Name: Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer primaire culturen van rat astrocyten en microglia voor onderzoek naar amyotrofische laterale sclerose. Deze methode onthult calciumsignalering en ondersteunt studies naar neuroinflammatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologische Ontwikkeling, contract nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, het FENS - NENS Education and Training Cluster-project "Trilaterale cursus over glia in neuro-inflammatie" en de EC H2020 MSCA RISE-subsidie # 778405. We bedanken Marija Adžić en Mina Perić voor het leveren van de immunohistochemische beelden en Danijela Bataveljić voor hulp bij het schrijven van papier.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijnen inzake de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en met toestemming van de Ethische Commissie van de Faculteit Biologie, Universiteit van Belgrado (goedkeuringsnummer EK-BF-2016/08). Met betrekking tot patiëntenmateriaal (sera voor IgG's) werd het verzameld voor routinematig klinisch onderzoek met toestemming van de geïnformeerde patiënt in overeenstemming met de ethische code van de World Medical Association (Verklaring van Helsinki) voor experimenten met mensen. Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Klinisch Centrum van Servië (nr. 850/6).
1. Primaire celkweekvoorbereiding
<ol><li>Isolatie van hersenweefsel OPMERKING: Isolatie moet worden uitgevoerd op ijs, met behulp van ijskoude oplossingen.<ol><li>Gebruik pasgeboren pups van 1-3 dagen oud voor primaire neonatale celkweek33. OPMERKING: Voor de hier gepresenteerde studie werden Sprague Dawley hSOD1G93A en niet-transgene ratten gebruikt. Voor genotypering werden rattenstaarten gebruikt voor latere DNA-extractie en PCR.</li>
		<li>Bestrooi het hoofd van de pup met 70% ethanol en onthoofd het onmiddellijk snel met een schaar.</li>
		<li>Knip de huid open met een schaar met een kleine hoek om de schedel bloot te leggen. Open de schedel door een snede te maken van het foramen magnum naar de banen. Maak vervolgens een loodrechte middellijnsnede. Verwijder de hersenen uit de schedel en plaats deze in een petrischaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). OPMERKING: Reinig de gereedschappen tussen pups om kruisbesmetting tussen transgene en niet-transgene pups te voorkomen. Isolatie van de cortices van de rest van de hersenen moet worden gedaan onder een stereomicroscoop.</li>
		<li>Gebruik de punt van de tang om de verbindingen tussen beide hemisferen te verbreken. Scheid vervolgens de hemisferen met een gebogen tang door voorzichtig een halve bol van het midden naar de zijkant te duwen.</li>
		<li>Verwijder de hersenvliezen door ze voorzichtig te scheuren met een rechte en gebogen tang.</li>
		<li>Verwijder de hippocampus door er met een gebogen tang in te knijpen. Gooi de hippocampus weg of gebruik het voor een ander celkweekpreparaat. OPMERKING: Verdere stappen moeten worden uitgevoerd onder de laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te garanderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Weefselhomogenisatie en dissociatie<ol><li>Breng een cortex over in een buis van 15 ml gevuld met 3 ml koude PBS. Pipetteer de ophanging op en neer met een tip van 1 ml en voltooi 10-15 slagen totdat de suspensie homogeen wordt. OPMERKING: Wees zeer voorzichtig om geen bubbels te produceren in dit proces.</li>
		<li>Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml koude PBS door het op en neer te pipetteren met een punt van 1 ml. Herhaal de centrifugatiestap. OPMERKING: Alle oplossingen die vanaf dit punt worden gebruikt, moeten worden voorbewarmd tot 37 °C.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 2 ml complete Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica (penicilline en streptomycine). Breng het homogenaat over in een buis van 2 ml.</li>
		<li>Laat het homogenaat door naalden van 21 G en 23 G (elk drie keer) gaan om een suspensie van afzonderlijke cellen te maken. OPMERKING: Wees zeer voorzichtig om geen bubbels te produceren in dit proces.</li>
	</ol></li>
	<li>Giet de celsuspensie bereid uit één cortex in een petrischaal met een diameter van 60 mm of een T25-kolf (met het oppervlak voorbehandeld met een polypeptidecoating voor de groei van hechte cellen) met 3 ml volledige DMEM. Schud de petrischaal lichtjes zodat de suspensie gelijkmatig wordt verdeeld.</li>
	<li>Kweek de cellen in de incubator in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2/95% lucht bij 37 °C.</li>
	<li>Vervang het medium 48 uur na isolatie en vervang het medium om de 3 dagen.</li>
	<li>Om de groei van astrocyten te bevorderen, wanneer cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken, wast u ze met voorbewarmde PBS om de losjes gehechte gliacellen en sporen van FBS in het medium te verwijderen.<ol><li>Trypsinize de onderliggende laag astrocyten door 1 ml voorgewarmde trypsine-oplossing toe te voegen (0,25% trypsine, 0,02% EDTA in PBS, steriel gefilterd).</li>
		<li>Zet het gerecht in de couveuse op 37 °C gedurende 2-5 min.</li>
		<li>Controleer de cellen onder de microscoop. Wanneer ze beginnen los te komen, voeg dan 4 ml volledige DMEM toe.</li>
		<li>Verzamel de celsuspensie en breng deze over naar een buis van 15 ml. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 1 ml volledig medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
		<li>Vergul de cellen opnieuw met een dichtheid van 104 cellen/cm2 in 5 ml verse complete DMEM.</li>
	</ol></li>
	<li>Verander het medium om de 3 dagen. Om de aanwezigheid van andere gliaceltypen te minimaliseren, nadat astrocyten 50% confluence hebben bereikt en voorafgaand aan elke mediavervanging, wast u de cellen met volledige DMEM.<ol><li>Aspirateer het supernatant medium met een pipet van 1 ml en doseer het meerdere keren voorzichtig op de cellaag. Zorg ervoor dat het hele oppervlak van de cellaag bedekt is tijdens deze wasstap.</li>
	</ol></li>
	<li>Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken (meestal na 14 dagen), herhaalt u de trypsinisatie en de verzameling astrocyten zoals beschreven in stap 1.6.</li>
	<li>Zaad 5 × 103 astrocyten op een cirkelvormige glazen afdekplaat van 7 mm bedekt met poly-L-lysine (50 μg/ml). Gebruik ze in experimenten na 48 uur.</li>
	<li>Om microglia te bevorderen, laat je na stap 1.7 de gliacellen een confluentlaagbereiken 34. Wanneer microgliale cellen bovenop de astrocytenlaag verschijnen (na 10-15 dagen, te herkennen aan hun kleinere, meer ovale lichamen en kortere processen), schud de petrischaal op een orbitale shaker gedurende 2 uur bij 220 tpm.</li>
	<li>Dispergeren en zaaien van microgliale cellen<ol><li>Was de losgemaakte en losjes bevestigde cellen lichtjes door het supernatantmedium met een pipetpunt van 1 ml aan te zuigen en meerdere keren voorzichtig op de cellaag te doseren. Zorg ervoor dat u het hele oppervlak van de cellaag bedekt tijdens deze wasstap, verzamel het medium met de losgemaakte cellen en breng het over naar een buis van 15 ml.</li>
		<li>Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1 ml medium.</li>
		<li>Laat de celsuspensie door een naald van 21 G gaan om een eencellige suspensie te verkrijgen. OPMERKING: De meeste gepubliceerde methoden gebruiken trypsine of papaïne om het weefsel te dissociëren; naalden van 21 G hebben echter het voordeel dat ze de overdigestie van cellen voorkomen, waardoor een zachtere dissociatie mogelijk is.</li>
		<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Zaad 5 × 103 microgliale cellen op een cirkelvormige glazen afdekplaat van 7 mm bedekt met poly-L-lysine (50 μg/ml). Gebruik ze in experimenten na 48 uur. OPMERKING: Het is moeilijk om een zuivere microgliale cultuur te verkrijgen door te schudden, omdat de oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten nog steeds in een variabel aantal aanwezig kunnen zijn, afhankelijk van de ervaring van de experimentator. Het immunocytochemische protocol dat wordt gebruikt om de aanwezigheid van verschillende celpopulaties in gliaculturen te schatten, is elders beschreven35.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Immunocytochemie
<ol><li>Spoel de cellen verguld op coverslips in PBS, 2 x 1 min.</li>
	<li>Bevestig de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Wassen in PBS 3 x 5 min.</li>
	<li>Incubeer in een blokkerende oplossing met 10% normaal ezelserum (NDS)/1% runderserumalbumine (BSA)/0,1% Triton X-100 gedurende 45 minuten bij RT.<ol><li>Voeg 50 μL van een blokkerende oplossing per afdeksel met een diameter van 10 mm toe.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid primaire antilichamen in 1% NDS / 1% BSA / 0,1% TritonX-100 in de volgende verdunningen: muis anti-GFAP 1: 300, geiten anti-Iba1 1:500. Incubeer de cellen met primaire antilichamen 's nachts bij +4 °C.</li>
	<li>Afspoelen in PBS, 3 x 10 min.</li>
	<li>Incubeer met de secundaire antilichamen geconjugeerd met een fluorofoor: ezel anti-muis (excitatie 488 nm [1:200)) of ezel anti-geit (geëxciteerd bij 647 nm [1:200)). Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij RT in het donker.</li>
	<li>Wassen in PBS, 7 x 5 min.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:4.000) gedurende 10 minuten bij RT.</li>
	<li>Wassen in PBS 5 x 5 min.</li>
	<li>Monteer de coverslips op microscoopglaasjes met behulp van een montageoplossing; gebruik er één druppel van per coverslip. OPMERKING: Antilichaamverdunningen kunnen variëren afhankelijk van de producent. Gebruikers moeten optimale verdunningen voor hun experimenten bepalen.</li>
</ol>3. Time-lapse videobeelden
OPMERKING: Oplossingen die de fluorescerende kleurstof bevatten, moeten worden beschermd tegen direct licht. Voordat u met het beeldvormingsexperiment begint, moet u ervoor zorgen dat de glazen afdekplaat niet beweegt bij het inschakelen van de perfusie.
<ol><li>Bereiding van oplossingen en cellen<ol><li>Bereid extracellulaire oplossing (ECS) voor beeldvorming: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose en 10 mM HEPES. Stel de pH in op 7,4. Zorg ervoor dat de osmolariteit 280-300 mOsm/kg is en bereid ECS voor zonder Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES en 0,1 mM EGTA.</li>
		<li>Bereid de testoplossingen: 100 μM ATP opgelost in ECS, 1 μM Thg in ECS zonder Ca2+ en 0,1 mg/ml ALS IgG in ECS8.</li>
		<li>Breng een coverslip over op een schaal met ECS om de volledige DMEM uit te wassen. Bereid de kleurstofbelastingsoplossing door 1 mM stamoplossing van Fluo-4 AM met ECS te verdunnen tot de eindconcentratie van 5 μM Fluo-4 AM.<ol><li>Plaats de coverslip met cellen in de kleurstoflaadoplossing gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Was de cellen in ECS gedurende 20 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Als cellen niet voldoende worden geladen (d.w.z. als het basale fluorescentieniveau te laag is <5% van het dynamische bereik van de camera met een belichtingstijd van meer dan 400 ms), verhoog dan de laadtijd tot maximaal 45 minuten tot 1 uur bij 37 °C. U kunt ook de Fluo-4 AM stockoplossing mengen met een gelijk volume van 20% (w/v) wasmiddel (Pluronic) in DMSO voordat u verdunt in ECS, waardoor de uiteindelijke pluronische concentratie ~0,02% wordt. OPMERKING: De experimentele voorbeelden van deze studie werden uitgevoerd met menselijk IgG geïsoleerd uit bloedsera van ALS-patiënten zoals eerder beschreven 4,5,11. Elk experiment werd uitgevoerd met IgG-monsters van een enkele patiënt.</li>
	</ol></li>
	<li>Videobeelden OPMERKING: In dit protocol werd het Video Imaging System gecombineerd met een xenon korte booglamp, een polychromatorsysteem en een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met water, glycerine en olie-onderdompelingsobject. Timelapse-beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een digitaal camerasysteem.<ol><li>Schakel de componenten van de beeldinstallatie 15 minuten voor het experiment in om het systeem de werktemperatuur te laten bereiken.</li>
		<li>Plaats de afdeksel in de opnamekamer met 1 ml werkoplossing (ECS of ECS zonder Ca2+).</li>
		<li>Om het juiste beeldvormingsprotocol te kiezen, opent u de beeldvormingssoftware en kiest u in het deelvenster Acquisitie de filterparen voor Fluo4-AM met een excitatiegolflengte bij 480 nm, een dichroïsche spiegel bij 505 nm en een emissiegolflengte bij 535 nm.</li>
		<li>Kies het gezichtsveld en zorg ervoor dat u gedurende het hele experiment een consistent aantal cellen hebt. Pas de belichtingstijd en detectorversterking op de juiste manier aan, zodat het signaal niet verzadigd is. Kies de pseudokleurmodus voor acquisitie. Raadpleeg voor meer gedetailleerde instructies de handleiding van de fabrikant.</li>
		<li>Pas de bemonsteringsfrequentie aan op 1 Hz (1 frame per seconde).</li>
		<li>Start de beeldvorming door het basale fluorescentieniveau gedurende 3-5 minuten te verkrijgen voor de basislijnbepaling (F0). Zorg voor een constante doorstroming van de werkoplossing.</li>
		<li>Stop de stroom van de werkoplossing en schakel over naar de testoplossing voor de gewenste tijdsduur (zie ook de tijdbalken in voorbeelden van figuur 2 en figuur 3). Was de cellen tussen elke testoplossing met een constante stroom van de werkoplossing gedurende 3-5 minuten.</li>
		<li>Houd het oplossingsvolume in de opnamekamer op ~1 ml door een constante zuigkracht van de bovenkant van de oplossing te regelen (zie figuur 2E). OPMERKING: Om de behandeling rechtstreeks op de afgebeelde cellen toe te passen, werd een aangepast toedieningssysteem gemaakt van een glazen pipet (0,8 mm binnendiameter) op ~ 350 μm afstand en ~ 1 mm boven de cellen geplaatst, onder een hoek van 45 ° in combinatie met het oplossingsuitwisselingssysteem met knijpkleppen en een elektronische klepregelaar (zie figuur 2E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>Definieer een interessante regio (ROI) die overeenkomt met de afzonderlijke cel.<ol><li>Kies het frame met de hoogste signaalintensiteit (d.w.z. van de toepassing van ATP) en omcirkel één cel met behulp van de toepassing Polygonal Tool. Herhaal dit voor alle cellen in het verkregen veld. Kies vijf ROI's op de achtergrond met behulp van het gereedschap Cirkel.</li>
		<li>Als u de gemiddelde signaalintensiteit van een enkele cel en de achtergrond voor elk tijdsbestek wilt meten, selecteert u alle ROIs en gebruikt u de opdracht Multi Measure in ROI Manager in ImageJ of een gelijkwaardige opdracht in commerciële software (zie de tabel met materialen).</li>
	</ol></li>
	<li>Exporteer de gemiddelde signaalintensiteitswaarden van de ROI's als spreadsheet.</li>
	<li>Gemiddeld vijf achtergrond-ROI's en trek de gemiddelde achtergrond van elk frame af van de gemiddelde ROI-intensiteit van het frame dat tegelijkertijd is verkregen.</li>
	<li>Om de verkregen gegevens te normaliseren naar het basislijnsignaal, gebruikt u vergelijking (1): ΔF/F0 = (F - F0)/F0 (1) waarbij F de signaalintensiteit is van elk tijdsbestek na achtergrondaftrek en F0 de basislijnfluorescentie Fluo-4 is. OPMERKING: In dit onderzoek is een op maat gemaakte code gebruikt.</li>
	<li>Om de calciumactiviteit te analyseren, bepaalt u verschillende parameters4: de amplitude van de calciumpiek (ΔF/F0), de geïntegreerde verandering (tijdintegraal, oppervlak onder de responsregistratie) van de calciumtransiënt (ΔF/F0 × s), tijd-tot-piek-verstreken tijd vanaf het begin van de stimulatie tot het maximum van calciumtransiënt(en), stijgende tijd verstreken vanaf het begin van de stimulatie tot de waarde van ΔF/F0 die 50%-80% van de maximale amplitude (s), halve breedte-volledige breedte van een transiënt bij half-maximale amplitude (s), frequentie van reacties als ze repetitief zijn (Hz).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dit artikel presenteert de methode van primaire celkweek als een snelle en "on the budget" tool voor het bestuderen van verschillende aspecten van cel (patho)fysiologie zoals ALS in het rat hSOD1G93A model. De techniek is dus geschikt voor studies op het niveau van één cel die kunnen worden geëxtrapoleerd en verder kunnen worden onderzocht op een hoger organisatieniveau (d.w.z. in weefselplakken of bij een levend dier). Celkweek als techniek heeft echter een paar kanttekeningen. Het is het meest cruciaal om de...

Celkweektechnieken hebben geleid tot tal van vooruitgang op verschillende gebieden van cellulaire neurofysiologie in gezondheid en ziekte. Met name primaire celculturen, vers geïsoleerd uit het neuronale weefsel van een proefdier, stellen de experimentator in staat om het gedrag van diverse cellen in verschillende biochemische media en fysiologische opstellingen nauwkeurig te bestuderen. Het gebruik van verschillende fluorescerende fysiologische indicatoren zoals de Ca2+-gevoelige kleurstoffen in combinatie met time-lapse videomicroscopie geeft in real time beter inzicht in de cellulaire biofysische en biochemische processen.
ALS is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die de bovenste en onderste motorneuronenaantast 1. De ziekte heeft een complexe pathogenese van het familiale type, maar meestal van de sporadische vorm (90% van de gevallen)2. Het is bekend dat niet-cel autonome mechanismen bijdragen aan de PATHOFYSIOLOGIE VAN ALS, voornamelijk vanwege de essentiële rol van gliacellen3. ALS wordt ook goed gekarakteriseerd als een neuro-inflammatoire ziekte met betrokkenheid van humorale en cellulaire ontstekingsfactoren.
Immunoglobuline G wordt veel gebruikt als moleculaire marker bij ALS en andere neurodegeneratieve ziekten. Het bestuderen van het serumniveau van deze marker kan wijzen op de aanwezigheid en het stadium van neuro-inflammatie bij de ziekte 4,5,6, terwijl de aanwezigheid ervan in het hersenvocht kan wijzen op een doorbraak van de bloed-hersenbarrière7. IKG's werden ook geïdentificeerd als afzettingen in de motorneuronen van het ruggenmerg van ALS-patiënten7. Niettemin heeft deze benadering enkele inconsistenties aangetoond in de correlatie van het niveau van IgG's met het stadium en de kenmerken van de ziekte6.
IgG geïsoleerd uit de sera van ALS-patiënten (ALS IgG) kan een calciumrespons induceren in naïeve astrocyten8 en glutamaatafgifte in neuronen, wat wijst op een excitotoxisch effect - een kenmerk van ALS-pathologie9. Studies naar het hSOD1G93A ALS-rattenmodel (met meerdere kopieën van de menselijke SOD1-mutatie10) toonden echter een aantal markers van oxidatieve stress in gekweekte neurogliale cellen11, weefsels 12,13,14 of levende dieren 13. Het is opmerkelijk dat de astrocyten gekweekt uit het ALS-rattenmodel meer vatbaar waren voor oxidatieve stress veroorzaakt door peroxide dan de astroglia van niet-transgene nestgenoten11.
Microgliale cellen in cultuur worden op een minder duidelijke manier beïnvloed door ALS IgG. Een BV-2 microgliale cellijn vertoonde namelijk een stijging van het signaal van fluorescerende markers van oxidatieve stress als reactie op de toepassing van slechts 4/11 ALS IgG-patiëntenmonsters15. Het is bekend dat microglia deelnemen aan vele neuro-inflammatoire pathologieën, wat bijdraagt aan oxidatieve stress en late progressiefase in het niet-cel autonome mechanisme van ALS 16,17. Niettemin gaven de gegevens met ALS IgG's aan dat deze cellen mogelijk niet zo reactief zijn als astrocyten op deze humorale factoren van ALS-ontsteking. Er zijn verschillende studies uitgevoerd met primaire astrocyten van ALS-muizenmodellen, niet alleen bij pups maar ook bij symptomatische dieren, hetzij op de hersenen of op het ruggenmerg 18,19,20,21. Dit geldt ook voor microgliale primaire culturen, hoewel in mindere mate dan astrocyten en meestal uit hersengebieden in het embryonale stadium 22,23,24.
We gebruiken time-lapse video beeldvorming van Ca2+ op cellen in cultuur voornamelijk als een middel om intracellulaire transiënten van dit ion te volgen als een fysiologische marker van excitotoxiciteit. Dus door biofysische karakterisering van deze transiënten (amplitude, gebied onder transiënt, rise-time, frequentie) kan de onderzoeker experimentele diagnostische parameters verkrijgen uit verschillende cellulaire modellen van neurodegeneratie. Deze techniek biedt dus een voordeel van een kwantitatieve fysiologische beoordeling van IKG's als ziektebiomarkers. Er is een grote hoeveelheid literatuur over de rol van IgG's en Ca2+ bij de inductie van ALS. De meeste van deze studies werden uitgevoerd door ALS te induceren door patiënt IgG's in proefdierente injecteren 25,26,27,28,29, die vervolgens intracellulaire Ca2+ verhoging en IgG-afzettingen vertoonden. Een reeks studies onderzocht het effect van ALS IKG's op de motorische synaps in vitro 30,31,32. In de bovenstaande context legt de hier gepresenteerde techniek de focus op de gliacellen als belangrijke spelers in het niet-cel autonome mechanisme van ALS en kwantificeert hun potentiële excitotoxische reactie op IgG's als humorale factoren van neuro-inflammatie. Deze aanpak kan een bredere toepassing hebben bij het testen van andere humorale factoren zoals hele sera, CSF of cytokines in verschillende celkweeksystemen en in cellulaire modellen van algemene ontsteking.
Dit artikel beschrijft hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen verder kunnen worden gebruikt om ALS-pathofysiologie te bestuderen met van sera afgeleide IgG van patiënten. Protocollen zijn gedetailleerd voor het laden van kleurstof van gekweekte cellen (figuur 1) en de opnames van Ca2+ veranderingen in time-lapse videobeeldvormingsexperimenten. Voorbeelden van video-opnames zullen laten zien hoe gliacellen reageren op ALS IgG in vergelijking met ATP, waarbij de laatste purinerge membraanreceptoren activeert. Voor het eerst wordt een voorbeeld getoond over hoe astrocyten geïsoleerd uit de hSOD1G93A ALS-rattenhersenen reageren met een meer uitgesproken Ca2+ respons op ALS IgG in vergelijking met niet-transgene controles en hoe dit proces te relateren aan de verschillen in Ca2+ winkelwerking. Ook is een voorbeeld getoond van calciumbeeldvorming in microgliale cellen die acuut worden uitgedaagd met ALS IgG, met slechts een bescheiden respons van intracellulair calcium.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>62 554 502</td><td></td></tr><tr><td>2 mL tube</td><td>Sarstedt, Germany</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>21 G needle</td><td>Nipro, Japan</td><td>HN-2138-ET</td><td></td></tr><tr><td>23 G needle</td><td>Nipro, Japan</td><td>HN-2338-ET</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td>Nipro, Japan</td><td>SY3-5SC-EC</td><td></td></tr><tr><td>6 mm circular glass coverslip</td><td>Menzel Glasser, Germany</td><td>630-2113</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>ThermoFisher Sientific, USA</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver A1</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>2110</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21447</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>&rdquo;evolve&rdquo;-EM 512 Digital Camera System</td><td>Photometrics, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ Software</td><td>Open source under the GNU General Public Licence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC filter set</td><td>Chroma Technology Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Iba1</td><td>Fujifilm Wako Chemicals, USA</td><td>011-27991</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biowest, France</td><td>P5455</td><td></td></tr><tr><td>HighSpeed Solution Exchange System</td><td>ALA Scientific Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>Math Works, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GFAP</td><td>Merck Millipore, USA</td><td>MAB360</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 40-88</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>324590</td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin and Streptomycin</td><td>ThermoFisher Sientific, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carlo Erba Reagents, Spain</td><td>471686</td><td></td></tr><tr><td>Shaker DELFIA PlateShake</td><td>PerkinElmer Life Sciencies, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Carl ROTH GmbH</td><td>X987.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargine</td><td>Tocris Bioscience, UK</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520</td><td>Wescor, ELITechGroup Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiFluor Imaging System</td><td>Visitron System Gmbh, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiChrome Polychromator System</td><td>Visitron System Gmbh, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView high performance setup</td><td>Visitron System Gmbh, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenon Short Arc lamp</td><td>Ushio, Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Dit protocol laat zien hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het rat hSOD1G93A-model . Ten eerste laat het protocol zien hoe astrocyten en microglia uit postnatale rattencorticosterces kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, en vervolgens hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd en getest op zuiverheid door immunocytochemie met behulp van de gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) marker van astrocyten en de geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) microgliale marker. In de volgende fase worden methoden beschreven voor het laden van kleurstoffen (calciumgevoelige Fluo 4-AM) van gekweekte cellen en de opnames van Ca2+ veranderingen in videobeeldexperimenten op levende cellen.
De voorbeelden van video-opnames bestaan uit: (1) gevallen van Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten die acuut zijn blootgesteld aan immunoglobuline G (IgG) geïsoleerd van ALS-patiënten, met een karakteristieke en specifieke respons in vergelijking met de respons op ATP zoals aangetoond in hetzelfde experiment. Voorbeelden tonen ook een meer uitgesproken voorbijgaande stijging van de intracellulaire calciumconcentratie opgewekt door ALS IgG in hSOD1G93A astrocyten in vergelijking met niet-transgene controles; (2) Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten tijdens een uitputting van calciumvoorraden door thapsigargin (Thg), een niet-competitieve remmer van het endoplasmatisch reticulum Ca2+ ATPase, gevolgd door opgeslagen calciuminvoer opgewekt door de toevoeging van calcium in de opnameoplossing, wat het verschil aantoont tussen Ca2+ winkelwerking in hSOD1G93A en in niet-transgene astrocyten; (3) Ca2+ beeldvorming van de gekweekte microglia die voornamelijk een gebrek aan respons op ALS IgG laat zien, terwijl ATP-toepassing een Ca2+ verandering veroorzaakte. Dit artikel benadrukt ook mogelijke kanttekeningen en waarschuwingen met betrekking tot kritische celdichtheid en zuiverheid van culturen, waarbij de juiste concentratie van de Ca2 + kleurstof- en kleurstoflaadtechnieken wordt gekozen.

Karakterisering van verschillende gliaceltypen in cultuur Het duurt meestal 15-21 dagen om astrocyten te produceren voor experimenten, terwijl microgliale cellen 10-15 dagen nodig hebben om te groeien. Immunostaining werd uitgevoerd om de celzuiverheid van de kweek te beoordelen. Figuur 1 toont de expressie van dubbele labeling van de astrocytische marker GFAP en de microgliale marker Iba1 in respectievelijke culturen.
Van calciumbeeldvorming i...

We presenteren hier een protocol over het voorbereiden van primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia uit rattencorticosterces voor time-lapse videobeeldvorming van intracellulaire Ca2+ voor onderzoek naar pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose in het hSOD1G93A-rattenmodel .

Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Dit protocol maakt het mogelijk om intercellulair calciumsignaleringspatroon te onthullen dat de reactie van elk celtype in gezondheid en ziekte karakteriseert. Deze techniek maakt een snelle en gedetailleerde biofysische karakterisering van complex cellulair gedrag mogelijk. We zijn van plan om deze IgG-geïnduceerde calciumsignalering te gebruiken als vingerafdruk voor gepersonaliseerde geneeskunde van neuro-inflammatoire ziekten.In het echte leven is het niet gemakkelijk om alle processen en gebeurtenissen te zien en te volgen, vooral die onder de microscoop. Daarom zijn de visuele gegevens belangrijk. Na het onthoofden van een tot drie dagen oude pups, legt u de schedel bloot door de huid open te snijden met een kleine schuine schaar.Open vervolgens de schedel door het foramen magnum naar de banen te snijden en maak een loodrechte middellijnsnede. Verwijder de hersenen uit de schedel en plaats deze in een petrischaal met PBS. Gebruik de punt van de tang om de verbindingen tussen beide hemisferen te scheuren en scheid de hemisferen met een gebogen tang door zachtjes een halve bol van het midden naar de zijkant te duwen.Gebruik een rechte en gebogen tang om de hersenvliezen te verwijderen door ze voorzichtig te scheuren. Verwijder vervolgens de hippocampus door deze met een gebogen tang te knijpen en weg te gooien of te gebruiken voor een ander celkweekpreparaat. Breng vervolgens de cortex over in een buis van 15 milliliter met drie milliliter koude PBS en homogeniseer het weefsel door 10 tot 15 keer op en neer te pipetteren met een punt van één milliliter.Centrifugeer de cellen op 500 g gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in drie milliliter koude PBS door te pipetteren met een punt van één milliliter. Centrifugeer nogmaals en resuspendeer de pellet in twee milliliter complete DMEM aangevuld met 10% FBS en antibiotica.Nadat u het homogenaat in een buis van twee milliliter hebt overgebracht, passeert u het homogenaat door naalden van 21 en 23 gauge om een suspensie van enkele cellen te maken. Giet de celsuspensie bereid vanuit één cortex in een petrischaaltje van 60 millimeter met drie milliliter volledige DMEM en schud de petrischaal lichtjes, zodat de suspensie gelijkmatig wordt verdeeld. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide en 95% lucht bij 37 graden Celsius.Om de groei van astrocyten te bevorderen, verwijdert u de oude media en wast u de cel met voorverwarmde PBS om de losjes gehechte gliacellen en sporen van FBS te verwijderen zodra ze 70 tot 80% samenvloeiing bereiken. Trypsinize vervolgens de onderliggende laag astrocyten door één milliliter voorverwarmde trypsine-oplossing toe te voegen en gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius te incuberen. Gebruik een microscoop om te controleren of de cellen beginnen los te komen en voeg vier milliliter volledige DMEM toe.Verzamel de celsuspensie en breng deze over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer vervolgens de buis op 500 g gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in één milliliter volledig medium.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Bereid vervolgens het cultuurgerecht en voeg cultuurmedium toe. Plaats de cellen opnieuw met een dichtheid van 10 tot de vierde cellen per vierkante centimeter in vijf milliliter verse volledige DMEM en was de cellen met volledige DMEM voordat elke media vervangt.Na het bereiken van 70 tot 80% confluentie, herhaal trypsinisatie en zaad vijf keer 10 tot de derde astrocyten op een zeven millimeter poly-L-lysine-gecoate cirkelvormige glazen afdekslip. Laat ze 10 minuten hechten en voeg volledige DMEM toe. Gebruik ze in experimenten na 48 uur.Na het bereiden van de microgliale culturen, om microglia te bevorderen, laten de gliacellen confluent worden en verschijnen de microglia na 10 tot 15 dagen bovenop de astrocytenlaag. Schud de petrischaal op een orbitale shaker gedurende twee uur bij 220 RPM. Was nu de losgemaakte en losjes bevestigde cellen lichtjes door het supernatant aan te zuigen met een pipetpunt van één milliliter.Doseer het supernatant meerdere keren voorzichtig op de cellaag en zorg ervoor dat het hele oppervlak van de cellaag tijdens deze wasstap wordt bedekt. Verzamel het medium met de losgemaakte cellen en breng het over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer, resuspendeer en tel de cellen zoals eerder aangetoond.Zaai vijf keer 10 tot de derde microglia op een zeven millimeter poly-L-lysine-gecoate ronde glazen afdekslip. Laat ze 10 minuten hechten en voeg volledige DMEM toe. Gebruik ze in experimenten na 48 uur.Om de volledige DMEM uit te wassen, brengt u één afdekslip over op een schaal met extracellulaire oplossing. Bereid de kleurstofbelastingsoplossing door één millimol Fluo-4 AM te verdunnen met extracellulaire oplossing om de uiteindelijke concentratie van vijf micromolair te bereiken. Plaats de afdekslip met cellen in de kleurstoflaadoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker en was de cellen gedurende 20 minuten in extracellulaire oplossing.Plaats de afdeksel in de opnamekamer met één milliliter werkoplossing. Kies het gezichtsveld met een consistent aantal cellen in het hele experiment. Start de beeldvorming en bepaal de basislijn door het basale niveau van fluorescentie gedurende drie tot vijf minuten te verkrijgen.Stop vervolgens de stroom van de werkoplossing en schakel over naar de testoplossing voor de gewenste tijdsduur. Was de cellen tussen elke testoplossing met een constante stroom van de werkoplossing gedurende drie tot vijf minuten. Houd het oplossingsvolume in de opnamekamer op één milliliter door een constante zuigkracht van de bovenkant van de oplossing te regelen.Kies het frame met de hoogste signaalintensiteit en omcirkel één cel met de gereedschapstoepassing Veelhoekig. Nadat u alle cellen in het verkregen veld hebt omcirkeld, kiest u vijf interessante gebieden op de achtergrond met het gereedschap Cirkel. Meet vervolgens de gemiddelde signaalintensiteit van een enkele cel en de achtergrond voor elk tijdsbestek.Selecteer alle interessante regio's en gebruik de opdracht Multi-Measure in ROI Manager in ImageJ of een gelijkwaardige opdracht in commerciële software. Na het importeren van de gegevens in MATLAB-software, gemiddeld vijf achtergrond-ROI's en de gemiddelde achtergrond van elk frame aftrekken van de gemiddelde ROI-intensiteit van de frames die tegelijkertijd zijn verkregen. Analyseer later de calciumactiviteit door de amplitude van de calciumpiek te bepalen, de geïntegreerde verandering van de calciumtransiënt, de tijd tot piek, de stijgtijd, de halve breedte en de frequentie.GFAP wordt gebruikt om astrocyten te visualiseren en Iba1 om microglia te visualiseren. hSOD1G93A astrocyten reageren op ALS immunoglobuline G met een grotere amplitude van de calciumtransiënt, een grotere algehele geïntegreerde verandering en een kortere tijd om te pieken dan niet-transgene astrocyten. De respons op ALS immunoglobuline G is te onderscheiden van de respons op ATP.hSOD1G93A astrocyten hadden een hoger niveau van calciumionen in de winkels, zoals onthuld door uitputting van de opslag, wat wijst op een overbelasting van dit ion. Microglia werden gekweekt en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd in de loop van de tijd geëxtraheerd. De calciumsporen van drie cellen gaven aan dat slechts één cel reageerde op ALS-immunoglobuline G, terwijl alle cellen reageerden op ATP.De pseudo-kleurenbeelden vertegenwoordigden de fluorescentie-intensiteit en baseline als reactie op ALS, IgG en ATP. De cellen moeten adequaat worden geladen en de parameters van het beeldvormingssysteem moeten op de juiste manier worden aangepast, zodat het signaal tijdens het experiment niet wordt gescheiden. Samen met calciumuitstotend kan patchklem worden uitgevoerd.Zo kan een completer beeld worden verkregen van de correlatie tussen verschillende membraanionstromen en calciumuitstotende. Het begrip van intracellulaire calciumhomeostase is van essentieel belang voor de verkenning van verschillende reacties op natuurlijke en stressvolle en externe stimuli.

primary-cultures-rat-astrocytes-microglia-their-use-study-amyotrophic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier hebben we een protocol voor het kweken van rat corticale neuronen in de aanwezigheid van een gliale feeder-laag. De gekweekte neuronen tot stand polariteit en creëren synapsen, en kan gescheiden worden van de glia voor gebruik in diverse toepassingen, zoals electrofysiologie, calcium imaging, overleving van de cel assays, immunocytochemie, en RNA / DNA / eiwit isolatie.

Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

The video demonstrates a technique for culturing primary astrocytes from the rat cortex. The cortex is mechanically dissociated to obtain a homogeneous glial cell suspension, which is then plated on polypeptide-coated plates to promote selective proliferation of astrocytes. Subsequently, the astrocytes are enzymatically dissociated from the plates and transferred to fresh media, allowing the culture of pure astrocytes.

Generating a Primary Culture of Astrocytes from a Rat Pup Brain

This video demonstrates a method for isolating and culturing microglia from rat brains. It entails separating microglia from other neuronal and non-neuronal cells using plates coated with a monoclonal antibody specific to microglia.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free Media

Astrocyten zijn erkend als veelzijdige cellen die deelnemen in de fundamentele biologische processen die essentieel zijn voor de normale ontwikkeling van de hersenen en functies binnen het centraal zenuwstelsel repareren. Hier presenteren we een snelle procedure voor pure muis astrocyten culturen te verkrijgen om de biologie van deze belangrijke klasse van het centrale zenuwstelsel cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Corticale Astrocyten

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

Het AWESAM protocol beschreven hier is optimaal voor het kweken van lymfkliertest astrocyten los van andere hersencellen in een snelle, eenvoudige en goedkope manier. AWESAM astrocyten vertonen spontane Ca2 + signalering, morfologie en gene expressieprofielen vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.

Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

We beschrijven een methode voor het differentiëren van door het ruggenmerg geïnduceerde pluripotent-afgeleide astrocyten en neuronen en hun co-cultuur voor elektrofysiologische registratie.

Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal specifieke menselijke pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Leer primaire culturen van rat astrocyten en microglia voor onderzoek naar amyotrofische laterale sclerose. Deze methode onthult calciumsignalering en ondersteunt studies naar neuroinflammatie.

Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

Meer video's verkennen