormen, waardoor uiteindelijk het stromale oedeem wordt omgedraaid en het gezichtsvermogen wordt verbeterd.

Hoewel er veel voordelen aan deze methode zijn, is het genezingsproces langdurig en inconsistent en sommige patiënten hebben een reddingstransplantatie nodig als er geen genezing wordt gezien in de volgende operatie van de maand. Een behandeling die een snellere wondgenezing na DSO stimuleert, kan de procedure een meer haalbare optie maken voor patiënten met FECD. Dit protocol modelleert de klinische DSO-procedure in een orgaankweekformaat met behulp van menselijke donorhoornvliezen, met als doel behandelingen te testen om de wondgenezing na DSO te verbeteren, om DSO een meer haalbare optie te maken voor patiënten met FECD.

Ons laboratorium gebruikt dit model om wondgenezing te testen in hoornvliezen die zijn behandeld met een gemanipuleerde fibroblastgroeifactor waarvoor we later in deze video representatieve resultaten zullen laten zien. In dit deel van de procedure zal een biopsiestoot worden gebruikt om het vier millimeter wondgebied te markeren waaruit het membraan van Descemet zal worden gestript. Verwijder met behulp van een steriele tang het hoornvlies uit de media en spoel af in 1X PBS om resterende media en celresten te verwijderen.

Plaats na het spoelen de endotheelzijde van het hoornvlies naar boven op het deksel van een petrischaaltje. Doop een nieuwe vier millimeter biopsiestoot in trypanblauw in een lasschaal en tik overtollig af. Plaats de stoot met beide handen boven het midden van het hoornvlies en laat deze recht naar beneden op het endotheeloppervlak zakken, waarbij minimale druk wordt uitgeoefend.

Zonder de positie of druk op het hoornvlies te veranderen, verplaatst u de stoot naar één hand en grijpt u met de nieuwe vrije hand naar een tang. Gebruik de tang om het hoornvlies op zijn plaats te houden terwijl je de biopsiestoot verschillende keren ongeveer 90 graden heen en weer draait. Til de biopsiestoot recht omhoog van het hoornvlies en zet apart.

Spoel nogmaals in 1X PBS om overtollige trypan blauw te verwijderen. Breng het hoornvlies op het deksel van de petrischaal over in een ontleedkijker. Door het hoornvlies op zijn plaats te houden met een gebogen tang, wordt het membraan van Descemet gescoord door de punt van een scherpe naald van 30 gauge lichtjes langs de ring van trypan blauw te slepen die door de biopsiestoot is achtergelaten.

Gebruik minimale druk om te voorkomen dat het onderliggende stroma wordt verstoord. Gebruik met een sinskey-haak zachte schepbewegingen om het membraan van Descemet rond de wondrand op te tillen en af te pellen. Werken naar het midden van de laesie.

Het membraan van Descemet zou met zeer weinig weerstand moeten komen. Als je problemen ondervindt, trek je waarschijnlijk stroma op. Als dit gebeurt, begin dan opnieuw en til vanaf een nieuw punt langs de wondrand.

Zodra het grootste deel van het membraan van Descemet van het stroma is gescheiden, gebruikt u gorovoy-tangen om het membraan te verwijderen en opzij te zetten. Onderzoek het gestripte gebied op eventuele resterende stukjes membraan en verwijder met gorovoy-tang. Na het strippen van Descemet bevlekt u het hoornvlies met trypanblauw om het wondgebied te visualiseren.

Spoel het hoornvlies in 1X PBS met 0,01% calciumchloride en magnesiumchloride om celresten te verwijderen die kunnen interageren met trypanblauw en een strakke hechting van de resterende CECs aan het intacte Descemet-membraan te vergemakkelijken. Plaats het hoornvlies in een gelaste schaal en pipetteer 30 microliter trypanblauw op de endotheellaag gedurende 30 seconden. Gebruik een tang om het hoornvlies voorzichtig te laten schommelen om ervoor te zorgen dat het hele endotheeloppervlak bedekt is.

Spoel overtollig trypanblauw in PDS af met calcium en magnesium en stel het gekleurde hoornvlies af onder een ontleedmicroscoop voor het dag nul tijdspunt. Nadat deze procedure is voltooid, kweekhoorns in een zes putplaat met lage serummedia bestaande uit de volgende vermelde componenten. Kweek het linker hoornvlies in acht fabrieken van lage serummedia alleen, en het rechter hoornvlies in lage serummedia aangevuld met gemanipuleerde FGF-1 of andere gewenste testbehandelingen.

Incubeer de hoornvliezen bij 37 graden Celsius met 6% CO2 gedurende 14 dagen met dagelijkse mediawisselingen. Herhaal de trypankleuringsprocedure op dagen, drie, zes, negen, 12 en 14 en beeld elk hoornvlies onmiddellijk na de kleuring in. Zorg ervoor dat de camera-instellingen consistent blijven op alle tijdstippen.

Na de kweekperiode kunnen extra vlekken op de hoornvliezen worden uitgevoerd op basis van onderzoeksinteresses, specifiek voor het experiment. Aanvullende vlekken die relevant zijn voor de onderzoeksinteresses van ons laboratorium zijn alizarinekleuring, evenals fluorescerende kleuring voor EDU-opname en ZO-1 tight junction-eiwitten. Alizarinekleuring wordt uitgevoerd om celranden te visualiseren om trypan-kleuringsresultaten te bevestigen en celmorfologie in het genezen gebied te visualiseren.

ZO-1 immunofluorescente kleuring maakt visualisatie van tight junction-vorming tussen CECs mogelijk, wat van bijzonder belang is in en rond het genezen gebied. EdU-etikettering wordt uitgevoerd als een kwalitatieve maat om te bevestigen dat proliferatie bijdraagt aan genezing en kan ook worden gebruikt om prolifererende cellen in sommige contexten te kwantificeren. Meer gedetailleerde instructies over het uitvoeren van deze specifieke kleuringsprocedures zijn opgenomen in het artikel dat overeenkomt met deze video.

Hier zijn representatieve afbeeldingen van een paar hoornvliezen die dystrofisch werden beoordeeld door de Eye-Bank en die werden geïncubeerd met of zonder de gemanipuleerde FGF-1 gedurende een periode van 14 dagen. Zoals te zien is op de afbeeldingen, vertoonde het gemanipuleerde met FGF-1 behandelde hoornvlies een versnelde genezing in vergelijking met het onbehandelde controle-hoornvlies. Extra Alizarinekleuring aan het einde van de kweekperiode diende om celgrenzen af te bakenen en bevestigde met deze bevindingen.

Deze observatie werd gerepliceerd over 11 paar dystrofische hoornvliezen om het model te valideren in een monster van het hoornvlies dat het meest relevant is voor de klinische DSO-procedure. Beeldverwerkingssoftware, zoals ImageJ, kan worden gebruikt om het gekleurde gebied in deze afbeeldingen te meten om de voortgang van wondgenezing te kwantificeren, zoals hier te zien is. Alle dystrofische cornea's behandeld met gemanipuleerde FGF-1 vertoonden een grotere genezing op dag 14, vergeleken met de onbehandelde partner, wat resulteerde in een gemiddelde genezing van 91% in tegenstelling tot 38% in controle cornea's.

En dit verschil was statistisch significant. Aanvullende immunohistochemie gevisualiseerd door confocale beeldvorming onthulde semi-georganiseerde expressie van het ZO-1 tight junction-eiwit, wat eerdere Alizarine-kleuringspatronen weerspiegelt. EDU-etikettering bevestigde de aanwezigheid van prolifererende cellen in en rond het wondgebied en was zichtbaar in hogere niveaus in behandelde hoornvliezen in vergelijking met onbehandelde controles.

In sommige hoornvliesparen kan CEC-sterfte zichtbaar perifeer zijn aan het wondgebied, met name in dystrofische hoornvliezen. Hier zijn voorbeeldafbeeldingen van trypan-gekleurde hoornvliezen die aanzienlijke perifere celdood vertonen. Zoals te zien is in de beelden, treedt perifere celdood voornamelijk op eerdere tijdstippen op en keert geleidelijk om gedurende de kweekperiode.

Deze perifere kleuring kan de kwantificering van het wondgebied bemoeilijken wanneer het verbinding maakt met de wond, omdat het moeilijk kan zijn om de locatie van de rand van het wondgebied vast te stellen. In alle gevallen was de perifere trypankleuring echter voldoende verdwenen om meetbare beelden te produceren op het laatste dag 14-tijdstip. Wij geloven dat dit fenomeen uniek is voor donorhoornvliezen die ex vivo zijn gekweekt en niet relevant is voor menselijke hoornvliezen in vivo.

Aangezien schade aan het perifere endotheel voor zover wij weten in geen enkele klinische case study van DSO is gemeld. Een tweede kleuringspatroon waarnaar wordt verwezen als, verre perifere kleuring, werd vastgelegd in de Alizarin Red-afbeeldingen, maar was ook zichtbaar in trypan-blauwe afbeeldingen gedurende de cultuurperiode. Deze waarneming wordt gekenmerkt door een ring van donkere vlekken rond de limbus die wijzen op gecompromitteerd endotheel.

Ondanks de term kwam dit patroon zo vaak voor in zowel normale als dystrofische hoornvliezen dat ze niet als positief werden geteld voor perifere kleuring. Dit protocol stelde ons in staat om verbeterde genezingsresultaten aan te tonen in gekweekte hoornvliezen die werden behandeld met gemanipuleerde FGF-1 na het strippen van Descemet. Bovendien dient dit stripping-protocol als een waardevolle methode voor andere onderzoekers die DSO bestuderen en kan het worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder het testen van andere wondgenezingstherapieën, het evalueren van wijzigingen in de chirurgische techniek en het vergelijken van genezing tussen verschillende donorpopulaties of stadia van de ziekte.

We hopen dat dit onderzoek en ander onderzoek met behulp van dit protocol clinici aanmoedigt om DSO in de toekomst te beschouwen als een waardevolle behandelingsoptie voor hun in aanmerking komende FECD-patiënten.